一种黄曲霉毒素B1的荧光检测卡及其制备方法以及检测粮油中的黄曲霉毒素B1的方法与流程

一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡及其制备方法以及检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法
技术领域
1.本发明涉及检测黄曲霉毒素b1的技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡及其制备方法以及检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素主要是由产毒的黄曲霉(aspergillus flavus)、寄生曲霉(aspergillus parasiticus)和特曲霉(aspergillus)产生。其他霉菌如镰孢霉、青霉、片霉、根霉等也可产生黄曲霉毒素。受黄曲霉毒素污染的粮食及农产品主要有玉米、花生、坚果类食品、大米、乳和乳制品、肉类及水产品等。其中农产品中的花生和玉米污染最严重，给人们的健康带来了极大的危害。
3.目前常用的黄曲霉毒素b1的检测方法包括薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、胶体金免疫层析技术(gict)和酶联免疫吸附技术(elisa)。tlc法定性检测黄曲霉毒素具有通量高、准确、迅速、操作简单且价格低廉有效等优点，因此在许多基层实验室均可开展。但是tlc方法同时存在检测灵敏度不高、样品前处理复杂、重现性差及耗时长等缺点，且该方法操作人员需暴露于大量有害的有机溶剂中及接触高浓度标准品。hplc具有灵敏度高、特异性好、分离能力强以及测定结果准确可靠等特点，常被用于样品中黄曲霉毒素的定量检测，但是该方法需依赖昂贵的仪器设备，同时需要复杂的前处理过程以及专业的操作人员等，因此很难实现现场快速检测。gict方法利用免疫层析法进行定性检测，具有快速简便，应用范围广，多应用于基层和现场使用。elisa根据反应类型可以分为直接法和间接法两种；根据反应原理可分为双抗体夹心法以及竞争法。黄曲霉毒素相对分子量为321至346之间，属于小分子待检物，一般采用竞争法进行黄曲霉毒素的检测。elisa法检测黄曲霉毒素具有灵敏度高、回收率好、特异性强等优点，且可以进行定性和定量分析，得到了相对广泛的应用，但该方法存在假阳性，且需要熟练的技术操作人员等缺点，因此仍不能实现场快速检测。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短；本发明的目的之二在于提供一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡的制备方法，对样品结合垫加入荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物进行包埋处理，得到灵敏度高的荧光检测卡；本发明的目的之三提供一种检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法，限定了样本前处理方法，能有效检测粮油中微量的黄曲霉毒素b1，数据更精准。
5.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
6.一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡，包括壳体和设置在壳体内部的底板，所述壳体包括互相扣合的上壳和下壳，所述底板表面从上到下依次设置有吸水材料、层析膜和样品
结合垫；其中，层析膜表面从上到下依次设有质控线和检测线；上壳设有观察窗和加样孔；样品结合垫设置在加样孔的下方，质控线和检测线设置在观察窗的下方；其中，样品结合垫包埋有荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物，层析膜的质控线包被有黄曲霉毒素b1抗原，检测线包被有羊抗鼠抗体。
7.进一步，所述样品结合垫为玻璃纤维和聚酯膜复合膜。样品结合垫中聚酯膜上包埋有荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物。
8.再进一步，所述荧光微球为镧系荧光微球。
9.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
10.上述的黄曲霉毒素b1的荧光检测卡的制备方法，包括以下步骤：
11.1)荧光微球与黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联，得到荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物；
12.2)将荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物用缓冲液稀释后，得到稀释液，将样品结合垫中的聚酯膜浸泡于稀释液中，取出后经真空冷冻干燥后待用；其中，缓冲液为硼酸缓冲液(bb)和无水海藻糖的混合溶液，稀释范围为20～50倍；
13.3)将黄曲霉毒素b1抗原包被在层析膜的质控线内，将羊抗鼠抗体包被在检测线内，得到层析膜；
14.4)将吸水材料和步骤2)所得的样品结合垫分别搭接在步骤3)所得的层析膜的左右两端，得到搭接后的底板，再将底板与壳体进行组装，得到粮油中的黄曲霉毒素b1的荧光检测卡。
15.进一步，所述荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物的制备方法包括以下步骤：
16.取荧光微球于离心管中，加入水混匀，并超声分散，得到荧光微球分散液；分别加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液和碳二亚胺(edc)溶液，混合混匀后，在转速为10000～15000r/min离心20～30min，去掉上清液，再加入纯水，超声5～10min，得到微球悬液，然后加入黄曲霉毒素b1单克隆抗体，反应后，再加入牛血清白蛋白(bsa)，使得的最终浓度为1％，封闭反应1～2h后，在转速为10000～15000r/min离心20～30min，去除上清液，再加入复溶液，超声1～5min，得到得到荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物，并置于2～8℃冷藏备用。
17.再进一步，所述荧光微球分散液中荧光微球与水的体积比为1：(9～10)，优选1：10；所述荧光微球分散液、n-羟基琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的质量比为100：(5～6)：(5～6)，优选20：1：1；n-羟基琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液浓度均为50～60mg/ml，优选50mg/ml。
18.进一步，所述复溶液包括磷酸盐缓冲液(pb)、蔗糖和吐温混合溶液。
19.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
20.一种检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：
21.1)样品前处理；
22.2)采用上述的检测卡进行检测；
23.3)通过用荧光分析仪读取实验结果。
24.进一步，步骤1)中，样品前处理方法具体步骤为：
25.若样品为油样，称取油样于离心管中，加入提取液并充分混匀，静置后，取下清液备用；
26.若样品为固体，称取固体于离心管中，加入提取液并充分混匀，离心后，取上清液备用。
27.其中，所述提取液包括浓度为15～50％的甲醇水溶液。水优选为超纯水。
28.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
29.(1)本发明的黄曲霉毒素b1的荧光检测卡，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短。样品结合垫中的聚酯膜上包埋有荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物，层析膜的质控线包被有黄曲霉毒素b1抗原，检测线包被有羊抗鼠抗体。该检测卡是采用竞争免疫层析，具体的工作原理为：检测时，待测样品滴加到加样孔中，在毛细管力作用下向前层析，与结合垫处的标记抗体相结合形成待检抗原-标记抗体免疫复合物继续涌动，当到达t线时，未反应完全的标记抗体与t线处的包被抗原进行结合形成标记物抗体-抗原复合物而显色，当样品中待检抗原浓度越高时，其结合的标记抗体越多，t线处捕获的标记抗体越少进而显色强度越弱，反之，当待检抗原减少时，标记抗体被t线处的抗原所捕获，t线显色强度增强。当待检液继续前移，标记物抗体-抗原复合物或未结合游离的标记抗体，与质控线(即c线)上的抗体结合，通过荧光分析仪读取，该检测卡能用于来检测黄曲霉毒素b1残留，检出限为10～20μg/ml。
30.(2)本发明的荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物中的荧光微球选用镧系荧光微球，镧系元素荧光发射波长与激发波长差异巨大，发射波峰窄，可较大避免普通紫外可见光分析法中杂色光的影响。镧系元素特有的超长时间荧光寿命，使检测在关闭激发光源的情况下进行，可很好地解决发光及散射光干扰。
31.(3)本发明的黄曲霉毒素b1的荧光检测卡的制备方法，对样品结合垫加入荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物进行包埋处理，得到灵敏度高的荧光检测卡。
32.(4)本发明的检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法，限定了样本前处理方法，选用了特定的提取液(甲醇的超纯水溶液)，能有效的将样品中的黄曲霉b1残留物提取出来，从而使得测量的数据更精准。
具体实施方式
33.下方，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
34.实施例1
35.一种黄曲霉毒素b1的荧光检测卡，包括壳体和设置在壳体内部的底板，所述壳体包括互相扣合的上壳和下壳，所述底板表面依次设置有吸水材料、层析膜和样品结合垫；其中，层析膜表面依次设有质控线和检测线；上壳设有观察窗和加样孔；样品结合垫设置在加样孔的下方，质控线和检测线设置在观察窗的下方；其中，样品结合垫中的聚酯膜上包埋有荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物，层析膜的质控线包被有黄曲霉毒素b1抗原，检测线包被有羊抗鼠抗体。其中，所述样品结合垫为玻璃纤维和聚酯膜复合膜。所述荧光微球为镧系荧光微球。
36.具体地，黄曲霉毒素b1抗原的制备方法：取包被液(0.02m磷酸盐缓冲液 2％蔗糖)
90ul，再加上黄曲霉b1抗原10ul，轻轻混匀后即可用；
37.羊抗鼠抗体的制备方法：取包被液(0.02m磷酸盐缓冲液 1％蔗糖)98ul，再加上羊抗鼠抗体2ul，轻轻混匀后即可用。
38.黄曲霉毒素b1的荧光检测卡的制备方法，包括以下步骤：
39.1)荧光微球与黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联，得到荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物；
40.2)将荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物用缓冲液稀释后，得到稀释液，将样品结合垫中的聚酯膜浸泡于稀释液中，取出后经真空冷冻干燥后待用；其中，缓冲液为ph＝8.2的0.1m硼酸缓冲液(bb)和浓度为1％的无水海藻糖，稀释倍数为20倍。
41.3)将黄曲霉毒素b1抗原包被在层析膜的质控线内，将羊抗鼠抗体包被在检测线内，得到层析膜；
42.4)将吸水材料和步骤2)所得的样品结合垫分别搭接在步骤3)所得的层析膜的左右两端，得到搭接后的底板，再将底板与壳体进行组装，得到粮油中的黄曲霉毒素b1的荧光检测卡。
43.其中，荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物的制备方法为：取100ul荧光微球于离心管中，加入900ul超纯水混匀，并超声分散5分钟。分别加入50mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)50ul，碳二亚胺(edc)溶液50ul，用混合仪混匀30分钟，12000转/min离心30分钟，去掉上清液加入1ml超纯水，超声5分钟，即得到微球悬液，然后加入0.3mg黄曲霉b1抗体，混合仪上反应1.5h，再加入bsa，使用的最终浓度为1％，封闭反应1h，12000转/min离心20分钟，去除上清液，加入1ml复溶液(10mm pb 1.5％蔗糖 0.5％吐温20)超声2分钟后即可用或至于2～8℃冷藏备用。
44.一种检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：
45.1)样品前处理；
46.2)采用上述的检测卡进行检测；
47.3)通过用荧光分析仪读取实验结果。
48.其中，步骤1)中，样品前处理方法具体步骤为：
49.称取1g油样(食用油)于离心管中，加入3ml提取液并充分混匀，静置2分钟后，取下清液备用。其中，所述提取液包括浓度为20％的甲醇的超纯水溶液。
50.实施例2
51.实施例2的检测卡的结构和制备方法均与实施例1相同。实施例2与实施例1不同之处在于：实施例2的样品是大米，称取1g样品于离心管中，加入3ml提取液并充分混匀，4000r/min离心5min，取下清液备用。
52.其中，荧光微球标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体偶联物的制备方法为：取90ul荧光微球于离心管中，加入900ul超纯水混匀，并超声分散2分钟。分别加入浓度均为60mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)60ul和碳二亚胺(edc)溶液60ul，用混合仪混匀20分钟，15000转/min离心30分钟，去掉上清液加入1ml超纯水，超声10分钟，即得到微球悬液，然后加入0.3mg黄曲霉b1抗体，混合仪上反应2h，再加入bsa，使用的最终浓度为1％，封闭反应1h，15000转/min离心20分钟，去除上清液，加入1ml复溶液(10mm pb 1.5％蔗糖 0.5％吐温20)超声2分钟后即可用或至于2～8℃冷藏备用。
53.实施例3
54.实施例3的检测卡的结构和制备方法均与实施例1相同。实施例3与实施例1不同之处在于：在检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法所用的提取液包括浓度为15％的甲醇的超纯水溶液。
55.实施例4
56.实施例4的检测卡的结构和制备方法均与实施例1相同。实施例4与实施例1不同之处在于：在检测粮油中的黄曲霉毒素b1的方法所用的提取液包括浓度为50％的甲醇的超纯水溶液。
57.实施例5
58.实施例5的检测卡的结构、制备方法和检测方法均与实施例1相同。实施例5与实施例1不同之处在于：其中，偶联物所用的缓冲液为ph＝8.2的0.1m硼酸缓冲液(bb)和浓度为1％的无水海藻糖，稀释倍数为50倍。
59.对比例1
60.对比例1与实施例1的不同之处在于，对比例1的提取液选用浓度为0.75％4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、浓度为0.42％氯化钠和浓度为1.5％甲醇的混合溶液。
61.对比例2
62.对比例2与实施例1的不同之处在于：将实施例1的荧光微球标记物替换为胶体金标记物。其余与实施例1相同。
63.阳性判断测试
64.取等量空白食用油样品，分别添加黄曲霉毒素b1至终浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml，取实施例1～5的检测卡进行检测，通过荧光分析仪读取数据每个样品重复测定三次。根据通过荧光分析仪读取的结果确定阳性判断值，依据为：gb2761-2011《仪器安全国家标准食品中真菌毒素限量》。判断值数据如表1。
65.表1实施例1～5和对比例1的判断值(检出限)数据
[0066][0067][0068]
由表1可知，实施例1～5中，最高检出限为20μg/ml，最低检出限是10μg/ml，高于对比例1的30μg/ml和对比例2的50μg/ml，说明本发明结合特定的检测卡和特定的提取液能有
效提高检测的灵敏度，数据更加精准。
[0069]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。