一种高活力羰基还原酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种高活力羰基还原酶突变体及其应用。


背景技术：

2.4-氯乙酰乙酸乙酯（cobe）可被羰基还原酶（aldehyde reductase， arase）还原成4-氯-3-羟基丁酸乙酯（chbe）。chbe是一种重要的有机合成中间体，其中(r)
-ꢀ
chbe可用于合成l-肉碱，又称为“左旋肉碱”，是一种类维生素营养素，另外还是脂肪代谢过程中一种关键物质，能促进脂肪酸进入线粒体进行氧化分解，有利于促进脂肪代谢平衡。由于左旋肉碱在机体内运送长链脂肪穿过细胞膜入线粒体氧化分解以供给机体能量的载体，从而分解代谢脂肪，因而在应用于制造减肥降脂产品方面具有极大的市场。
3.chbe理论上可以由手性源法、外消旋体拆分法和不对称合成法三种合成方法获得，但由于手性源法和外消旋体拆分法本身固有的缺点，因此利用不对称合成法合成光学活性chbe的主要方法为化学催化合成法和生物催化法。化学法具有原料易得，操作简单，条件温和是的优点，但这种方法属于非均相催化合成反应，导致对映体选择性较低；另外化学方法还有较强毒性，工艺条件不宜控制的缺点。生物催化法制备手性化合物具有反应条件温和，高效率，环境友好和较高选择性的特点而逐渐被人们接受。
4.许多微生物都能还原cobe，但绝大多数微生物的还原产物是s构型，只有少数微生物能获得r型还原产物，如赭色掷孢酵母(sporobolomyces salmonicolor)、麦芽糖假丝酵母(candida maltosa)、卡斯太拉德巴利酵母(debaryomyces castellii)及掷孢圆酵母(torulaspora nagoyaensis)等，但产物的手性选择性即对映体过量(ee)值只有8%～63%。造成ee值低的主要原因是这些微生物中的酶系复杂，既有合成r型也有合成s型chbe的能力，同时酶的转化活力也较低。为了提高生物催化反应的对映体选择性、产率和转化率，即需研究一种新的方法。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术存在上述缺陷，本发明的目的在于提供一种通过突变筛选用于还原4-氯乙酰乙酸乙酯酶的高活力羰基还原酶，用于提高生物催化反应的对映体选择性、产率和转化率。
6.本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：一种高活力羰基还原酶突变体ss-marase，其氨基酸序列如seq di no:1所示。
7.seq id no:1如下所示：mvgtttlntgaslelvgygtwqaapgevgqgvkvaietgsrhldlakvysnqpevgaaikeagvkredlfitsklwnnshrpeqvepalddtlkelgleyldlylihwpvafppegditqnlfpkandkevkldlevslvdtwkamvklldtgkvkaigvsnfdakmvdaiieatkvtpsvnqierhplllqpeliahhkaknihitaysplgnntvgapllvqhpeikriaekngctpaqvliawaivgghsvipksvtpsrigenfkqvslsqedvdavsklgegsgrrrynipctyspkwdinvfgeedekscknavkik
优选地，一种编码如以上所述的高活力羰基还原酶突变体ss-marase的突变体的基因，所述基因核苷酸序列如seq di no:2所示。
8.seq id no:2序列如下所示：atggtagggactactacactgaacacaggcgcgtccttggaattagtaggttatggcacgtggcaggcagcgccgggcgaagttgggcaaggggtgaaggtagcgattgagaccggatcacgtcacttggacttggctaaagtctatagcaaccagccggaagttggcgcggctatcaaggaagctggcgtgaaacgcgaggacctgtttattacctcaaaattgtggaataattcacatcgtcccgaacaagtagaacccgctttagacgatacattgaaagaattgggattggagtaccttgacttatatcttatccactggcctgtggcctttcctccggaaggagacattacccaaaacctgtttcctaaagccaatgataaagaagtcaaactggacttggaggtttccctggtagatacctggaaagcaatggttaagctgttggacacgggtaaagtcaaggccattggggtctcgaattttgatgccaaaatggtagatgcgattatcgaagcgacgaaagtcacaccatcagtaaaccagatcgaacgccacccgctgctgttacagccggaattgatcgctcatcataaggcaaagaacatccatattaccgcgtacagtcccttgggtaacaatacggttggagcgccgctgctggtccagcacccggagatcaagcgcattgcagagaaaaatggttgtacgccagcgcaggtcttaatcgcgtgggctatcgtaggtggtcattccgtaattcctaagtctgtgaccccttcacgtattggtgaaaattttaagcaggtttcccttagccaggaggacgtggatgctgtgagcaaactgggggaggggtccggacgtcgccgctataacatcccatgcacatattctccgaagtgggatattaatgttttcggggaggaagacgagaaaagctgcaaaaatgccgtcaagatcaag优选地，一种含有以上所述的ss-marase突变体酶基因原核表达载体ppet24a-ss marase。
9.优选地，一种可以高效表达ss-marase的重组大肠杆菌e. colibl21(de3)基因工程菌株。
10.优选地，一种如以上所述的高活力羰基还原酶突变体ss marase的制备方法，所述突变体为通过突变和高通量筛选获得来自s. salmonicolor的羰基还原酶，所述羰基还原酶突变体ss-marase包含2个位点的突变：分别为第40位酪氨酸替换为丝氨酸；第176位甘氨酸替换为赖氨酸。
11.优选地，一种如以上所述的高活力羰基还原酶突变体在还原4-氯乙酰乙酸乙酯成(r)
-ꢀ
4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
12.本发明的有益效果：本发明通过易错pcr方法高通量筛选一种还原ecob成(r)-echb的羰基还原酶，使其转化活性显著提升。本发明的突变体ss-marase对ecob的还原活力相对野生酶提升了52%以上，为生物法制备echb有效地降低了成本。
13.以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
14.图1：pet24a-ss-marase质粒图谱。
15.图2：本发明所述的ss-marase突变体sds-page电泳考马斯亮蓝染色结果示意图，分子量在35000d左右。
具体实施方式
16.本方案中，通过随机突变和高通量筛选获得的ss-marase包含两个氨基酸位点的
突变tyr40ser和gly176lys，获得的组合突变体转化活力得到大幅提高。
17.下面通过具体实施例对本发明所述的耐热人溶菌酶的基因工程改造过程进行具体说明。
18.实施例1构建野生型ss-arase表达载体pet24a-ss-arase。
19.野生型ss-arase基因根据e. coli密码子偏爱性优化后再通过人工合成获得，具体序列见seq id no:3，并整合在puc57 simple质粒上。
20.设计引物f1：ggccatatggtagggactactacactgaaca；引物r1：ggcaagctt tcacttgatcttgacggca；seq id no:3序列如下所示：atggtagggactactacactgaacacaggcgcgtccttggaattagtaggttatggcacgtggcaggcagcgccgggcgaagttgggcaaggggtgaaggtagcgattgagaccggataccgtcacttggacttggctaaagtctatagcaaccagccggaagttggcgcggctatcaaggaagctggcgtgaaacgcgaggacctgtttattacctcaaaattgtggaataattcacatcgtcccgaacaagtagaacccgctttagacgatacattgaaagaattgggattggagtaccttgacttatatcttatccactggcctgtggcctttcctccggaaggagacattacccaaaacctgtttcctaaagccaatgataaagaagtcaaactggacttggaggtttccctggtagatacctggaaagcaatggttaagctgttggacacgggtaaagtcaaggccattggggtctcgaattttgatgccaaaatggtagatgcgattatcgaagcgacgggggtcacaccatcagtaaaccagatcgaacgccacccgctgctgttacagccggaattgatcgctcatcataaggcaaagaacatccatattaccgcgtacagtcccttgggtaacaatacggttggagcgccgctgctggtccagcacccggagatcaagcgcattgcagagaaaaatggttgtacgccagcgcaggtcttaatcgcgtgggctatcgtaggtggtcattccgtaattcctaagtctgtgaccccttcacgtattggtgaaaattttaagcaggtttcccttagccaggaggacgtggatgctgtgagcaaactgggggaggggtccggacgtcgccgctataacatcccatgcacatattctccgaagtgggatattaatgttttcggggaggaagacgagaaaagctgcaaaaatgccgtcaagatcaag以puc57 simple-ss-arase为模板，扩增获得约985bp基因条带（条带1）。用ndei和hindiii双酶切pet24a原始质粒，胶回收约5250bp左右条带（条带2）；用ndei和hindiii双酶切条带1，胶回收该条带后，将两个条带（1和2）用t4连接酶连接起来。重组质粒用ndei和hindiii酶切，得到5250bp和985bp的条带为正确重组质粒pet24a-ss-arase，并用引物agccaactcagcttccttt测序验证。
21.实施例2通过随机突变和高通量筛选获得突变的ss-marase。
22.用引物f1和r1进行随机突变，先将引物f1和r1以pet24a-ss-arase为模板进行质粒扩增，扩增产物用ndei和hiniii双酶切后连接到同样双酶切的pet24a质粒上，重组质粒转化大肠杆菌jm109感受态后涂kan抗性平板。平板37℃过夜培养后，用牙签挑取单克隆接种到含200l（50
µ
g/ml卡那霉素）lb培养基的96孔板上。将培养物在37℃下生长过夜，然后全部接种到含600
ꢀµ
l新鲜lb的96孔板中。将孔板在37℃孵育3小时，然后在16℃加入iptg（终浓度，0.1mm）诱导蛋白进一步表达24小时。加入200l含溶菌酶（0.75mg/ml）和dnase i（0.01mg/ml）的缓冲液，然后冻融，以裂解细胞。将平板在4℃以8000转/min离心20分钟，将来自每个孔的50
µ
l样品转移到微量滴定板中，然后通过添加由150
µ
l，100mm磷酸盐缓冲液（ph 6.0），0.2mm nadph和4mm底物组成的反
应混合物来引发还原反应。通过监测340nm下1分钟内nadph吸光度的降低，在30℃分光光度法测定还原酶的活性。
23.标准测定混合物（1ml）由100mm磷酸盐缓冲液（ph 6.0），2.0mm底物，0.1mm nadph和适量的酶组成。1单位酶活性定义为每分钟催化1mol nadph氧化的酶量。
24.选择残留活性比亲本更高的突变体，以在96深孔板中进行重新筛选。通过在100ml摇瓶规模上生长进一步确认了重新筛选后选择的最佳突变体，该突变体含tyr40ser和gly176lys两个氨基酸突变。
25.实施例3将重组菌株e. coli bl21(de3)-pet24a-ssarase和e. coli bl21(de3)-pet24a-ssmarase分别进行3l全自动发酵罐扩大培养。发酵罐中装入含有100μg/ml amp的1.1l发酵培养基，接种量7%，30℃培养，制搅拌转速和通气量维持恒定的溶氧，利用25%的氨水控制ph 7.0，待甘油耗尽后(do反弹)流加含微量元素的生长培养基。当菌浓od
600
达到50时，降温至25℃后采用do-stat反馈补料的策略继续补加补料液，并以恒速流加的方式流加0.8g/l/h 的乳糖进行诱导。大肠杆菌在该发酵条件下发酵35h左右离心得菌体。
26.tb培养基(g/l)：工业级蛋白胨 12，工业级酵母粉 24，k2hpo4·
3h2o 16.43，kh2po
4 2.31，甘油5，ph 7.0。
27.微量元素液(g/l)：feso4·
7h2o 10，znso4·
7h2o 5.25，cuso4·
5h2o 3.0，mnso4·
4h2o 0.5，na2b4o7·
10h2o 0.23，cacl
2 2.0，(nh4)6mo7o
24 0.1。
28.生长培养基(g/l)：甘油 500，mgso
4 30。
29.诱导培养基(g/l)：乳糖 200。
30.实施例4制备ssarase和ssmarase的粗酶液：50ml离心管中加入40ml发酵液，在5000r/min下离心10min，收集细胞，重悬于100mmol/l磷酸钾缓冲液（ph值7.0），加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，冰浴中放置25min后超声破胞。破胞液在12000r/min下离心30min，得到上清液作为粗酶液。
31.cobe转化反应：取一定量菌体用100mmol/l磷酸钾缓冲液（ph值6.0）重悬洗涤三次，将洗涤后的菌体悬浮于100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph值6.0)中，加入cobe和nadph，在100r/min摇床震荡反应6h。反应结束后用乙酸乙酯萃取，取上层有机相分析产物收率及对映体过量值ee，ee的计算公式为ee= [(r-s)/(r+s)]
×
100%。转化率计算公式为r型chbe含量除以底物cobe的量。所测得ssarase和ssmarase对cobe转化率分别为53.2%和80.6%，突变体酶反应的转化率较野生酶提高了52%。
[0032]
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种高活力羰基还原酶突变体ss-marase，其特征在于：其氨基酸序列如seq di no:1所示。2.一种编码如权利要求1所述的高活力羰基还原酶突变体ss-marase的突变体的基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如seq di no:2所示。3.一种含有如权利要求1所述的ss-marase突变体酶基因原核表达载体ppet24a-ss marase。4.一种可以高效表达如权利要求1所述的ss-marase的重组大肠杆菌e. colibl21(de3)基因工程菌株。5.一种如权利要求1所述的高活力羰基还原酶突变体ss marase的制备方法，其特征在于：所述突变体为通过突变和高通量筛选获得来自s. salmonicolor的羰基还原酶，所述羰基还原酶突变体ss-marase包含2个位点的突变：分别为第40位酪氨酸替换为丝氨酸；第176位甘氨酸替换为赖氨酸。6.一种如权利要求1所述的高活力羰基还原酶突变体在还原4-氯乙酰乙酸乙酯成(r)
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4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

技术总结
本发明揭示了一种高活力羰基还原酶突变体及其应用，其氨基酸序列如SEQ DI NO:1所示。本发明通过高通量筛选获得含Tyr40Ser和Gly176Lys两个氨基酸突变的高转化活力的Ss-mArase突变体，用于还原4-氯乙酰乙酸乙酯成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中，该酶转化活力相对于野生型提高了52%以上。对于野生型提高了52%以上。对于野生型提高了52%以上。


技术研发人员：郑华宝 颜骋瑶 陈英洁 孙含璐
受保护的技术使用者：台州华酶生物科技有限公司
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25