单细胞染色体的制片方法与流程

    专利查询2024-01-13  103


    1.本发明涉及一种单细胞染色体的制片方法,属于细胞制片领域。


    背景技术:

    2.染色体是基因的载体,染色体核型是某一物种所特有的一组染色体或一套染色体的形态特征,通过对染色体数目的技术和对结构的观察、分析,为染色体病、遗传病、重现性遗传学异常的血液肿瘤等疾病的诊断提供形态学依据,对于肿瘤患者疗效评估、预后判断具有重要的临床意义。
    3.对染色体的观察的方法主要是由1968年瑞典casperson建立,将中期染色体经预处理,再用不同的方法染色,使染色体上出现明显而稳定的斑带。主要分为两大类:一类是染色带分布整个染色体上,如g、q、r带;另一类是局部的显带,使少数特定的区域显带,如c、t和n带。本检测方案主要采用的是g带分析,是最常用的分带技术,特点是非常稳定。
    4.骨髓是人体的重要的造血组织。成年人的骨髓分两种:红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。单细胞中有丝分裂指数较高,因此可以直接得到中期细胞,因此,仅仅给一定剂量的秋水仙碱即可以使得许多出于分裂状态细胞被阻断在有丝分裂中期。
    5.染色体标本制备是染色体核型分析过程中最重要的技术,也是临床遗传学诊断中常用检测方法之一。稳定获得足量中期分裂相、显带清晰、形态较好的染色体,有以下关键因素必须兼顾:(1)染色体的分布情况:在显微镜下观察,染色体之间如果出现交叉、重叠等未分散开的情况,会影响核型的判断和分析;(2)染色体的条带:如果染色体条带不好,如条带模糊不清,条带有染色过深或过浅,均影响异常结果的判读,甚至无法判断。
    6.传统的单细胞染色体标本制作方法主要包括以下步骤:取材、秋水仙碱阻断细胞分裂、低渗处理使得染色体分散、预固定、细胞固定、制片以及镜检。预固定主要作用是为了终止低细胞收获过程中,固定的次数和时间会影响染色体的收获效果。预固定液的用量最终影响染色体分散质量,随着预固定液浓度升高,细胞越容易成团,制片过程中较难分开,染色体易聚积,制片效果较差。如果低渗时间较长,易造成细胞破裂,染色体从细胞区域漏出,造成丢失。
    7.但是以上方法较为复杂,尤其是对于预固定液的用量和时间的掌控,如果处理不当将会严重影响制片的质量。


    技术实现要素:

    8.鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种单细胞染色体的制片方法,用于解决现有技术中的制片方法较为难以掌控,制片结果不理想的问题。
    9.为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种单细胞染色体的制片方法,所述方法包括以下步骤:
    10.(1)向单细胞中加入dna合成抑制剂使得其有丝分裂停止,孵育。
    11.单细胞可以来自人体的任何部位的骨髓系细胞。
    12.进一步地,所述单细胞是经过培养后的细胞。
    13.优选地,所述单细胞来自确诊患者、未确诊患者或者被怀疑患有某种疾病的患者。
    14.优选地,单细胞来自未确诊患者时或者被怀疑患有某种疾病的患者时,使用的培养液a、培养时间20~48h。同时为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组,采用加刺激剂的培养液a(即c培养液)。
    15.优选地,所述单细胞来自b细胞淋巴瘤时,使用培养液a,培养时间70~74h。进一步地,为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组,采用加脂多糖(lps)的培养液a。
    16.优选地,来自t细胞淋巴瘤时,使用的培养液选用a培养液,培养时间70~74h。进一步地,为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组,采用加入了植物血球凝集素(pha)的a培养液。
    17.进一步地,上述a培养液可以是:1640培养液:小牛血清:青链霉素=500:150:7(体积比)。
    18.进一步地,上述c培养液可以是1640培养液:小牛血清:青链霉素:重组人体粒细胞刺激因子=500:150:7:0.15(体积比)。
    19.进一步地,所述dna合成抑制剂选自秋水仙酰胺、秋水仙碱中的任意一种或几种。在优选的方案中采用秋水仙酰胺,两者功效相同,但是秋水仙酰胺毒性大大降低。
    20.进一步地,所述dna合成抑制剂加入的量为80~100微升。
    21.进一步地,所述孵育的条件是:36~38℃、20~40min;优选为37℃。
    22.此步处理主要目的是使细胞分裂相保持在中期,便于后期的形态观察。
    23.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液,静置15~30min。
    24.进一步地,所述低渗溶液的溶质选自kcl(氯化钾)溶液、所述溶液的浓度是0.07~0.08mol/l,更优选为0.075mol/l。所述kcl溶液是指kcl水溶液。
    25.具体的处理方法包括:将步骤(1)中孵育后的单细胞离心1200~1500r/min,离心5~10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入8~12ml的kcl低渗液,混匀,静置15~30min。更优选地为20min.。主要目的是使染色体分散,铺展开,便于后期观察。
    26.进一步地,将低渗溶液预热至37℃后将单细胞和dna合成抑制剂混合。
    27.更优选地,低渗溶液前半部分缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入。所述缓慢加入是指一滴一滴加入的方式加入。
    28.(3)细胞固定:向低渗处理过的单细胞直接中加入固定剂。
    29.在现有技术中需要将在低渗处理后的单细胞中进行预固定,而本技术中的技术方案中无需进行预固定。
    30.进一步地,所述固定剂选用甲醇和冰醋酸的混合溶液,进一步地,所述甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1。
    31.进一步地,所述固定剂分三次加入,每次加入固定剂后静置。
    32.具体方法包括:将静置后的单细胞,1200~1500r/min,离心5~10min,弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂,混匀,室温静置15~20min后,1200~1500r/min,离心5~10min,弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混
    匀,并涡旋震荡,加入的固定剂,混匀,室温静置10~15min后;1200~1500r/min,离心5~10min,弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂,混匀,室温静置10~15min后,1200~1500r/min,离心5~8min。细胞收完后,放入4℃-8℃冰箱中保存。
    33.优选地,第一次加入固定剂的量为8~12ml,优选地为10ml。更优选地,固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入。
    34.优选地,第2次以及第3次加入的固定剂的量都为3~7ml,更优选地为5ml。
    35.(4)制片、烤片。
    36.所述制片采用划片的方式。
    37.进一步地,所述划片的具体方法包括:手持玻片一端,玻片略向右下角倾斜10~25度,使用滴管从左上角沿玻片上边缘向右上角均匀划片。
    38.进一步地,所述烤片包括将制备好的玻片放入烤箱中,先低温烤片再高温烤片。
    39.进一步地,所述低温烤片55~65℃、14~18h,更优选为60℃、16h。
    40.进一步地,高温烤片85~95℃、30~50min,更优选为90℃、45min。
    41.(5)染色。
    42.原理:经过蛋白水解酶的处理,染色体可以被吉姆萨等染色剂着色显带,产生深、浅交替的条带。染色体不同的条带与相应的碱基对成分相关。深带对应富含a-t碱基对,有功能的基因较少。浅带对应富含g-c碱基对,功能基因较多。每条染色体有其独特的g-c带的模式,所以能够帮助区分全部的染色体,包括有移位的和重组的染色体。
    43.具体地,所述染色的方法包括:将单细胞经过蛋白水解酶处理后加染色剂。
    44.优选地,所述蛋白水解酶是胰酶;所述染色剂为吉姆萨染液。
    45.(6)镜检。
    46.在优选的方案中,尽量少滴油在玻片上。
    47.如上所述,本发明的单细胞染色体的制片方法,具有以下有益效果:
    48.本发明中由于无需进行预先固定,且采用了特殊的制片方法,使得制片中染色体形态结构更加清晰,有利于镜检观测。相对于现有技术中制片方法更加的简单且制片更清晰。
    具体实施方式
    49.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
    50.当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和
    科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
    51.除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
    52.材料与试剂:
    53.75%酒精、医用棉签、医用棉球、lps、pha、25cm2培养瓶、15ml离心管、10ml移液管、1ml移液管、玻片、5ml注射器、移液枪、微量加样器、枪头、漩涡振荡器、离心机、巴斯德滴管。
    54.培养液:培养液a、培养液c、培养液a+lps、培养液a+pha
    55.试剂:秋水仙酰胺、秋水仙碱、0.075mol/lkcl溶液、甲醇、乙酸
    56.在以下的每个实施例中都设置了假阴性对照实验。
    57.实施例1
    58.(1)取标本(来自上海市某医院),2000r/min,离心10min。初步判断为髓系白血病。
    59.取0.08ml标本白细胞层接种在37℃的a培养液中;37℃培养24h。取两个15ml离心管加入秋水仙酰胺80微升,分别加入单细胞中,同时贴上样本标签,分别是实验组和对照组,孵育37℃、40min。
    60.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液。
    61.取出离心管1200r/min,离心10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入10ml的kcl低渗液(0.075mol/l),低渗溶液前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀,静置28min。在对照组中,加入低渗液后静置40min后加入1ml固定液进行预固定。
    62.(3)细胞固定:向单细胞中加入固定剂。
    63.将离心管1500r/min、离心10min。
    64.弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,缓慢加入10ml的固定液(甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1),固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀。
    65.室温静置20min后,1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置15min。1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置15min。1200r/min,离心8min。细胞收完后,放入4℃冰箱中保存。
    66.(4)制片、烤片。
    67.所述制片采用划片方式,对照组采用滴片的方式。
    68.将制备好的玻片放入烤箱中,温度60℃、12h,然后细胞老化过程温度90℃、45min。
    69.(5)染色。
    70.将烘烤好的玻片拿出,待温度降至室温,将单细胞经过胰酶处理后加染缸(含有吉姆萨染液)中。即胰酶储存液8秒,生理盐水冲洗两次后,染色11分钟,再纯水冲洗。
    71.(6)镜检,尽量少滴油在玻片上。
    72.实施例2
    73.(1)取标本(来自上海市某医院),2000r/min,离心10min。初步判断为髓系白血病。
    74.取0.08ml标本白细胞层接种在37℃的a培养液中;37℃培养24h。取两个15ml离心管加入秋水仙酰胺90微升,分别加入单细胞中,同时贴上样本标签,分别是实验组和对照组,孵育37℃、20min。
    75.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液。
    76.取出离心管1300r/min,离心10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入10ml的kcl低渗液,(0.07mol/l)低渗溶液前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀,静置20min,在对照组中,加入低渗液后静置40min后加入1ml固定液进行预固定。
    77.(3)细胞固定:向单细胞中加入固定剂。
    78.将离心管1500r/min、离心10min。
    79.实验组以及对照组:弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,缓慢加入10ml的固定液(甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1),固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀。
    80.室温静置15min后,1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置10min。1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂,混匀,加入固定液量为5ml,静置10min,1200r/min,离心8min。细胞收完后,放入4℃冰箱中保存。
    81.(4)制片、烤片。
    82.所述制片采用划片方式,对照组采用滴片的方式。
    83.将制备好的玻片放入烤箱中,优选地温度60℃、12h,然后细胞老化过程,优选温度90℃、45min。
    84.(5)染色。
    85.将烘烤好的玻片拿出,待温度降至室温,将单细胞经过胰酶处理后加染缸(含有吉姆萨染液)中。即胰酶储存液8秒,生理盐水冲洗两次后,染色11分钟,再纯水冲洗。
    86.(6)镜检,尽量少滴油在玻片上。
    87.实施例3
    88.(1)取标本(来自上海市某医院),2000r/min,离心10min。初步判断为b细胞淋巴瘤,使用a培养液+lps。
    89.取0.08ml标本白细胞层接种在37℃的c培养液中;37℃培养72h。取两个15ml离心管加入秋水仙酰胺100微升,分别加入单细胞中,同时贴上样本标签,分别是实验组和对照组,孵育37℃、25min。
    90.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液。
    91.取出离心管1500r/min,离心10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入8ml的kcl低渗液,(0.08mol/l)低渗溶液前半部分一滴一滴缓慢加入,后板部分逐渐加快速度加入,混匀,静置20min。在对照组中,加入低渗液后静置40min后加入1ml固定液进行预固定。
    92.(3)细胞固定:向单细胞中加入固定剂。
    93.将离心管1500r/min、离心7min。
    94.实验组以及对照组:弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,缓慢加入10ml的固定液(甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1),固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀。
    95.室温静置20min后,1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置12min。1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置12min,1200r/min,离心8min。细胞收完后,放入4℃冰箱中保存。
    96.(4)制片、烤片。
    97.所述制片采用划片方式,对照组采用滴片的方式。
    98.将制备好的玻片放入烤箱中,优选地温度60℃、12h,然后细胞老化过程,优选温度90℃、45min。
    99.(5)染色。
    100.将烘烤好的玻片拿出,待温度降至室温,将单细胞经过胰酶处理后加染缸(含有吉姆萨染液)中。即胰酶储存液8秒,生理盐水冲洗两次后,染色11分钟,再纯水冲洗。
    101.(6)镜检,尽量少滴油在玻片上。
    102.实施例4
    103.(1)取标本(来自上海市某医院),2000r/min,离心10min。初步判断为t细胞淋巴瘤。
    104.取0.08ml标本白细胞层接种在37℃的a培养液+pha中;37℃培养72h。取两个15ml离心管加入秋水仙酰胺85微升,分别加入单细胞中,同时贴上样本标签,分别是实验组和对照组,孵育37℃、30min。
    105.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液。
    106.取出离心管1400r/min,离心10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入12ml的kcl低渗液(0.075mol/l),低渗溶液前半部分一滴一滴缓慢加入,后板部分逐渐加快速度加入,混匀,静置25min。在对照组中,加入低渗液后静置40min后加入1ml固定液进行预固定。
    107.(3)细胞固定:向单细胞中加入固定剂。
    108.将离心管1500r/min、离心5min。
    109.实验组以及对照组:弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,缓慢加入10ml的固定液(甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1),固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀。
    110.室温静置15min后,1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置13min。1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,静置13min,1200r/min,离心8min。细胞收完后,放入4℃冰箱中保存。
    111.(4)制片、烤片。
    112.所述制片采用划片方式,对照组采用滴片的方式。
    113.将制备好的玻片放入烤箱中,优选地温度60℃、12h,然后细胞老化过程,优选温度
    90℃、45min。
    114.(5)染色。
    115.将烘烤好的玻片拿出,待温度降至室温,将单细胞经过胰酶处理后加染缸(含有吉姆萨染液)中。即胰酶储存液8秒,生理盐水冲洗两次后,染色11分钟,再纯水冲洗。
    116.(6)镜检,尽量少滴油在玻片上。
    117.实施例5
    118.(1)取标本(来自上海市某医院),2000r/min,离心10min。初步判断为髓系白血病。
    119.取0.08ml标本白细胞层接种在37℃的a培养液中;37℃培养24h。取两个15ml离心管加入秋水仙酰胺80微升,分别加入单细胞中,同时贴上样本标签,分别是实验组和对照组,孵育37℃、40min。
    120.(2)低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液。
    121.取出离心管1200r/min,离心10min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入10ml的kcl低渗液(0.075mol/l),低渗溶液前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀,静置20min。在对照组中,加入低渗液后静置40min后加入1ml固定液进行预固定。
    122.(3)细胞固定:向单细胞中加入固定剂。
    123.将离心管1500r/min、离心10min。
    124.实验组以及对照组:弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,缓慢加入10ml的固定液(甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1),固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入,混匀。
    125.室温静置20min后,1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂5ml,混匀,静置10min。1200r/min,离心8min。弃上清液,拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀,并涡旋震荡,加入的固定剂,混匀,加入固定液量为5ml,静置10min,1200r/min,离心8min。细胞收完后,放入4℃冰箱中保存。
    126.(4)制片、烤片。
    127.所述制片采用划片方式,对照组采用滴片的方式。
    128.将制备好的玻片放入烤箱中温度60℃、12h,然后细胞老化过程,优选温度90℃、45min。
    129.(5)染色。
    130.将烘烤好的玻片拿出,待温度降至室温,将单细胞经过胰酶处理后加染缸(含有吉姆萨染液)中。即胰酶储存液8秒,生理盐水冲洗两次后,染色11分钟,再纯水冲洗。
    131.(6)镜检,尽量少滴油在玻片上。
    132.以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

    技术特征:
    1.一种单细胞染色体的制片方法,其特征在于,所述单细胞染色体的制片方法至少包括:(1)向单细胞中加入dna合成抑制剂使得其有丝分裂停止,孵育;(2)低渗处理:向单细胞中加入低渗溶液,静置15~30min;(3)细胞固定:向低渗处理过的单细胞中直接加入固定剂,静置;(4)制片、烤片;(5)染色。2.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述dna合成抑制剂选自秋水仙酰胺、秋水仙碱中的任意一种或几种。3.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述dna合成抑制剂加入的量为80~100微升。4.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述低渗溶为kcl溶液。5.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述低渗溶液前半部分缓慢加入,后半部分逐渐加快速度加入。6.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述固定剂选用甲醇和冰醋酸的混合溶液。7.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述固定剂分三次加入,每次加入固定剂后静置。8.根据权利要求7所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:第一次加入固定剂的量为8~12ml;第2次以及第3次加入的固定剂的量都为3~7ml。9.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述烤片包括将制备好的玻片放入烤箱中,先低温烤片再高温烤片。10.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法,其特征在于:所述制片采用划片的方式。

    技术总结
    本发明提供一种单细胞染色体的制片方法,所述单细胞染色体的制片方法至少包括:向单细胞中加入DNA合成抑制剂使得其有丝分裂停止,孵育;低渗透处理:向单细胞中加入低渗溶液,静置15~30min;细胞固定:向单细胞中加入固定剂,静置;制片、烤片;染色。采用本发明所述的制备方法更加简单,获得的制片更加的清晰。获得的制片更加的清晰。


    技术研发人员:王洋
    受保护的技术使用者:湖北欣立达科技有限公司
    技术研发日:2020.11.23
    技术公布日:2022/5/25
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