一种提高玉米开花期抗旱性的DNA分子及其相关生物材料与应用

一种提高玉米开花期抗旱性的dna分子及其相关生物材料与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域中一种提高玉米开花期抗旱性的dna分子及其相关生物材料与应用。


背景技术：

2.世界范围内，玉米产量易受干旱影响。玉米雌穗与雄穗生长在茎的不同位置，当其生长受到干旱胁迫时，散粉-吐丝间隔时间(anthesis-silking interval，asi)会显著增大，导致雌穗无法正常授粉，结实率大幅下降。因此，玉米花期干旱环境下asi的增大是导致玉米减产的重要原因。挖掘干旱环境下减少玉米asi的关键基因，对提高干旱环境下玉米的产量是至关重要的。
3.传统的育种技术具有周期长、盲目性高和工作量大等缺点。近年来，随着植物遗传学的发展以及测序技术的普及，通过植物群体找到关键基因并用基因工程的方法向植物中导入抗逆相关基因来提高作物的抗逆性已经变得日趋成熟。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何提高干旱环境下的玉米产量。
5.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种dna分子，包括α-expansin4基因，以及驱动α-expansin4基因表达的干旱诱导型启动子；所述α-expansin4基因编码如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
6.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
7.a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与散粉-吐丝间隔时间相关的蛋白质；
8.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
9.所述dna分子优选由所述α-expansin4基因与所述干旱诱导型启动子连接而成。
10.其中，序列表中的序列1由268个氨基酸残基组成。
11.上述dna分子中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
12.上述dna分子中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
13.上述dna分子中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio
分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
14.上述dna分子中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
15.上述dna分子中，所述α-expansin4基因为如下b1)或b2)所示的基因：
16.b1)编码链的编码序列(cds)是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子；
17.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子。
18.其中，序列表中的序列2由1231个核苷酸组成，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。序列表中的序列2的第1-152位为5’非编码区，第153-959位为编码序列，第960-1321位为3’非编码区。
19.上述dna分子中，所述干旱诱导型启动子可为已知的植物干旱诱导型启动子，具体可为启动子zm00001d039566，所述启动子zm00001d039566的核苷酸序列为序列表中序列4。
20.本发明还提供与所述的dna分子相关的生物材料。
21.本发明所提供的与所述的dna分子相关的生物材料，为下述c1)至c6)中的任一种：
22.c1)含有所述dna分子的表达盒；
23.c2)含有所述dna分子的重组载体、或含有c1)所述表达盒的重组载体；
24.c3)含有所述dna分子的重组微生物、或含有c1)所述表达盒的重组微生物、或含有c2)所述重组载体的重组微生物；
25.c4)含有所述dna分子的转基因植物细胞系、或含有c1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
26.c5)含有所述dna分子的转基因植物组织、或含有c1)所述表达盒的转基因植物组织；
27.c6)含有所述dna分子的转基因植物器官、或含有c1)所述表达盒的转基因植物器官。
28.上述生物材料中，c2)所述重组载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如prokii、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)、组成型启动子、诱导型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自
转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
29.本发明还保护所述α-expansin4基因编码的蛋白质α-expansin4，其为如下a1)、a2)或a3)：
30.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
31.a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与散粉-吐丝间隔时间相关的蛋白质；
32.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
33.本发明还保护所述α-expansin4基因，其为如下b1)或b2)所示的基因：
34.b1)编码链的编码序列(cds)是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子；
35.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子。
36.本发明还提供所述的dna分子、或所述的生物材料、或所述的蛋白质α-expansin4、或所述的α-expansin4基因在调控干旱胁迫下玉米散粉-吐丝间隔时间中的应用。所述调控干旱胁迫下玉米散粉-吐丝间隔时间可为缩短散粉-吐丝间隔时间。
37.本发明还提供所述的dna分子、或所述的生物材料、或所述的蛋白质α-expansin4、或所述的α-expansin4基因在提高玉米抗旱性中的应用。
38.本发明还提供一种提高玉米开花期抗旱性的方法，包括在受体玉米中导入所述的dna分子，得到开花期抗旱性强于受体玉米的抗旱玉米。
39.本发明还提供一种缩短玉米散粉-吐丝间隔时间的方法，包括在受体玉米中导入所述的dna分子，得到与所述受体玉米相比散粉-吐丝间隔时间缩短的玉米实现玉米散粉-吐丝间隔时间的缩短。
40.本发明还提供一种培育散粉-吐丝间隔时间缩短玉米的方法，包括向受体玉米中导入所述的dna分子，得到与所述受体玉米相比散粉-吐丝间隔时间缩短的玉米。
41.所述受体玉米可为不含所述dna分子的玉米。
42.上述方法中，所述抗旱玉米可为转基因玉米，也可为通过杂交等常规育种技术获得的玉米。
43.上述方法中，其中所述dna分子可先进行如下修饰，再导入受体玉米中，以达到更好的表达效果：
44.1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
45.2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多
启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
46.3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
47.4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。
48.所述的dna分子可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，method for plant molecular biology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plantmolecularbiology(2nd edition)。
49.为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗旱剂。
50.本发明所提供的植物抗旱剂含有所述dna分子或/和所述dna分子相关的生物材料或/和所述蛋白质α-expansin4。
51.上述植物抗旱剂的活性成分可为所述dna分子或/和所述dna分子相关的生物材料或/和所述蛋白质α-expansin4，上述植物抗旱剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物抗旱剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗旱效果确定。
52.将α-expansin4基因分别与两种启动子基因一起导入玉米的转基因实验证明，由干旱诱导型启动子驱动表达α-expansin4基因的转基因玉米与受体玉米相比，在干旱胁迫下的散粉-吐丝间隔时间显著缩短，提高了籽粒结实率，从而提升了玉米产量，得到抗旱性显著提高的转基因玉米，说明包括α-expansin4基因和驱动其表达的干旱诱导型启动子的dna分子可用于提高玉米对干旱胁迫的抗性。
附图说明
53.图1为本发明预实验正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下雌穗和雄穗的生长的发育图。图1的a图为正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下的土壤含水量(swc)折线图；图1的b图为v5-v12期正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下的雄穗长度折线图；图1的c图为v5-v12期正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下的雄穗的显微观察照片，其中v5-v9照片中的标尺长度为250um，v10-v12照片中的标尺长度为1cm；图1的d图为v9-v14期正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下的雌穗长度折线图，图1的e图为v9-v14期ww和ws下的雌穗的显微观察照片，其中v9-v11照片中的标尺长度为250um，v12-v14照片中的标尺长度为1mm。
54.图2为本发明预实验中b73雌穗材料的转录图谱的构建图。图2的a图为4种水分梯度下土壤的含水量折线图。图2的b图为在4种水分梯度下5种长度雌穗的取样时间。图2的c图为5-50mm基因表达的韦恩图。图2的d图为各个发育阶段高表达的基因的分组。图2的e图和图2的f图为阶段特异表达基因和发育阶段高表达基因的go分析。
55.图3为本发明预实验中b73在不同水分梯度下的植株表型与分析结果。图3的a图为旱棚和滴灌系统照片。b图为4种水分梯度(ww、ws1、ws2、ws3)下植株群体的形态，图3的c图为4种水分梯度(ww、ws1、ws2、ws3)下单个植株的形态。图3的d图为2种水分梯度(ww和ws3)
下植株群体上端叶片的形态，图3的e图为2种水分梯度(ww和ws3)下单个植株上端叶片的形态。图3的f图为4个水分梯度下植株株高的统计柱状图，图3的g图为4个水分梯度下百粒重的统计柱状图，图3的h图为4个水分梯度下单穗粒数的统计柱状图。图3的i图为4个水分梯度下收获的雌穗照片。图3的j图为植株asi与土壤含水量的相关性分析图。图3的k图为单穗产量与土壤含水量的相关性分析图。
56.图4为本发明预实验中干旱抑制50mm雌穗基因的表达分析图。图4的a图为50mm雌穗阶段特异表达和阶段高表达基因的干旱响应分析图。图4的b图为50mm雌穗中表达的saur基因的干旱响应分析图。图4的c图为催化细胞壁前体物合成的相关基因受到干旱下调的分析图。图4的d图为50mm雌穗中表达的扩张蛋白基因，水通道蛋白基因，木葡聚糖内糖基转移酶基因(xet)等的干旱响应结果图。
57.图5为本发明预实验中3个地区228份自交系材料干旱胁迫下的表型分析。图5的a图为2016-2018年ww和ws下平均土壤含水量折线图。图5的b图为228份自然变异群体开花性状的统计分析表。图5的c图为2016-2018年正常浇水(ww)环境下开花时间表型的相关性分析图，图5的d图为2016-2018年干旱(ws)环境下开花时间表型的相关性分析图。
58.图6为本发明预实验中α-expansin4基因与干旱下asi的关联性分析图。图6的a图为α-expansin4基因与干旱下asi显著关联和α-expansin4基因的dna多样性的ld图。图6的b图为α-expansin4基因的ws/ww表达量与干旱下的asi的相关性分析图。图6的c图为snp1875两个基因型的α-expansin4基因的ws/ww表达量图。
59.图7为本发明实施例1中构建载体选取的两个启动子基因在各个组织部位的表达量。图7的a图为zm00001d039566基因在各个组织部位的表达量柱状图。图7的b图为zm00001d045478基因在各个组织部位的表达量柱状图。图7的c图为两个启动子基因在4个水分梯度下的表达量。
60.图8为本发明实施例1中α-expansin4转基因玉米材料的获得和表型分析。图8的a图为构建载体选取的两种启动子基因雌穗中的表达量。图8的b图为两种启动子的转α-expansin4基因载体的构建图。图8的c图为转566pro:exp4a的转基因材料和对照在正常浇水和干旱胁迫下α-expansin4基因表达量。图8的d图为转478pro:exp4a的转基因材料和对照在正常浇水下α-expansin4基因表达量。图8的e图为α-expansin4转基因玉米材料和对照在正常浇水下的asi。图8的f图为α-expansin4转基因玉米材料和对照在干旱胁迫下的植株株高。图8的g图为α-expansin4转基因玉米材料和对照在干旱胁迫下的asi。图8的h图为α-expansin4转基因玉米材料和对照在干旱胁迫下的植株株高。
61.图9为本发明实施例1中转566pro:exp4a的转基因材料的asi表型观察。图9的a图为转566pro:exp4a的转基因材料566pro-1(图中标为566pro-oe1)、566pro-2(图中标为566pro-oe2)和对照(wt)散粉吐丝观察照片。图9的b图为转566pro:exp4a的转基因材料雌穗在干旱胁迫下易从苞叶中长出的照片。
具体实施方式
62.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
63.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
64.1载体
65.下述实施例中，载体pcm3300m记载在非专利文献“liu,s.,li,c.,wang,h.,wang,s.,yang,s.,liu,x.,yan,j.,li,b.,beatty,m.,zastrow-hayes,g.,song,s.,and qin,f.(2020).mapping regulatory variants controlling gene expression in drought response and tolerance in maize.genome biology 21,163”中，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
66.2菌株
67.下述实施例中，根癌农杆菌eha105属于根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)，记载在非专利文献“liu,s.,li,c.,wang,h.,wang,s.,yang,s.,liu,x.,yan,j.,li,b.,beatty,m.,zastrow-hayes,g.,song,s.,and qin,f.(2020).mapping regulatory variants controlling gene expression in drought response and tolerance in maize.genome biology 21,163”中，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
68.3玉米品系
69.下述实施例中，玉米自交系b73记载于非专利文献“schnable,p.s.et al(2009)the b73 maize genome:complexity,diversity,and dynamics.science 326,1112-1115”中。公众可以从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
70.下述实施例中，玉米转基因材料lh244(又称b73-329)记载于非专利文献“liu,s.,li,c.,wang,h.,wang,s.,yang,s.,liu,x.,yan,j.,li,b.,beatty,m.,zastrow-hayes,g.,song,s.,and qin,f.(2020).mapping regulatory variants controlling gene expression in drought response and tolerance in maize.genome biology 21,163”中，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
71.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna的3
′
末端核苷酸。
72.下述实施例中的所有数据均采用t-test和fisher’s exact test进行显著性分析。
73.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
74.预实验、确定α-expansin4基因调控玉米asi
75.①
干旱显著推迟雌穗发育
76.北京旱棚种植b73自交系，进行如下两种处理：
77.正常浇水(编号ww)：v5期(第五叶完全展开)后维持土壤含水量35％-50％。
78.干旱胁迫(编号ws)：v5期后维持土壤含水量约为20％。
79.正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)下土壤含水量(swc)具体测定结果见图1的a图。
80.对播种后36天到72天的雌雄穗进行显微观察，结果如下：雄穗长度变化见图1中的b图，雄穗的显微照片见图1中的c图，从起始分生组织到花器官的形成，除了v9(第九叶完全
展开)-v11期(第十一叶完全展开)干旱胁迫(ws)下的雄穗有些许生长迟缓外，其余发育阶段雄穗的形态和长度在正常浇水(ww)和干旱胁迫(ws)之间没有明显的差异；雌穗长度变化见图1中的d图，雌穗的显微照片见图1中的e图，雌穗的形态和长度受干旱的影响明显，虽然在干旱胁迫(ws)下雌穗依然能形成正常的花器官的结构，但从起始分生组织开始雌穗的生长在干旱胁迫(ws)下就存在明显的推迟现象，如：v10期(第十叶完全展开)干旱胁迫(ws)下雌穗的长度和发育阶段与v9期正常浇水下雌穗相似；v14期(第十四叶完全展开)正常浇水下雌穗的花丝长度大约40mm，而v14期干旱胁迫下雌穗的花丝才仅仅肉眼可见。
81.②
4种水分梯度5种长度的b73雌穗材料的转录图谱的构建
82.在北京香山旱棚种植4种水分梯度下的玉米自交系材料b73，实验设计了差异浇水，从播种后29天开始设置4种水分梯度，控制播种后46天(v9期)至的播种后69天土壤水分含量符合如下要求：ww(正常浇水,swc为35％-40％)，ws1(轻度干旱,swc为25％-35％)，ws2(中度干旱,swc为20％-30％)，ws3(重度干旱,swc为15％-25％)。具体4种水分梯度土壤的含水量(swc)测定结果见图2的a图。
83.对5mm、10mm、15mm、20mm、50mm 5种长度的雌穗进行取样，取样时间见图2的b图。对所取样本提取rna，并双端测序。用illumina hiseq4000平台进行测序，产生双端150bp高质量的reads(q30》86％)。每个雌穗样本点包括至少3个雌穗材料和2个生物学重复，每个样品平均产生54,595,773对高质量的双端测序的reads，从网址http://plants.ensembl.org/zea_mays/info/index下载b73参考基因组(b73_refgen_v4.38)。illumina测序数据用软件hisat2-v2.1.0比对到b73参考基因组上，参数为默认设置。得到的bam文件输入到stringtie-v1.3.4d软件并用r(version 3.5.3，rfoundation for statistical computin，http://www.r-project.org)内统计包ballgown(v3.8)计算各个基因的表达量fpkm(fragments per kilobase oftranscriptper million fragments mapped)值。对20个雌穗样本进行基因表达量和转录本的主成分分析(principal component analysis，pca)，分析显示，20个样本按4个发育阶段明显的划分为小穗分化期(5mm)，小花分化期(10-15mm)，花器官成熟期(20mm)和花丝伸长期(50mm)四类。因此我们将10mm和15mm雌穗材料的转录组数据合并，并在后续的分析中记作10mm。
84.首先关注正常浇水下各发育阶段特异表达(ssgs)和高表达的基因(shgs)。在正常浇水下，有21,420基因，20,910基因，20,777基因和21,718基因分别在5mm、10mm、20mm、50mm的雌穗中表达(fpkm≥1)。venn图显示雌穗各发育阶段特异表达的基因分别为：5mm雌穗有390个基因，10mm雌穗有221个基因，20mm雌穗有114个基因，50mm雌穗有971个基因(图2的c图和图2的e图)。我们将21,641个非发育阶段特异表达的基因以z-score》0.5的标准筛选各发育阶段高表达的基因，heatmap分析分别得到5mm高表达的基因7,156个，10mm有7,155个，20mm有6,028个，50mm有7359个(图2的d图、图2的e图、图2的f图)。
85.③
4种水分梯度下b73材料的表型观察
86.利用旱棚和滴灌系统(图3的a图)设置不同水分处理，v9期的植株出现了矮化和叶卷曲的现象，4种水分梯度(ww、ws1、ws2、ws3，具体标准参照
②
中的标准)处理的植株照片见图3的b图和图3的c图，图3的d图和图3的e图。图3显示，自然授粉条件下，asi和产量的表型数据表明随着干旱程度的加深，单穗粒数显著降低，而百粒重在干旱下无显著差异(图3的f图-图3的h图)。这也暗示了b73自交系材料，结实率相较于灌浆更易受干旱胁迫的影响。asi
的统计结果显示，在ww下，b73材料的asi约为1-2天，而ws3下则增加到4-5天。相关性分析显示，土壤含水量和产量也显著正相关(r＝0.9，p-value＝1.84e-6)，但与asi之间存在显著负相关(r＝0.89，p-value＝4.66e-6)(图3的i图-图3的k图)。综上所述，干旱增大asi导致减小籽粒结实率，从而直接影响玉米产量。
87.④
50mm雌穗特异表达和高表达基因的干旱响应
88.为了简化各个基因在ww、ws1、ws2、ws3条件下的表达模式，定义ws1、ws2、ws3下表达量皆高于ww下的表达量的基因为干旱上调基因，而ws1、ws2、ws3下表达量皆低于ww下的表达量的基因为干旱下调基因。
89.50mm雌穗发育阶段特异表达和高表达的基因共有8330个(特异表达基因971个，和高表达基因7359个，图2的c图，图2的d图)，其中表达量受干旱胁迫影响的(包括上调和下调)的基因共有5899个，占该发育阶段特异表达和高表达基因的71％。其中，4876个受干旱胁迫下调，占总数的59％；1023个受干旱上调，占总数的12％(图4的a图)。go分析显示，50mm雌穗的干旱下调基因主要参与生长素调节信号途径，光合作用，细胞壁和膜系统等生物过程(图4的a图、图4的b图和图4的c图)。
90.转录组数据在50mm雌穗中也发现扩张蛋白基因，水通道蛋白基因，木葡聚糖内糖基转移酶基因等与细胞的伸长和细胞生长有关的基因干旱胁迫下下调。在玉米中，共有108个扩张蛋白和34个木葡聚糖内糖基转移酶与拟南芥同源。其中，50mm雌穗中表达的扩张蛋白基因有34个，25个受干旱下调；50mm雌穗中表达的木葡聚糖内糖基转移酶基因有18个，11个受干旱下调(图4的d图)。fisher精确检验对下调的扩张蛋白基因和木葡聚糖内糖基转移酶基因进行显著性分析，两类蛋白均显著富集(p＝1.54e-05和p＝3.19e-2)。以上结果显示，下调的扩张蛋白和木葡聚糖内糖基转移酶很可能减少细胞壁的延伸，减缓细胞伸长或细胞生长。在50mm雌穗中与拟南芥同源的水通道蛋白共有22个，其中16个基因下调且极显著富集(p＝6.92e-5)(图4的d图)。
91.⑤
玉米干旱asi候选基因关联分析
92.对2016到2018年正常浇水和干旱胁迫下228份玉米自交系材料进行了吐丝时间和散粉时间的表型统计。为避免生长条件的不同带来的表型差异，挑选的228份玉米自交系材料有着相似的开花时间，且大部分为温带材料，228份玉米自交系材料记载在文献“liu,h.,luo,x.,niu,l.,xiao,y.,chen,l.,liu,j.,wang,x.,jin,m.,li,w.,zhang,q.,andyan,j.(2017).distant eqtls and non-coding sequences play critical roles in regulating gene expression and quantitative traitvariation in maize.molecularplant 10,414-426.”中。
93.2016年在中国科学院植物研究所分子育种香山基地种植所选的228份自交系材料，种植水区2个重复，种植旱区2个重复；2017年在新疆农业大学三坪农场种植所选的228份自交系材料，水区种植2个重复，旱区种植2个重复；2018年在新疆农业科学院综合实验场种植所选的228份自交系材料，水区种植2个重复，旱区种植3个重复。
94.水区即正常浇水的处理区，表示为ww，土壤含水量维持在35％以上。旱区即干旱胁迫的处理区，表示为ws，土壤含水量从v9期(第九叶完全展开)开始维持在25％以下(图5的a图)。
95.对3个地区不同水分处理环境下的植株表型数据进行统计分析，统计分析了asi，
并计算了遗传力，结果见图5。对228份自交系群体的wsasi数据也进行了候选基因的关联分析，候选基因为rna-seq分析出的50mm雌穗中干旱胁迫下调的xets，水通道蛋白，扩张蛋白，细胞壁前体合成酶和光系统中的蛋白等104个基因。其中，100个基因中共找到snp位点2,709个，平均每个基因27个位点。用混合线性模型(mlm)计算变异位点与wsasi表型的相关性，结果显示，在α-expansin4基因(zm00001d034663)起始密码子下游1875bp处的snp位点snp1875与asi表型显著相关(p＝3.5e-4)。确定α-expansin4基因(简写exp4a)调控玉米asi(见图6)。
96.序列表中序列2所示的即为α-expansin4基因的cdna序列，共1231bp，其中第1-152位为5’非编码区，第153-959位为编码序列，第960-1321位为3’非编码区。α-expansin4基因编码的蛋白质为α-expansin4，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
97.实施例1、α-expansin4转基因材料的获得与功能的验证
98.一、α-expansin4转基因材料的获得
99.1、α-expansin4基因的克隆
100.取b73材料种子，28℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到营养土或营养液中培养至v2期，取叶片于液氮中速冻、研磨，提取总rna，进行反转录，获得cdna，以该cdna为模板，引物exp4a-xho i-f和exp4a-mtag-kpni-r为引物进行pcr扩增。exp4a-xho i-f为在起始密码子atg前加xho i酶切位点，exp4a-mtag-kpn i-r为在终止密码子的编码序列前加myc标记的编码序列，在终止密码子的编码序列后加kpn i酶切位点。
101.引物序列如下：
102.exp4a-xho i-f:5
’-
ccgctcgagatggcggcaatgccggcgccg-3’(下划线指示的序列为xho i酶识别位点序列)；
103.exp4a-mtag-kpn i-r:r:r:(单波浪线指示的序列为kpn i酶识别位点序列，双下划线指示的是终止密码子的编码序列，双波浪线指示的序列为myc标记的编码序列)。
104.将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到854bp的pcr扩增产物。经过测序，扩增产物核苷酸序列如序列表中序列3所示。
105.2、雌穗中驱动α-expansin4转基因干旱诱导表达的启动子的筛选和克隆
106.2.1、启动子zm00001d039566为雌穗干旱诱导型启动子，该基因在50mm雌穗的ws3的表达量是ww表达量的22倍，且该基因主要在分生组织中表达(图7的a图和图7的c图)。
107.以b73 gdna为模板，引物566pro-xba i-f和566pro-xho i-r为引物进行pcr扩增。引物序列如下：
108.566pro-xba i-f:(加粗下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)；
109.566pro-xho i-r:(虚线下划线指示的序列为xho i酶识别位点序列)。
110.扩增产物为启动子zm00001d039566的起始密码子atg上游1854bp的启动子区(其核苷酸序列如序列表中序列4所示)两端添加酶切位点xba i和xho i的识别序列。将扩增产
物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到1871bp的pcr扩增产物，命名为566pro。
111.2.2、zm00001d045478基因启动子为雌穗高表达启动子，且该基因主要在雌穗中表达(图7的b图和图7的c图)。
112.以b73 gdna为模板，引物478pro-xba i-f和478pro-xho i-r为引物进行pcr扩增。引物序列如下：
113.478pro-xba i-f:(加粗下划线指示的序列为xbai酶识别位点序列)；
114.478pro-xho i-r:(虚线下划线指示的序列为xho i酶识别位点序列)。
115.扩增产物为在zm00001d045478基因起始密码子atg上游1910bp的启动子区(其核苷酸序列如序列表中序列5所示)两端添加酶切位点xba i和xho i的识别序列。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到1927bp的pcr扩增产物，命名为478pro。
116.3、α-expansin4转基因载体的构建
117.将α-expansin4基因的编码序列(序列表中序列2的第153-959位)终止密码子tag前添加myc标记，并在序列两端添加酶切位点xho i和kpn i的识别序列。然后进行xho i和kpn i双酶切，酶切产物与经同样双酶切的pcm3300m载体骨架大片段相连，得到的重组载体定名为pcm3300m-exp4a。
118.将2.1中得到的启动子区产物566pro，进行xba i和xho i双酶切，酶切产物与经同样双酶切的pcm3300m-exp4a载体骨架大片段相连，得到的重组载体命名为pcm3300m-566pro:exp4a(结构参见图8的b图中的上侧)。
119.将2.2中得到的启动子区产物478pro，进行xba i和xho i双酶切，酶切产物与经同样双酶切的pcm3300m-exp4a载体骨架大片段相连，得到的重组载体命名为pcm3300m-478pro:exp4a(结构参见图8的b图中的下侧)。
120.4、转α-expansin4基因lh244玉米材料的获得
121.4.1、将重组载体pcm3300m-566pro:exp4a转化根瘤农杆菌eah105菌株，获得含有重组载体pcm3300m-566pro:exp4a的重组农杆菌(提取质粒，测序验证，确定该重组农杆菌为阳性克隆)。
122.将含有重组载体pcm3300m-566pro:exp4a的重组农杆菌用农杆菌介导的玉米遗传稳定转化法转化玉米lh244材料，得到12株t0代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)。提取t0代转α-expansin4玉米叶片dna，用特异引物m13f(-47)和566pro-r扩增进行pcr鉴定，得到阳性t0代转α-expansin4玉米3株。
123.引物的序列如下：
124.m13f(-47):5
’-
cgccagggttttcccagtcacgac-3’；
125.566pro-r:5
’-
ccgctcgagctctcgctctcgctaccg-3’。
126.阳性t0代转α-expansin4玉米植株自交后获得t1代种子；t1代植株再用同样的方法pcr鉴定后获得阳性植株。阳性植株自交收获后，每穗取24粒萌发后用同样pcr方法鉴定是否为转基因阳性植株。全部24株为阳性的t2代株系，即为566pro:exp4a t2代转基因纯合株系。对纯合株系进行繁种获得t3代种子用于后续的干旱表型试验，其中两个株系，分别记
为566pro-1和566pro-2。
127.4.2、将重组载体pcm3300m-478pro:exp4a转化根瘤农杆菌eah105菌株，获得含有重组载体pcm3300m-478pro:exp4a的重组农杆菌(提取质粒，测序验证，确定该重组农杆菌为阳性克隆)。
128.将含有重组载体pcm3300m-478pro:exp4a的重组农杆菌用农杆菌介导的玉米遗传稳定转化法转化玉米lh244材料，得到13株t0代植株，并种植于温室(16h-光照/8h-黑暗)。提取t0代转α-expansin4玉米叶片dna，用特异引物m13f(-47)和478pro-r扩增进行pcr鉴定，得到阳性t0代转α-expansin4玉米3株。
129.引物的序列如下：
130.m13f(-47):5
’-
cgccagggttttcccagtcacgac-3’；
131.478pro-r:5
’-
ttcataaaccaacgccaaag-3’。
132.阳性t0代转α-expansin4玉米植株自交后获得t1代种子；t1代植株再用同样的方法pcr鉴定后获得阳性植株，阳性植株自交收获后，每穗取24粒萌发后用同样pcr方法鉴定是否为转基因阳性植株。全部24株为阳性的t2代株系，即为转478pro:exp4a的转基因t2代纯合株系。对纯合株系进行繁种获得t3代种子用于后续的干旱表型试验，其中两个株系，分别记为478pro-1和478pro-2。
133.4.3、提取t3代转α-expansin4玉米(4.1中获得的566pro-1和566pro-2，4.2中获得的478pro-1和478pro-2)雌穗的rna，反转录得到cdna，用特异引物exp4a_qpcr-f和exp4a_qpcr-r对基因α-expansin4的cdna进行qpcr定量检测，以玉米的基因zmubi2为内参，引物为zmubi-2_qrtpcr-f和zmubi-2_qrtpcr-r，以lh244为对照。
134.expa_qpcr-f:5
’-
cgagatcaggtgcgaggagc-3’；
135.exp4a_qpcr-r:5
’-
ttggcgggcagaagttgg-3’；
136.zmubi-2_qrtpcr-f:5
’-
tggttgtggcttcgttggtt-3’；
137.zmubi-2_qrtpcr-r:5
’-
gctgcagaagagttttgggtaca-3’。
138.结果如图8的c图和图8的d图所示，t3代转α-expansin4玉米转基因材料(566pro-1、566pro-2、478pro-1、478pro-2)的α-expansin4表达量明显高于野生型lh244玉米(wt)，皆高出15倍以上，表明t3代转α-expansin4玉米为阳性转基因玉米。
139.二、α-expansin4转基因材料的功能研究
140.转α-expansin4玉米为t3代材料，具体为步骤一中4.1获得的转566pro:exp4a的转基因材料566pro-1、566pro-2，以及步骤一中4.2获得的转478pro:exp4a的转基因材料478pro-1和478pro-2。以野生型lh244(wt)为对照材料。在河北省涿州市农大科技园旱棚种植。进行如下两种处理：
141.正常浇水处理(ww)在整个生育期灌溉充足的水以确保玉米能够正常生长，其土壤含水量均值为35％；
142.干旱胁迫处理(ws)为播种后28天停止水分供应直至玉米收获，其土壤含水量均值为18％。
143.正常浇水下每个转基因材料种植2行，2个重复，共52株，干旱胁迫下每个转基因材料种植2行，3个重复，共78株。
144.在所有环境下，选择相同的表型评估标准，并进行后续的研究。定义一半长度的雄
穗主轴开始散份的日期为散份时间，花丝伸出苞叶3cm的日期为吐丝时间。asi为吐丝时间减去散份时间。对每个材料每个单株统计吐丝时间和散粉时间，并计算asi。株高统计为散份吐丝后植株的高度。
145.实验结果如下：
146.zm00001d039566启动子为在50mm雌穗中干旱诱导表达的基因的启动子区；zm00001d045478启动子为在50mm雌穗中高表达的基因的启动子区，两个基因在50mm雌穗中的表达量如图8的a图所示。
147.566pro-1和566pro-2在干旱胁迫下，表达量为正常对照wt表达量的20倍以上，说明转566pro:exp4a的转基因材料中干旱诱导α-expansin4基因的表达(图8的c图)。
148.在大田实验条件下，检测wt和566pro-1，566pro-2，478pro-1，478pro-2在干旱处理条件下的耐受性。结果如图8所示，正常浇水下，wt和566pro-1，566pro-2，478pro-1，478pro-2的asi(图8的e图)和株高(图8的f图)无显著差异；干旱胁迫下，wt和566pro-1，566pro-2，478pro-1，478pro-2的株高(图8的h图)无显著差异，但wt和566pro-1，566pro-2的asi(图8的g图)有显著差异，且566pro-1，566pro-2材料的asi减小2天左右。图9的a图可以看出，相同时间散粉的wt和566pro-1，566pro-2植株相比，566pro-1，566pro-2植株的雌穗已经开始吐丝，而wt植株还未见明显雌穗(拍照时间为播种后70天)。统计结果显示：566pro-1散粉时间为播种后65.8天，吐丝时间为69.8天；566pro-2散粉时间为播种后65.8天，吐丝时间为69.4天；对照材料散粉时间播种后65.7天，吐丝时间为71.4天。且566pro-1，566pro-2植株的雌穗和花丝易长出苞叶外(图9的b图)。
149.上述结果表明，在玉米材料中干旱诱导α-expansin4基因的表达，可以显著缩短asi，因而有可提高籽粒结实率，提高玉米在干旱胁迫下的产量，从而显著提高了玉米的抗旱性。说明包括α-expansin4基因和驱动其表达的干旱诱导型启动子的dna分子可用于提高玉米对干旱胁迫的抗性。
150.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种dna分子，其特征在于，所述dna分子包括α-expansin4基因，以及驱动α-expansin4基因表达的干旱诱导型启动子；所述α-expansin4基因编码如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与散粉-吐丝间隔时间相关的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的dna分子，其特征在于，所述α-expansin4基因为如下b1)或b2)所示的基因：b1)编码链的编码序列(cds)是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子；b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2第153-959位的cdna分子或dna分子。3.根据权利要求1或2所述的dna分子，其特征在于，所述干旱诱导型启动子为启动子zm00001d039566，所述启动子zm00001d039566的核苷酸序列为序列表中序列4。4.与权利要求1-3任一项所述的dna分子相关的生物材料，为下述为下述c1)至c6)中的任一种：c1)含有所述dna分子的表达盒；c2)含有所述dna分子的重组载体、或含有c1)所述表达盒的重组载体；c3)含有所述dna分子的重组微生物、或含有c1)所述表达盒的重组微生物、或含有c2)所述重组载体的重组微生物；c4)含有所述dna分子的转基因植物细胞系、或含有c1)所述表达盒的转基因植物细胞系；c5)含有所述dna分子的转基因植物组织、或含有c1)所述表达盒的转基因植物组织；c6)含有所述dna分子的转基因植物器官、或含有c1)所述表达盒的转基因植物器官。5.权利要求1中所述的α-expansin4基因编码的蛋白质。6.权利要求1中所述的α-expansin4基因。7.权利要求1-3任一项所述dna分子、或权利要求4所述的生物材料、或权利要求5所述的蛋白质、或权利要求6所述基因的如下d1或d2的应用：d1、在缩短干旱胁迫下玉米散粉-吐丝间隔时间中的应用；d2、在提高玉米抗旱性中的应用。8.一种提高玉米开花期抗旱性的方法，其特征在于：包括在受体玉米中导入权利要求1-3任一项所述的dna分子，得到开花期抗旱性强于受体玉米的抗旱玉米。9.一种缩短玉米散粉-吐丝间隔时间的方法，包括在受体玉米中导入权利要求1-3任一项所述的dna分子，得到与所述受体玉米相比散粉-吐丝间隔时间缩短的玉米实现玉米散粉-吐丝间隔时间的缩短。10.植物抗旱剂，其特征在于：所述植物抗旱剂含有权利要求1-3任一项所述的dna分子、或/和权利要求4所述的生物材料、或/和权利要求5所述的蛋白质。

技术总结
本发明公开了一种包括α-expansin4基因和驱动其表达的干旱诱导型启动子的DNA分子。由干旱诱导型启动子驱动表达α-expansin4基因的转基因玉米与受体玉米相比，在干旱胁迫下的散粉-吐丝间隔时间显著缩短，提高了籽粒结实率，从而提升了玉米产量，得到抗旱性显著提高的转基因玉米，说明包括α-expansin4基因和驱动其表达的干旱诱导型启动子的DNA分子可用于提高玉米对干旱胁迫的抗性。于提高玉米对干旱胁迫的抗性。


技术研发人员：秦峰 刘博欣 张彬 刘燕
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25