用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物、制备方法及应用

1.本发明涉及骨质疏松症药物领域。更具体地说，本发明涉及一种用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物、制备方法及应用。


背景技术：

2.骨质疏松症是一种全球常见的骨骼疾病，会影响骨骼的强度和结构。一般来说，它影响所有种族的女性和男性。当骨骼的密度和质量降低时，就会发生骨质疏松症，从而增加骨折的风险。这会使生活质量下降、骨折发病率增加，以及骨盆、髋部和脊柱骨折的死亡率增加。与其他疾病相比，骨质疏松症导致的健康和社会护理负担是巨大的(langdahl,br.j.pharmacol.178,2021；khosla et al.,lancet diabetes endocrinol.5,2017；lim and bolster,curr.opin.rheumatol.27,2015)。
3.糖皮质激素(glucocorticoids,gcs)已广泛用于治疗各种疾病，例如炎症和自身免疫性疾病。然而，由于破骨细胞和成骨细胞的生物活性不平衡，长期使用gcs会导致继发性骨质疏松症(vandewalle et al.,trends endocrinol.metab.29,2018；orayet al.,expert opin.drug saf.15,2016；spies et al.,best prac.res.clin.rheumatol.25,2011)。
4.天然药物自古以来就被用于治疗各种疾病。目前，天然药物已广泛用于治疗和预防骨质疏松症。它们受到了特别的关注，因为与化学合成药物相比，它们的副作用较少或没有(al.,annu.rep.med.chem.55,2020；an et al.,life sci.147,2016；whelan et al.,ann.pharmacother.40,2006)。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
6.本发明还有一个目的是提供一种用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物。
7.本发明再有一个目的是提供用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物的制备方法。
8.本发明另有一个目的是提供所述的克罗烷型二萜化合物的应用。
9.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了如下技术方案：
10.用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物，所述克罗烷型二萜化合物为具有式ⅰ所示结构的化合物：
[0011][0012]
优选的是，所述的用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物中，所述克罗烷型二萜化合物为式ⅰ所示的化合物的异构体、盐或溶剂化物，或在药物赋形剂、佐剂、载体或稀释剂中的共晶体。
[0013]
优选的是，所述的用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物中，所述骨质疏松症与糖皮质激素损伤相关。
[0014]
用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
步骤一、首先将小果荚髓苏木的干燥茎皮用甲醇浸提，减压浓缩后得到膏状提取物，将膏状提取物用水悬浮，之后用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，浓缩后获得乙酸乙酯萃取物，然后用硅胶柱色谱进行分离，获得多个主要组分；
[0016]
步骤二、所得多个主要组分用薄层色谱系统分析，选取在薄层系统rf值0.5处显示明显紫色斑点的组分，合并，得到化合物ⅰ的粗品；
[0017]
步骤三、将化合物ⅰ的粗品再次进行硅胶柱色谱进行细分，细分后用步骤二中的薄层色谱系统分析并再次确认化合物ⅰ为薄层系统rf值0.5处显示明显紫色斑点的组分，并再次收集组分；
[0018]
步骤四、纯化步骤三中再次收集的组分，得到化合物ⅰ的纯品。
[0019]
优选的是，所述的制备方法中，步骤一中，硅胶柱色谱采用二氯甲烷-甲醇为溶剂系统。
[0020]
优选的是，所述的制备方法中，步骤二和步骤三中，薄层色谱系统中，采用硅胶f254薄层板，用体积比75:25的正己烷：乙酸乙酯进行检识，展开后用香草醛对薄层板进行喷洒、加热显色。
[0021]
优选的是，所述的制备方法中，步骤三中，硅胶柱色谱采用正己烷-丙酮为洗脱系统。
[0022]
优选的是，所述的制备方法中，步骤四中，所述纯化包括：将再次收集组分经凝胶柱色谱进行去除杂质处理，最后用高效液相色谱进行纯化。
[0023]
所述的克罗烷型二萜化合物于制备用于骨质疏松症的药物或科学研究中的应用。
[0024]
优选的是，所述的应用中，所述骨质疏松症与糖皮质激素损伤相关。
[0025]
本发明至少包括以下有益效果：
[0026]
本发明的化合物ⅰ对糖皮质激素地塞米松(dex)诱导的成骨细胞凋亡具有显著的保护作用。化合物ⅰ的活性优于阳性对照京尼平苷(geniposide)。因此，化合物ⅰ具有拮抗糖皮质激素(gc)对成骨细胞(mc3t3-e1)的损伤的作用。化合物ⅰ具有预防和治疗骨质疏松症
的潜力。
[0027]
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例中化合物ⅰ对mc3t3-e1成骨细胞增殖的影响图。
[0029]
图2为本发明实施例中化合物ⅰ对mc3t3-e1成骨细胞碱性磷酸酶活性与矿化作用的影响。
具体实施方式
[0030]
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0031]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0032]
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0033]
天然化合物是多种疾病的良好治疗剂。文献中经常报道天然化合物增加成骨细胞增殖。在本发明中，从小果荚髓苏木(detariummicrocarpumguill.&perr.)的乙酸乙酯提取物中分离出一种新的克罗烷型二萜，6α-羟基-3,13e-克罗烷二双键-15-酸(6α-hydroxy-3,13e-clerodien-15-oic acid，ⅰ)，能够拮抗糖皮质激素对成骨细胞的损伤。因此，该化合物可能是预防和治疗糖皮质激素诱导的骨质疏松症的潜力药物。
[0034]
本发明从小果荚髓苏木(detariummicrocarpumguill.&perr.)的乙酸乙酯提取物中分离出一种新的克罗烷型二萜，6α-羟基-3,13e-克罗烷二双键-15-酸(6α-hydroxy-3,13e-clerodien-15-oic acid，ⅰ)。通过使用一维、二维核磁共振、高分辨电子轰击源质谱、红外、紫外光谱数据确定了新化合物ⅰ的结构。通过mtt法测定了化合物ⅰ对地塞米松(dex)诱导的成骨细胞凋亡的影响，随后通过流式细胞仪进一步验证，结果显示化合物ⅰ在0.008、0.04、0.2、1和5μm浓度下对地塞米松(dex)诱导的成骨细胞凋亡具有显著的保护作用。化合物ⅰ在剂量(1μm)仅为阳性对照京尼平苷(geniposide)剂量(10μm)十分之一时的活性仍优于京尼平苷，。因此，化合物ⅰ具有拮抗糖皮质激素(gc)对成骨细胞(mc3t3-e1)的损伤的作用。化合物ⅰ具有预防和治疗骨质疏松症的潜力。
[0035]
植物原材料
[0036]
小果荚髓苏木(detariummicrocarpumguill.&perr.)的茎皮于2017年8月采集于尼日利亚(nigeria)夸拉州(kwara state)伊洛林大学(university of ilorin)。该材料在尼日利亚林业研究所(forestry research institute of nigeria，frin)的伊巴丹森林植物标本馆(forest herbarium ibadan，fhi)进行了鉴定，并收集标本，编号为fhi 111953。
[0037]
提取与分离
[0038]
小果荚髓苏木的干燥茎皮粉碎后，用十倍量甲醇常温浸提，三天后过滤得提取液，更换甲醇，重复三次，所得提取液合并，减压浓缩后得到膏状提取物(无甲醇味)。将提取物用约与药材量等量的水悬浮，之后用同等体积的正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每种
溶剂重复3次，将乙酸乙酯层合并浓缩后获得乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物以少量甲醇溶解，萃取物干物质1.5倍量的硅胶拌样，干燥后，用硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇为溶剂系统)进行分离，获得17个主要组分。所得组分用硅胶f254薄层板，用正己烷：乙酸乙酯(75:25)进行检识，展开后用香草醛对薄层板进行喷洒、加热显色。化合物ⅰ在该薄层系统rf值0.5处显示明显紫色斑点。选取化合物ⅰ所在组份，合并后，再次进行硅胶柱色谱(正己烷-丙酮为洗脱系统)进行细分。细分后用上述薄层分析再次确认化合物ⅰ所在组分，收集后经lh-20型的凝胶柱色谱再次去除杂质，最后用制备型高效液相色谱进行纯化，得到化合物ⅰ的纯品。
[0039]
6α-羟基-3,13e-克罗烷二双键-15-酸(6α-hydroxy-3,13e-ene-clerodien-15oic acid,i)
[0040]
白色粉末；熔点121-123℃,ei-msm/z320.2[m]
+
；hr-ei-ms at m/z 320.2344[m]
+
(calcd.for 320.2351)；uv(meoh)λ
max
(logε)249(1.54)nm；ir(kbr)ν
max
(cm-1
):3638(o-h),2956(c-h),and 1692(c＝o)；1hnmr(cd3od,500mhz)(δ):h-1(1.61,overlapped),h-2(2.02,overlapped),h-3(5.18,brs),h-6(3.44,dd,j＝8.5,6.5hz),h-7(1.55,overlapped),h-8(1.63,overlapped),h-10(1.30,dd,j＝10.5,3.5hz),h-11(1.42,td,j＝12.5,5.0hz,1.53,overlapped),h-12(1.89,td,j＝12.5,5.0hz；2.00,overlapped),h-14(5.64,br s),h-16(2.10,d,j＝1.0hz),h-17(0.85,d,j＝6.5hz),h-18(1.80,br s),h-19(1.01,s),h-20(0.74,s)；
13
cnmr(cd3od,150mhz)(δ):c-1(19.0),c-2(27.7),c-3(122.7),c-4(145.6),c-5(45.2),c-6(76.4),c-7(38.8),c-8(35.9),c-9(39.6),c-10(47.0),c-11(37.9),c-12(35.2),c-13(159.8),c-14(118.2),c-15(171.6),c-16(19.0),c-17(16.0),c-18(22.8),c-19(15.7),c-20(18.3).
[0041]
细胞培养
[0042]
成骨细胞mc3t3-e1，编号crl-2593购自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)，在基本培养基α-mem(sigma)中培养，并在37℃和5％co2中补充fbs(10％)。京尼平苷(10μm)用作对照标准品。将化合物ⅰ溶解在dmso中，并稀释成0.008、0.04、0.2、1和5μm不同浓度的溶液。本发明中使用的地塞米松的浓度为1μm。
[0043]
细胞增殖实验
[0044]
通过mtt法研究化合物ⅰ对mc3t3-e1成骨细胞增殖的影响。具体做法为，将成骨细胞mc3t3-e1(1
×
103)接种在96孔板中并置于5％co2中。孵育一天后，分为正常组(正常细胞无处理)、模型组(地塞米松1μm损伤细胞)、阳性对照组(地塞米松1μm+京尼平苷10μm)、以及化合物ⅰ不同剂量组(地塞米松1μm分别加浓度为0.008、0.04、0.2、1和5μm化合物ⅰ)。孵育两天后，每孔加入mtt试剂(5mg/ml，pbs溶液)(22μl)，最终浓度为0.5mg/ml(200μl)。3小时后，除去培养基，每孔加入dmso以溶解甲臜结晶。通过酶标仪在540nm处读取吸光度。
[0045]
细胞凋亡检测
[0046]
mtt测定结果通过流式细胞仪进一步验证。具体做法为，将成骨细胞mc3t3-e1(1
×
106/ml)接种在6孔板中并置于5％co2中。孵育一天后，分为正常组(正常细胞无处理)、模型组(地塞米松1μm损伤细胞)、阳性对照组(地塞米松1μm+京尼平苷10μm)、以及化合物ⅰ不同剂量组(地塞米松1μm分别加浓度为0.008、0.04、0.2、1和5μm化合物ⅰ)。两天后，收集细胞(死细胞和活细胞)，用pbs洗涤两次，然后在4℃下离心(2000rpm)。离心10分钟后，用
annexin v-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒，即在annxxin结合缓冲液(200μl)中用碘化丙啶(3μl)和annexin v-fitc(3μl)对沉淀进行染色，然后通过流式细胞仪(facs)评估凋亡细胞的数量。
[0047]
碱性磷酸酶活性测定
[0048]
测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)活性。在此，将成骨细胞mc3t3-e1接种在24孔板中。一天后，分为正常组(正常细胞无处理)、模型组(地塞米松1μm损伤细胞)、阳性对照组(地塞米松1μm+京尼平苷10μm)、以及化合物ⅰ不同剂量组(地塞米松1μm分别加浓度为0.008、0.04、0.2、1和5μm化合物ⅰ)。在5％co2中培养条件下，培养两天后，洗涤细胞，使用含有对硝基苯基磷酸酶(6mm)的裂解缓冲液进行裂解，孵育一小时后，通过添加naoh(30μl)(1.5m)终止反应，并使用分光光度计读数器在400nm处记录吸光度。
[0049]
茜素红染色
[0050]
通过茜素红染色观察各组矿化作用。在此，将成骨细胞mc3t3-e1接种在24孔板中。一天后，分为正常组(正常细胞无处理)、模型组(地塞米松1μm损伤细胞)、阳性对照组(地塞米松1μm+京尼平苷10μm)、以及化合物ⅰ不同剂量组(地塞米松1μm分别加浓度为0.008、0.04、0.2、1和5μm化合物ⅰ)。在5％co2中培养条件下，培养两天后，用pbs冲洗培养物三次，用4％对甲醛固定。30分钟后，用茜素红染色30分钟，用荧光显微镜评价。
[0051]
结果与讨论
[0052]
化合物ⅰ为白色粉末。分子式由hr-ei-ms在m/z 320.2344[m]
+
(计算值320.2351)确定为c
20h32
o3，表明存在五个不饱和度。uv光谱在249nm处显示最大吸收，ir光谱在3638(o-h)、2956(c-h)和1692(c＝o)cm-1
处显示吸收带。1h nmr数据显示在δh0.74、0.85、1.01、1.80和2.10处共振的五个甲基信号，以及在δh5.18(br s)和5.64(br s)处的两个烯氢质子信号。
13
cnmr显示存在20个碳，由5个季碳、5个次甲基、5个亚甲基和5个甲基组成。上述核磁共振数据显示该化合物为二萜类成分。
[0053]
使用mtt测定法采用化合物ⅰ在0.008、0.04、0.2、1和5μm浓度下对地塞米松诱导的成骨细胞mc3t3-e进行处理，，随后进行流式细胞仪进一步验证，结果显示化合物ⅰ对地塞米松诱导的成骨细胞凋亡具有显著的保护作用。如图1中描述了正常组(正常mc3t3-e1成骨细胞，不加地塞米松)、地塞米松组(dexamethasone,dex)(加地塞米松1μm造模)、dex加阳性对照京尼平苷(geniposide，10μm)和dex加不同浓度的化合物ⅰ对地塞米松诱导的mc3t3-e1成骨细胞凋亡的影响。化合物ⅰ显著促进细胞增殖(a)，###与正常组比较p《0.01，***与模型组比较p《0.01。dex处理后用流式细胞仪测定各组mc3t3-e1细胞存活率；左下象限中的值表示活细胞百分比(b)。在研究期间，在对照(未处理的细胞)中观察到最高的成骨细胞群占比为94.8％，而在地塞米松(1μm)处理的细胞组中成骨细胞群占比为52.8％。在1μm的化合物ⅰ作用下，成骨细胞的存活率与标准对照京尼平苷(10μm)的作用相似。此外，与标准对照和模型相比，化合物ⅰ还显示出增加成骨标志物水平的潜力，如碱性磷酸酶和矿化作用。图2描绘了碱性磷酸酶活性测定，以及各组mc3t3-e1成骨细胞茜素红染色后的矿化作用的比较。地塞米松加化合物处理组的碱性磷酸酶活性显著上调(a)，###与正常组比较p《0.01，***与模型组比较p《0.01。与未处理的对照组相比，在地塞米松+化合物ⅰ处理组中mc3t3-e1成骨细胞的茜素红染色后观察到钙化结节的数量显著增加(b)。碱性磷酸酶测定结果显示，碱性磷酸酶在地塞米松处理的成骨细胞中明显降低。此外，茜素红染色图像显示地塞米松显著诱导
成骨细胞凋亡，在图像中仅观察到少量细胞。而化合物ⅰ通过在0.008、0.04、0.2、1和5μm的浓度下显示出保护作用，增强分化和增殖。与标准对照和模型对照组相比，1μm的化合物ⅰ显著增加染色矿化结节，并增加了细胞数量。
[0054]
结论
[0055]
总之，本发明的研究结果表明，一个新的克罗烷型化合物ⅰ具有拮抗糖皮质激素对mc3t3-e1成骨细胞损伤的潜力，可作为治疗人类骨质疏松症的有前途的药物。
[0056]
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0057]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

技术特征：
1.用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物，其特征在于，所述克罗烷型二萜化合物为具有式ⅰ所示结构的化合物：2.如权利要求1所述的用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物，其特征在于，所述克罗烷型二萜化合物为式ⅰ所示的化合物的异构体、盐或溶剂化物，或在药物赋形剂、佐剂、载体或稀释剂中的共晶体。3.如权利要求1所述的用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物，其特征在于，所述骨质疏松症与糖皮质激素损伤相关。4.如权利要求1所述的用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、首先将小果荚髓苏木的干燥茎皮用甲醇浸提，减压浓缩后得到膏状提取物，将膏状提取物用水悬浮，之后用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，浓缩后获得乙酸乙酯萃取物，然后用硅胶柱色谱进行分离，获得多个主要组分；步骤二、所得多个主要组分用薄层色谱系统分析，选取在薄层系统rf值0.5处显示明显紫色斑点的组分，合并，得到化合物ⅰ的粗品；步骤三、将化合物ⅰ的粗品再次进行硅胶柱色谱进行细分，细分后用步骤二中的薄层色谱系统分析并再次确认化合物ⅰ为薄层系统rf值0.5处显示明显紫色斑点的组分，并再次收集组分；步骤四、纯化步骤三中再次收集的组分，得到化合物ⅰ的纯品。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，硅胶柱色谱采用二氯甲烷-甲醇为溶剂系统。6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤二和步骤三中，薄层色谱系统中，采用硅胶f254薄层板，用体积比75:25的正己烷：乙酸乙酯进行检识，展开后用香草醛对薄层板进行喷洒、加热显色。7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，硅胶柱色谱采用正己烷-丙酮为洗脱系统。8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述纯化包括：将再次收集的组分经凝胶柱色谱进行去除杂质处理，最后用高效液相色谱进行纯化。9.如权利要求1所述的克罗烷型二萜化合物于制备用于骨质疏松症的药物或科学研究中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松症与糖皮质激素损伤相关。

技术总结
本发明公开了用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物，为具有式Ⅰ所示结构的化合物：本发明还公开了用于骨质疏松症的克罗烷型二萜化合物的制备方法。本发明还公开了克罗烷型二萜化合物于制备用于骨质疏松症的药物或科学研究中的应用。本发明的化合物Ⅰ具有预防和治疗骨质疏松症的潜力。本发明的化合物Ⅰ对糖皮质激素地塞米松(DEX)诱导的成骨细胞凋亡具有显著的保护作用，具有预防和治疗骨质疏松症的潜力。具有预防和治疗骨质疏松症的潜力。具有预防和治疗骨质疏松症的潜力。


技术研发人员：王艳 穆罕默德
受保护的技术使用者：巴基斯坦卡拉奇大学国际化学与生命科学研究院
技术研发日：2022.03.09
技术公布日：2022/5/25