一种羊肚菌液体发酵培养方法

1.本发明涉及菌种培养技术领域，具体涉及一种羊肚菌液体发酵培养方法。


背景技术：

2.羊肚菌（morchella spp.）属于子囊菌亚门（ascomycotina），盘菌纲（discomycetes），盘菌目（pezizales），羊肚菌科（morchellacea），羊肚菌属（morchella），民间又名羊肚菜、草笠竹、网兜蘑等，其菌盖表层呈棱脊型网状体，外观像羊肚。羊肚菌富含各类营养物质，且肉质脆嫩，风味独特，而且含有多种抗菌、抗病毒的活性成分和能够抑制肿瘤的多糖，具有调节机体免疫功能、抗疲劳等诸多作用，食药用价值极高，开发应用前景广阔。
3.羊肚菌发酵液菌丝体中蛋白质含量大于20%，其中人体必需氨基酸含量略低于子实体，氨基酸营养价值均衡。羊肚菌发酵液菌丝体中维生素和脂肪酸含量丰富，种类都较多，尤其不饱和脂肪酸的大量存在赋予其降血脂、抗衰老、消除自由基的功效。
4.羊肚菌发酵物中含有大量的多糖，一般认为多糖是起药理作用的主要活性物质，也是羊肚菌可以提高机体免疫力、抗病毒、抗癌及抗疲劳等作用的基本物质成分；此外也发现游离酚、结合酚，其提取物存在细胞抗氧化作用，可以有效的抑制hepg2细胞、caco-2细胞的增殖；有研究证明从羊肚菌发酵菌丝体中提取出的三萜类化合物具有一定的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞的能力羊肚菌栽培费时费力，应用液体深层发酵技术相比于传统的栽培技术可以快速、稳定、规模化的获取药用真菌菌丝体及具有活性的次级代谢产物，如今液体深层发酵生产已成为药用真菌资源开发的重要手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种新的羊肚菌液体发酵培养方法，该方法通过在培养基中加入黄粉虫粉来促进羊肚菌的生长，提高了其生物量，醇类及多糖物质的含量，为羊肚菌进一步开发提供依据。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种羊肚菌液体发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：（1）将购买的黄粉虫粉每份称取3g，称取多份，放在4℃冰箱中保存待用。
7.（2）将0-4℃保存的榆耳菌种进行pda加富斜面培养基培养：a、配制羊肚菌菌种培养基：将按照重量g计的200g土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾2g，酵母浸粉3g，琼脂20g，融化后，定容成1000ml，即得，自然ph值；b、羊肚菌菌种培养基分装，灭菌：将配制好的羊肚菌菌种培养基分装于18mm
×
180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min；
c、冷却，接种：灭完菌后取出羊肚菌菌种培养基，自然冷却至20℃-30℃，在无菌条件下，接入羊肚菌菌种；d、培养：将接好种的羊肚菌菌种培养基置于恒温培养箱里，24℃培养5天，菌丝充分生长；e、挑选：将长势好没有出现退化现象的羊肚菌加富pda斜面菌种选出；（3）羊肚菌液体发酵培养基配置：将按照重量g计的200g土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，蔗糖20g，硫酸镁3g，磷酸二氢钾5g，酵母膏3g，vb1一片，黄粉虫粉3g，融化后，定容成1000ml，自然ph值；然后分装至500ml的三角瓶中，每个三角瓶中装250ml。封口，在121℃条件下，灭菌30min；（4）液体原种制备：将羊肚菌加富pda斜面菌种在无菌操作下接种到羊肚菌液体培养基上，在温度为24℃、转速为140r/min的摇床中培养7d，培养7d后取出，液体菌种发酵质量的检查：a.生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断。80%以上的菌丝球小于4毫米。
8.b. 感官分析：成熟的菌丝球具有羊肚菌的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌通具有酸、臭味道。
9.c.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明其菌种生长不良。
10.（5）羊肚菌液体发酵培养：将将羊肚菌液体原种接入冷却后黄粉虫液体培养基，置于恒温振荡培养器中进行培养，24℃，转速140r/min，培养7d，80%以上的菌丝球4毫米左右结束培养，取出过滤烘干，作为提取羊肚菌多糖或者作为保健食品原料材料。


技术特征：
1.一种羊肚菌液体发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：（1）将购买的黄粉虫粉每份称取3g，称取多份，放在4℃冰箱中保存待用。2.（2）将4℃保存的羊肚菌菌种进行pda加富斜面培养基培养：a、配制羊肚菌菌种培养基：将按照重量g计的200g土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾2g，酵母浸粉3g，琼脂20g，融化后，定容成1000ml，自然ph值；b、羊肚菌菌种培养基分装，灭菌：将配制好的羊肚菌菌种培养基分装于18mm
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180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌30min；c、冷却，接种：灭完菌后取出羊肚菌菌种培养基，自然冷却至20℃-30℃，在无菌条件下，接入羊肚菌菌种；d、培养：将接好种的羊肚菌菌种培养基置于恒温培养箱里，24℃培养5天，菌丝充分生长； e、挑选：将长势好没有出现退化现象的羊肚菌加富pda斜面菌种选出；羊肚菌液体发酵培养基配置：将按照重量g计的200g土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，蔗糖20g，硫酸镁3g，磷酸二氢钾5g，酵母膏3g，vb1一片，黄粉虫粉3g，定容成1000ml，自然ph值；然后分装至500ml的三角瓶中，每个三角瓶中装250ml。3.封口，在121℃条件下，灭菌30min；液体原种制备：将羊肚菌加富pda斜面菌种在无菌操作下接种到羊肚菌液体培养基上，在温度为24℃、转速为140r/min的摇床中培养7d，培养7d后取出，液体菌种发酵质量的检查：生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断。4.80%以上的菌丝球小于4毫米。5.感官分析：成熟的菌丝球具有羊肚菌的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌通具有酸、臭味道。6.c.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明其菌种生长不良。7.羊肚菌液体发酵培养：将羊肚菌液体原种接入冷却后黄粉虫液体培养基，置于恒温振荡培养器中进行培养，24℃，转速140r/min，培养7d，80%以上的菌丝球4毫米左右结束培养，取出过滤烘干，作为提取羊肚菌多糖或者作为保健食品原料材料。8.根据权利要求1所述的羊肚菌pda加富斜面培养方法，其特征在于，步骤（2）所述斜面培养基的组成按照重量g计为：马铃薯200 g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾2g，酵母浸粉3g，琼脂20g，水1000ml，ph自然。9.根据权利要求1所述的羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（3）所述中黄粉虫液体培养基的组成按照重量g计为：马铃薯200g，蔗糖20g，硫酸镁3g，磷酸二氢钾5g，酵母膏3g，vb1一片，黄粉虫粉3g，水1000ml，ph自然。10.根据权利要求1所述的羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，步骤（3）所述羊肚菌液体菌种培养基装入容量为500ml的三角瓶中，每瓶250ml，然后121℃灭菌30min、冷却接种。11.根据权利要求1所述的羊肚菌培养方法，其特征在于，步骤（4）所述中液体原种制备，将羊肚菌加富pda斜面菌种在无菌操作下接种到羊肚菌液体培养基上，在温度为24℃、
转速为140r/min的摇床中培养7d，培养7d后取出，备用。12.根据权利要求1所述的羊肚菌培养方法，其特征在于，步骤（5）液体发酵培养：将羊肚菌液体原种接入冷却后的羊肚菌黄粉虫液体发酵培养基后，置于恒温振荡培养箱里，24℃培养，140r/min，80%以上的菌丝球4毫米左右，取出过滤烘干。

技术总结
本发明公开了一种羊肚菌液体发酵培养方法，该方法选用合适的培养基和培养条件，通过在羊肚菌液体培养基中添加适量的黄粉虫粉提高其生物量以及1-辛烯-3-醇和苯乙醇等醇类物质，同时提高羊肚菌多糖含量，以发酵液为各种食品及保健品原料。野生羊肚菌天然资源有限，环境条件要求苛刻，人工虽有大规模栽培但产量不稳定，产品品质参差不齐，而利用现代液体发酵生物工程技术，不仅大幅度提高菌丝体的积累量，同时产品的标准化程度高，可作为替代途径，且发酵的羊肚菌菌丝体与子实体的营养成分和活性物质含量基本相同，成本低，工艺设备简单。羊肚菌菌丝体的生物量可以达到15.8g/L，醇类含量53.46%，多糖含量0.874g/L。而本专利采用在羊肚菌液体培养基中添加黄粉虫粉的方法，羊肚菌菌丝体生物量可以达到17.5g/100mL，醇类含量达到55.34%，多糖含量可以达到0.923g/L。通过本发明羊肚菌液体菌丝生物量提高了10.75%，醇类含量提高了1.88%，多糖含量提高了0.56%。0.56%。


技术研发人员：杨彤 王建瑞 孙静 徐文 胡宗镇 谭钤文 黄祖灿 杨善祥 曹可卿
受保护的技术使用者：鲁东大学
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25