一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用

1.本发明涉及食品添加剂及医药技术领域，尤其是涉及一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用。


背景技术：

2.随着人类生活习惯的改变及对健康需求的增加，人们对益生元(prebiotics)的市场需求也在不断增加。而成为益生元必须满足的条件有：(1)通过消化道时，不被人体胃肠道吸收或被消化液消化降解；(2)能够被肠道微生物发酵利用；(3)促进有益菌群的生长，抑制肠道有害菌群，即调节肠道菌群紊乱；(4)发酵后能够产生一些有益代谢产物如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等不饱和脂肪酸(scfas)进入人体血液，从而预防及减轻一些常见疾病如心血管疾病、老年痴呆症、癌症、炎症、糖尿病、肥胖症等，最终改善人体健康。
3.目前，已开发的益生元主要包括功能性寡糖、多糖、多元醇、蛋白水解物等，而功能性寡糖及多糖成为益生元研发热点之一。已商业化的低聚果糖(fos)、菊粉(inulin)、半乳聚糖(gos)、低聚木糖(xos)等益生元具有良好的益生功效，在世界许多国家被广泛用于食品添加剂及饲料。大量研究表明，多糖发酵及其发酵代谢产物可促进宿主健康。因此，天然来源的各种杂多糖作为改善人体健康的益生元具有较高的开发和应用潜力。
4.中国发明专利cn200380105558.6公开了益生元组合物，该专利制备的组合物含有可溶性纤维，尤其是fos和gos的组合物，能够维持和/或恢复肠内微生物区系，用于预防或治疗炎症性肠病。中国发明专利cn201911073654.6公开了一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖orp-1及其制备方法和用途，该黑皮鸡枞菌多糖具有抵抗消化的特性，能够被粪便微生物酵解利用，促进肠道益生菌的增殖。中国发明专利cn201911176424.2公开了一种调节脑肠轴多糖组合益生元颗粒及制备方法和应用，该专利的多糖组合益生元主要含有黄芪多糖和百合多糖，能够调节肠道菌群，抑制有害菌、扶植有益菌的作用。由此可见，某些种类的寡糖或多糖能够作为益生元发挥功效，具有广阔的市场应用前景。
5.海榄雌(avicennia marina(forsk.)vierh.)别名白骨壤、海豆，为马鞭草科、海榄雌属灌木，广泛分布于亚热带和热带地区，在我国主要分布于广东、广西、福建、海南等省沿海滩涂，林地面积超过7000hm2，可占我国红树林区面积的30％，是我国红树林的先锋树种。该植物不仅是一种生态上重要的红树林树种，也是中国和其他亚洲国家长期以来治疗溃疡、脓肿和风湿的传统民间药物。此前的研究表明，海榄雌含有数种活性物质，如多糖、游离脂肪酸、黄酮类化合物、单宁、蛋白质和三萜等，具有抗糖尿病、抗炎、抗病毒和抗癌活性。
6.海榄雌果实，又称为榄钱，不仅可药用，而且可食用，因其丰富的营养成分越来越受到人们的欢迎，符合现代人健康饮食习惯的需要。海榄雌植株3-5年即可结果，果期5-9月，8月为盛果期，热带地区可周年挂果。单株产量3-50kg，全国全年产量可达30万吨以上。在我国南亚热带以南沿海具有广泛的药食用基础，是被作为食物利用得最多的红树果实。上个世纪60年代北海当地人曾大量采摘榄钱作为食物，至今北部湾地区居民还会在8、9月
份采摘榄钱制作菜肴，酿制酒类，深受喜爱。近年来榄钱的营养价值、活性成分及生物功效等也引起了学者的关注，多糖是海榄雌果实的主要活性物质之一，开发榄钱多糖作为益生元具有较大的市场应用价值和社会效益。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用，制得的榄钱总多糖水溶性好，无毒副作用，具有抵抗人体口腔、胃、肠等的消化特性。且该榄钱总多糖能被肠道菌群利用，能够增加有益菌群的丰度，抑制有害菌群的生长，从而调节肠道菌群，促进乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸等短链脂肪酸的生成，作为新型益生元用于改善或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的相关药物和食品添加剂中。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种非淀粉榄钱总多糖，所述榄钱总多糖分子量范围为2.0～700kda，包含4种不同分子量的多糖，其重均分子量分别为450～650、50～150、15～35、1～10kda。
9.优选的，所述榄钱总多糖分子量范围为3.0～600kda，4种不同分子量的多糖重均分子量分别为500～600、85～115、18～28、2～6kda。
10.优选的，榄钱总多糖包括阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖，摩尔百分比分别为25％～45％、15％～35％、25％～40％、5％～15％；
11.还包括葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，上述三种单糖的总摩尔百分比《8％。
12.优选的，榄钱总多糖包括阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖，摩尔百分比分别优选为30％～40％、18％～32％、27％～37％、5％～11％；还包括葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，三种单糖的总摩尔百分比《6％。
13.优选的，榄钱总多糖中糖含量以葡萄糖为标准品计35％～60％，糖醛酸含量以半乳糖醛酸为标准品计30％～50％，其中，蛋白质含量《5％。
14.优选的，榄钱总多糖中糖含量以葡萄糖为标准品计优选为40％～50％，糖醛酸含量以半乳糖醛酸为标准品计优选为35％～45％，蛋白质含量优选为《2.5％。
15.一种非淀粉榄钱总多糖的制备方法，步骤如下：
16.s1、提取：取采集的新鲜榄钱，去皮，55～65℃鼓风干燥，粉碎；取榄钱干粉置于反应釜中，提取，离心并合并所得榄钱多糖提取液；
17.s2、除淀粉：榄钱多糖提取液加入酶水解，水解液加入3～5倍体积的95％或无水乙醇醇沉4h以上，大容量离心机离心8～20min，离心力为3000～5000g，收集沉淀；
18.s3、除蛋白：榄钱粗多糖溶解后采用sevag法除蛋白，多糖溶液与sevag试剂(即氯仿:正丁醇(v/v)＝1:4～1:5)按体积比1:4～1:5混合，剧烈震荡20～30min，离心得到的上清液再反复除蛋白5～10次，离心力为3500～6000g，离心15～20min；
19.s4、除小分子杂质：反复醇沉或透析或超滤除去小分子杂质，其中反复醇沉加入乙醇终浓度为60～80％，透析或超滤选用的透析袋或超滤膜截留分子量为3000～10000da，透析时间为48～72h；
20.s5、最后于50～65℃减压浓缩、冷冻干燥获得榄钱总多糖，减压浓缩的温度为50～65℃，浓缩至粘稠状。
21.优选的，步骤s1中，提取的方法为按料液质量体积比为1:15～1:40加蒸馏水提取，
提取温度为80～100℃，提取次数1～3次，提取时间为每次1.5～3h。
22.优选的，步骤s2中，酶水解的过程为：首先加入终浓度为0.01～0.05的α-淀粉酶水解，ph为5.0～7.5，温度为45～55℃，水解2～6h；再加入终浓度为0.05％～0.25％淀粉葡糖苷酶，ph为4.0～6.0，温度为35～45℃，继续水解，直至碘液检测不变蓝。
23.优选的，步骤s2中，榄钱多糖提取液加入终浓度为0.01～0.03的α-淀粉酶水解，ph为6.0～7.0，温度为45～55℃，水解3～4h；再加入终浓度为0.05～0.20％淀粉葡糖苷酶，ph为4.0～5.0，温度为35～45℃，继续水解，碘液检测不变蓝；淀粉去除完全的标准为：碘液检测水解液不变蓝。
24.优选的，步骤s4中，反复醇沉加入乙醇终浓度为70～80％；所述透析或超滤选用的透析袋或超滤膜截留分子量优选为3000～8000da，透析时间为48～36h。
25.一种非淀粉榄钱总多糖在制备调节肠道微生物制剂、促进有益菌群生长中的应用。
26.优选的，所述有益菌群包括并不限于巨球型菌属(megasphaera)、巨单胞菌属(megamonas)、普氏菌属(prevotella)、光冈菌属(mitsuokella)和双歧杆菌属(bifidobacterium)。显著降低有害菌的相对丰度，如梭菌属(fusobacterium)、大肠埃希菌-志贺菌属(escherichia-shigella)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)中的一种或多种。
27.一种非淀粉榄钱总多糖作为益生元在药品、食品添加剂或保健食品中的应用。
28.一种非淀粉榄钱总多糖在促进肠道微生物产生scfas中的应用，scfas包括乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸等。
29.因此，本发明采用上述一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用，从榄钱中提取纯化榄钱总多糖，采用淀粉酶水解除去淀粉，sevag试剂除蛋白等方法得到非淀粉类榄钱总多糖。榄钱多糖不被唾液及胃肠液消化酶降解，但能明显调节肠道微生物的组成，主要表现为有益菌群(megasphaera、megamonas、prevotella和mistuokella等)的生长增加，有害菌相对丰度降低。此外，榄钱多糖提高了各种短链脂肪酸(scfas)的浓度。
30.本发明具有如下有益效果：
31.(1)本发明非淀粉榄钱总多糖制备时采用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶去除淀粉类多糖，避免了榄钱淀粉类多糖对其益生元功效研究的影响，能充分展现出榄钱多糖不被人体胃肠道消化酶消化降解的特性。
32.(2)本发明提取了一种新型多糖，该非淀粉榄钱总多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。
33.(3)本发明的非淀粉榄钱总多糖具有国际上公认的益生元的发酵特征，能够显著促进肠道有益菌的增殖，能够抑制各种有害菌的生长，尤其是能够促进科林塞拉属的增殖，该菌水平越高患某些疾病如炎症性肠病、癌症和肥胖等的风险越低，该特征不同于传统益生元。由于寻找新型益生元已成为调节肠道菌群改善人类健康等研究的热点，因此，本发明一种非淀粉榄钱总多糖益生元对于研制功能性食品及食品添加剂等具有重要应用价值。
34.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
35.图1是非淀粉榄钱总多糖的单糖组成分析，高效液相凝胶色谱图及红外光谱；
36.图2是非淀粉榄钱总多糖的模拟唾液、胃液、肠液消化的高效液相色谱图；
37.图3是非淀粉榄钱总多糖的模拟唾液(a)、胃液(b)、肠液(c)消化过程中释放的单糖变化；
38.图4是非淀粉榄钱总多糖的模拟肠道菌群发酵的高效液相色谱图；
39.图5是非淀粉榄钱总多糖的肠道菌群发酵过程中剩余糖含量和还原糖含量的变化；
40.图6是非淀粉榄钱总多糖发酵后肠道菌群的组成；
41.图7是非淀粉榄钱总多糖的发酵后微生物在门水平和属水平的相对丰度；
42.图8是非淀粉榄钱总多糖肠道微生物发酵过程中ph值和短链脂肪酸的动态变化。
具体实施方式
43.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
44.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
45.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
46.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
47.还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
48.本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其
±
50％，
±
40％，
±
30％，
±
20％，
±
10％，
±
5％或
±
1％范围内。
49.本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
50.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
51.本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
52.实施例一
53.一种非淀粉榄钱总多糖的提取制备方法，包括以下步骤：
54.(1)热水浸提：将从广西北海采集的榄钱去皮，放入托盘中，放入鼓风干燥箱，于60℃鼓风干燥，每隔12h翻动材料，干燥。干燥后的榄钱用粉碎机粉碎，过40目筛备用。取榄钱干粉1000g放入反应釜，按料液比1:20(w/v)加入蒸馏水，设置提取温度为92℃，搅拌速度400rpm，提取2.5h。4186g离心后，残渣按照相同条件重复提取2次，合并上清液。
55.(2)除淀粉：榄钱多糖提取液加入终浓度为0.02的α-淀粉酶水解，ph为6.5，温度为50℃，水解4h；再加入终浓度为0.1％淀粉葡糖苷酶，ph为4.5，温度为40℃，继续水解，碘液检测不变蓝；水解液加入3～5倍体积的95％或无水乙醇醇沉4h以上，大容量离心机离心8～20min，离心力为4186g，收集沉淀。加热至95℃，保持15min灭酶活，冷却后，4186g离心，取上清液加入95％食用酒精至终浓度为75％，4℃冰柜中静置过夜，离心得多糖沉淀。
56.(3)除蛋白：多糖沉淀称重，加入10倍重量的蒸馏水溶解，多糖水溶液加入sevag试剂(即氯仿:正丁醇(v/v)＝1:5)，使多糖溶液与sevag试剂的体积比也为1:5，剧烈震荡20min，4415g离心，取多糖溶液弃乳白色的蛋白质，该除蛋白步骤重复8次，直至肉眼观察无乳白色的蛋白沉淀。
57.(4)反复醇沉除小分子物质：除蛋白的水溶液加入终浓度为80％的乙醇，4℃静置4h，4186g离心，取沉淀加入10倍体积的蒸馏水溶解，反复醇沉3次以上，高效液相色谱法检测无小分子物质。多糖水溶液60℃，减压浓缩，采用冷冻干燥机冻干得到非淀粉榄钱总多糖，命名为amfp。
58.实施例二
59.榄钱总多糖(amfp)的理化性质分析
60.采用高效液相凝胶色谱法测定amfp的分子量及其分布，色谱条件：仪器为岛津高效液相色谱仪(lc-2030c 3d plus)，色谱柱为shodex sb-804hq(8.0mm id
×
300mm)凝胶柱，检测器为示差折光检测器(rid)，流速为0.5ml/min，流动相为0.1m氯化钠溶液。
61.采用苯酚硫酸法测定榄钱总多糖的总糖含量，以葡萄糖为标准品；采用羟基联苯法测定糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸为标准品；采用考马斯亮蓝法测定amfp中蛋白质含量。采用柱前衍生化高效液相色谱检测amfp的单糖组成，检测器为二极管阵列检测器(dad)，检测波长为245nm，色谱柱为eclipse plus c18(4.6
×
250mm,5μm)，柱温为30℃，流动相为磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 6.7)与乙腈的混合溶液(体积比为83:17)，流速为1.0ml/min，进样量为20μl。采用红外光谱测定amfp，取样品kbr压片，通过nicolet is50傅里叶变换红外光谱仪(美国thermo fisher scientific公司)测定，扫描范围：4000-400cm-1
。
62.amfp的高效液相凝胶色谱图见附图1，理化性质测定结果如表1。可知，amfp含4种不同分子量的多糖组份f1～f4，不含蛋白质，纯度高，面积归一化法计算纯度》98％。红外光谱如附图1所示，3382cm-1
处的宽而强的吸收峰可归因于糖环oh基的伸缩振动；在2939cm-1
处的吸收峰可以归因于鼠李糖的-ch3的c-h伸缩振动；1615cm-1
处的吸收为gala中c＝o的非对称拉伸振动；1417cm-1
吸收峰为coo-非对称伸缩振动；1015cm-1
处的吸收是糖环上c-o的伸缩振动。
63.表1榄钱总多糖的理化性质检测结果
[0064][0065]
实施例三
[0066]
非淀粉榄钱总多糖消化特征研究
[0067]
模拟唾液消化：将α-淀粉酶200.0mg、粘蛋白100.0mg、氯化钠12.0mg、氯化钾15.0mg溶解于100ml去离子水中，用0.1mol/l氢氧化钠溶液调ph至7.0，最终制备模拟唾液。模拟唾液消化时，将2ml amfp溶液(8mg/ml)与2ml模拟唾液混合，于37℃水浴中孵育2h。以去离子水为对照组，分别消化0、0.5、1.0和2.0h后，取样，沸水浴灭活。采用高效液相凝胶色谱法测定消化后amfp分子量变化；采用高效液相色谱测定消化后游离单糖产生情况；采用3,5-二硝基水杨酸法测定amfp经唾液消化后还原糖含量的变化。
[0068]
模拟胃液消化：将氯化钾220.0mg、氯化钙50.0mg、氯化钠620.0mg和碳酸氢钠120.0mg溶于200ml去离子水中制备胃电解质溶液。将ph调至2.0后，取胃蛋白酶23.6mg、胃脂肪酶25.0mg、1.0ml乙酸钠溶液(1.0mol/l，ph 5.0)与100.0ml胃电解质溶液充分混合。用0.1mol/l盐酸水溶液调节混合溶液ph至2.0，最终制备得到胃液。取amfp 10ml与胃液1:1(v/v)混合，37℃孵育6h。分别于0、2、4和6h取样，调ph为7.0，放入沸水中加热10min灭酶活。按照上述高效液相凝胶色谱法、dns法、pmp柱前衍生化法检测分子量变化、还原糖含量变化及单糖组成变化情况。
[0069]
模拟肠液消化：配制肠电解质溶液，主要成分为5.4g/l氯化钠、0.65g/l氯化钾和0.33g/l氯化钙。用0.1m氢氧化钠水溶液调节肠电解质溶液的ph为7.0。然后将50g胰酶溶液(7％，w/v)、100g胆盐溶液(4％，w/v)、6.5mg胰酶与50g肠电解质溶液混合均匀。用0.1m氢氧化钠溶液调节ph至7.0，最终得到模拟肠液。将胃液和amfp混合溶液调ph为7.0，然后与肠液按10:3(v/v)的比例混合。分别于消化0、2、4和6h时，取消化的样品，沸水浴灭酶活10min。按照上述方法测定分子量变化、还原糖含量及游离单糖含量变化情况。
[0070]
amfp模拟消化结果见表2。在口腔、胃、肠等消化过程中，amfp的总糖和还原糖含量均无显著变化。amfp在各种消化液消化前后色谱峰未发生变化(图2)。
[0071]
图3所示，峰从左到右依次为：1、甘露糖，2、核糖，3、鼠李糖，4、葡萄糖醛酸，5、半乳糖醛酸，6、葡萄糖，7、半乳糖，8、木糖，9、阿拉伯糖，10、岩藻糖。在口腔、胃、肠消化过程中amfp的色谱图中均未观察到有游离单糖产生，表明唾液、胃液和肠液不能消化榄钱多糖，amfp具有益生元抗消化的基本特征。
[0072]
表2榄钱总多糖模拟消化的总糖和还原糖含量变化
[0073][0074][0075]
实施例四
[0076]
非淀粉榄钱总多糖肠道菌群酵解及益生功能
[0077]
配制基础营养培养基，每升培养基含有胆汁盐0.5g、六水氯化钙0.01g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、氯高铁血红素0.02g、磷酸氢二钾0.04g、磷酸二氢钾0.04g、七水硫酸锰0.01g、碳酸氢钠2.0g、氯化钠0.1g、蛋白胨2.0g、刃天青1.0mg、吐温80 2.0ml、维生素k10μl、酵母提取物2.0g。溶液调ph至7.0。
[0078]
粪便样本由4名健康志愿者提供，他们在实验前的3个月内从未服用过抗生素。将相同重量的新鲜粪便样品混合后均匀分散于自制生理盐水(含9.0g/l nacl和0.5g/l半胱氨酸盐酸盐)中，制备10％(w/v)的粪便悬浮液。离心去除难溶的物质得到粪便悬浮液。将1％的粪便悬浮液接种到含amfp的基础营养培养基中，在anaero pack系统(三菱气体化学公司，东京，日本)中37℃孵育24h。以fos和基础营养培养基分别作为阳性对照和空白对照。发酵0、6、12、24h后取发酵样品分析检测ph值、分子量、还原糖含量、单糖组成及scfas(每个时间点设三组平行)。
[0079]
肠道菌群酵解的amfp色谱图、及剩余糖含量和还原糖含量的变化分别见附图4和5。发酵6h后，amfp组份1、2、3的峰面积明显下降，表明amfp很快被肠道菌群利用。同时，21.0min左右的峰面积变大，说明部分amfp被肠道菌群水解成低分子量的片段。随着发酵时间的延长，amfp的含量逐渐降低，小分子物质的峰面积在发酵12h前不断增加。之后，21.0min左右的峰面积随着时间的推移而减小，说明低分子量的片段被肠道菌群利用。图5显示了amfp在肠道微生物发酵过程中的消耗情况。肠道微生物发酵24h后，剩余糖含量由100％逐渐下降到43.95％，表明约56.05％的amfp可被人类粪便微生物利用。还原糖含量在发酵前12h迅速增加，说明大量糖苷键被肠道菌群水解。随后，还原糖含量迅速下降，这说明发酵过程中产生的还原糖被微生物利用了。由附图4和表3可知，除鼠李糖外，各单糖的摩尔比均随发酵时间显著降低(p《0.05)。发酵24h后，amfp的主要单糖阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸被肠道菌群消耗，其中半乳糖醛酸的利用率最高。同时测定了发酵过程中游离单糖的含量。发酵6h后葡萄糖和甘露糖消失，12h后半乳糖也未检测到，说明游离单糖被微生物利用。此外，随着发酵时间的增加，半乳糖醛酸的摩尔比增加(p《0.05)，说明amfp降解产生
的半乳糖醛酸的速率高于微生物对半乳糖醛酸的利用率。
[0080]
表3榄钱多糖不同酵解时间其单糖含量变化
[0081][0082]
图6是非淀粉榄钱总多糖发酵后肠道菌群的组成。(a)肠道菌群α-多样性指标；(b)otus水平上的肠道菌群主成分分析；(c)基于bray-curtis方法距离的聚类分析。ace、chao1、simpson和shannon的α-多样性结果如图6a所示。从指标值可以看出，amfp或fos组的微生物丰度明显低于空白对照组。amfp的丰富度高于fos。fos和amfp的补充可能有利于某些肠道微生物的生长。优势菌的生长和竞争可能导致其他微生物的减少甚至消失，从而导致肠道微生物丰富度的降低。如图6b所示，同一组样品的数据距离较近，离其他处理组较远。前两个成分证实了三组间的98.91％的差异，尤其是第一主成分水平占88.00％。基于bray-curtis方法的聚类分析也得到了类似的结果(图6c)。以上结果表明，amfp组的微生物群落与空白组和fos组存在差异。
[0083]
如图7a所示，空白组、fos组和amfp组的优势菌门均为firmicutes、proteobacteria、bacteroidetes、actinobacteria和fusobacteria。与空白组相比，amfp和fos组的厚壁菌门水平显著升高。大肠中的厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)在发酵不易消化的多糖方面发挥着重要作用，可促进宿主的健康。与空白组相比，amfp和fos组变形菌门和梭杆菌门的相对丰度显著降低。一些细菌病原体如大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌属于变形菌门，可以扰乱肠道菌群的平衡，引发代谢和免疫紊乱。
[0084]
在属水平上，空白组以escherichia-shigella、megasphaera、bacteroides、klebsiella和lachnoclostridium为核心菌群，fos组以megasphaera、megamonas、mitsuokella、lactobacillus和bifidobacterium为代表菌群(图7b)。与空白组相比，amfp组megasphaera、megamonas、prevotella_9、mitsuokella、collinsella和bifidobacterium的相对丰度明显增加(表4)。越来越多的研究表明，在多糖益生元含量高的条件下，megasphaera、megamonas、bifidobacterium和prevotella_9更丰富，并与人体健康呈正相关。与此同时，有害菌如escherichia-shigella、fusobacterium和klebsiella等在fos或amfp发酵后急剧下降。综上所述，amfp可以通过刺激有益菌的生长和抑制病原菌的生长来调节菌群结构。
[0085]
表4榄钱多糖发酵微生物丰度变化
[0086][0087][0088]
不同的字母代表(p《0.05)在不同组中的显著性。
[0089]
发酵过程中ph值的变化见附图8。发酵开始时，各组发酵培养基ph值均在7.0左右。amfp组溶液ph值在发酵6h时迅速下降，之后的6h略有下降。amfp发酵24h后ph由7.05降至5.18，显著低于空白组在同一时间点的ph值。在ph变化方面，amfp对肠道微环境有显著影响，但影响小于fos。
[0090]
肠道微生物主要代谢产物scfas的变化如附图8所示。各组发酵产物主要为乙酸、丙酸、正丁酸和正戊酸，但各发酵产物的含量不同。在amfp组中，乙酸是主要的短链脂肪酸，其次是丙酸。发酵过程中，amfp组乙酸和丙酸浓度分别从1.306mm和0.206mm增加到8.600mm和4.486mm。在发酵24h时，amfp组的正丁酸和正戊酸显著高于空白组。正丁酸是一种重要的短链脂肪酸，为结肠上皮提供能量并发挥抗炎作用。正戊酸为治疗辐射损伤、癌症和结肠炎等疾病的潜在治疗靶点。发酵24h后，amfp组总scfas浓度为19.299mmol/l，明显高于空白组(12.033mmol/l)，但低于fos组(21.697mmol/l)。综上所述，amfp经粪便微生物菌群发酵后，scfas增加能够对人体健康产生有益效果。
[0091]
因此，本发明采用上述一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用，制得的榄钱总多糖水溶性好，无毒副作用，具有抵抗人体口腔、胃、肠等的消化特性。该榄钱总多糖能被肠道菌群利用，能够增加有益菌群的丰度，抑制有害菌群的生长，从而调节肠道菌群，促进乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸等短链脂肪酸的生成，作为新型益生元用于改善或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的相关药物和食品添加剂中。
[0092]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种非淀粉榄钱总多糖，其特征在于：所述榄钱总多糖分子量范围为2.0～700kda，包含4种不同分子量的多糖，其重均分子量分别为450～650、50～150、15～35、1～10kda。2.根据权利要求1所述的一种非淀粉榄钱总多糖，其特征在于：榄钱总多糖包括阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖，摩尔百分比分别为25％～45％、15％～35％、25％～40％、5％～15％；还包括葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，上述三种单糖的总摩尔百分比<8％。3.根据权利要求1所述的一种非淀粉榄钱总多糖，其特征在于：榄钱总多糖中糖含量以葡萄糖为标准品计35％～60％，糖醛酸含量以半乳糖醛酸为标准品计30％～50％，其中，蛋白质含量<5％。4.一种非淀粉榄钱总多糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：s1、提取：取采集的新鲜榄钱，去皮，55～65℃鼓风干燥，粉碎；取榄钱干粉置于反应釜中，提取，离心并合并所得榄钱多糖提取液；s2、除淀粉：榄钱多糖提取液加入酶水解，水解液加入3～5倍体积的95％或无水乙醇醇沉4h以上，大容量离心机离心8～20min，离心力为3000～5000g，收集沉淀；s3、除蛋白：榄钱粗多糖溶解后采用sevag法除蛋白，多糖溶液与sevag试剂(即氯仿:正丁醇(v/v)＝1:4～1:5)按体积比1:4～1:5混合，剧烈震荡20～30min，离心得到的上清液再反复除蛋白5～10次，离心力为3500～6000g，离心15～20min；s4、除小分子杂质：反复醇沉或透析或超滤除去小分子杂质，其中反复醇沉加入乙醇终浓度为60～80％，透析或超滤选用的透析袋或超滤膜截留分子量为3000～10000da，透析时间为48～72h；s5、最后于50～65℃减压浓缩、冷冻干燥获得榄钱总多糖，减压浓缩的温度为50～65℃，浓缩至粘稠状。5.根据权利要求4所述的一种非淀粉榄钱总多糖的制备方法，其特征在于：步骤s1中，提取的方法为按料液质量体积比为1:15～1:40加蒸馏水提取，提取温度为80～100℃，提取次数1～3次，提取时间为每次1.5～3h。6.根据权利要求4所述的一种非淀粉榄钱总多糖的制备方法，其特征在于：步骤s2中，酶水解的过程为：首先加入终浓度为0.01～0.05的α-淀粉酶水解，ph为5.0～7.5，温度为45～55℃，水解2～6h；再加入终浓度为0.05％～0.25％淀粉葡糖苷酶，ph为4.0～6.0，温度为35～45℃，继续水解，直至碘液检测不变蓝。7.根据权利要求4所述的一种非淀粉榄钱总多糖的制备方法，其特征在于：榄钱多糖提取液加入终浓度为0.01～0.03的α-淀粉酶水解，ph为6.0～7.0，温度为45～55℃，水解3～4h；再加入终浓度为0.05～0.20％淀粉葡糖苷酶，ph为4.0～5.0，温度为35～45℃，继续水解，碘液检测不变蓝；淀粉去除完全的标准为：碘液检测水解液不变蓝。8.一种非淀粉榄钱总多糖在制备调节肠道微生物制剂、促进有益菌群生长中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述有益菌群包括并不限于巨球型菌属(megasphaera)、巨单胞菌属(megamonas)、普氏菌属(prevotella)、光冈菌属(mitsuokella)和双歧杆菌属(bifidobacterium)。显著降低有害菌的相对丰度，如梭菌属(fusobacterium)、大肠埃希菌-志贺菌属(escherichia-shigella)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)中的一种或多种。
10.一种非淀粉榄钱总多糖作为益生元在药品、食品添加剂或保健食品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种非淀粉榄钱总多糖，所述榄钱总多糖分子量范围为2.0～700kDa，包含4种不同分子量的多糖，其平均分子量分别为450～650、50～150、15～35、1～10kDa。本发明采用上述的一种非淀粉榄钱总多糖及其制备方法和作为肠道益生元的应用，制得的榄钱总多糖水溶性好，无毒副作用，具有抵抗人体口腔、胃、肠等的消化特性。且该榄钱总多糖能被肠道菌群利用，能够增加有益菌群的丰度，抑制有害菌群的生长，从而调节肠道菌群，促进乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸等短链脂肪酸的生成，作为新型益生元用于改善或治疗肠道菌群紊乱相关疾病的相关药物和食品添加剂中。物和食品添加剂中。物和食品添加剂中。


技术研发人员：袁清霞 赵龙岩 吕坤凌 黄金文 李宏 刘永宏 高程海 孙姝婧 方梓毓
受保护的技术使用者：广西中医药大学
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2022/5/25