一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法与流程

一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法
技术领域
1.本发明属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法。


背景技术：

2.鳞球茎茎线虫(ditylenchus dipsaci)隶属于线虫动物门、垫刃目、粒科、茎线虫属，能引起多种植物毁灭性病害，是世界公认的危险性线虫，被列入我国检疫性有害生物名录。鳞球茎茎线虫的寄主范围极广，可寄生约40科500种植物，包括甘薯、马铃薯、燕麦、甜菜、洋葱、水仙、风信子、郁金香、唐菖蒲、朱顶红等。
3.研究表明，当每500g土壤中有10条线虫时就可严重危害洋葱、甜菜、胡萝卜等植物，严重侵染时损失可达60％～80％。在意大利，该线虫为害洋葱，种植之前苗期死亡率达60％；而法国和荷兰大蒜受侵染损失超过90％。
4.目前，鳞球茎茎线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为主，必要时辅以分子生物学方法开展。但常规的特异引物pcr方法对设备要求高：需pcr仪、凝胶电泳仪等设备。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与pcr方法相比，lamp不需要pcr仪，扩增产物通过肉眼观察或浊度仪即可判定结果，适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。
5.因此，建立一种鳞球茎茎线虫的lamp检测方法，以期能够快速、准确、灵敏、无污染的检测该线虫，是十分迫切和必要的。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法；本发明所要解决的第二技术问题在于提供一种用于快速检测鳞球茎茎线虫的lamp引物组；本发明所要解决的第三技术问题在于提供该lamp引物组的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
8.本技术根据ncbi公布的鳞球茎茎线虫及其近似种序列进行了大量的研究、分析：包括线虫属内比较、属间比较，以及其它大量其它物种进行比较。设计了一种快速检测鳞球茎茎线虫的lamp引物组，包括seq id no.1所示的正向外引物f3，seq id no.2所示的反向外引物b3，seq id no.3所示的正向内引物fip，seq id no.4所示的反向内引物bip，seq id no.5所示的正向内引物lf，seq id no.6所示的反向内引物lb。外引物f3/b3、内引物fip/bip能够针对鳞球茎茎线虫的基因上的6个区域进行识别扩增，分别位于3
′
端的f3c区段，f2c区段，f1c区段和5
′
端的b1区段，b2区段，b3区段。通过增加一对环引物lf/lb，促进lamp反应，提升反应速率，缩短反应时间。
9.引物的核苷酸序列具体如下：
10.f3：cgggattgctttttggtgaga；
11.b3：atcaccagtgagcatcgtg；
12.fip：tcgataatgatccggcagcaggtttgaaccgggcaaaagtcg；
13.bip：acactaggaattggacctggctgcggcaccctcttggacta；
14.lf：tcacctacagccaccttgt；
15.lb：gaccttttccgtagaatgaggaat。
16.上述快速检测鳞球茎茎线虫的lamp引物组具有良好的物种特异性，即只有鳞球茎茎线虫样本呈阳性扩增，将其应用于鳞球茎茎线虫的lamp快速检测中，一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，包括以下步骤：
17.1)以待测样品的dna为模板，利用上述鳞球茎茎线虫的lamp引物组进行lamp扩增；
18.lamp扩增的反应体系为：2.5μl待测样品的dna模板、lamp引物组中每条引物各1μl、反应酶1μl、rm反应液12.5μl，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μl；
19.lamp扩增的反应条件为：63℃恒温反应45min；80℃灭活5min结束反应；
20.2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；
21.若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。
22.当在lamp扩增的反应体系中加入荧光染料，能够实现鳞球茎茎线虫的lamp可视化检测，具体包括以下步骤：
23.1)以待测样品的dna为模板，利用鳞球茎茎线虫的lamp引物组进行lamp扩增；
24.lamp扩增的反应体系为：2.5μl待测样品的dna模板、lamp引物组中每条引物各1μl、反应酶1μl、荧光染料1μl、rm反应液12.5μl，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μl；
25.lamp扩增的反应条件为：63℃恒温反应45min；80℃灭活5min结束反应；
26.2)根据扩增产物的显色情况判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；
27.本技术在lamp扩增的反应体系中加入了钙黄绿素；当扩增产物呈绿色，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；当扩增产物呈橙黄色，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。
28.所述的lamp引物组在快速检测植物组织样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。
29.所述的lamp引物组在快速检测混合线虫样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。
30.其他植物线虫包括腐烂茎线虫、茎属线虫、粒属线虫、剪股颖粒线虫、维氏粒线虫、穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、北方根结线虫、无花果孢囊线虫、松材线虫、菊花滑刃线虫、次薄滑刃线虫、柑橘半穿刺线虫、肾形肾状线虫、厚皮拟毛刺线虫、肾形拟毛刺线虫、长岭发垫刃线虫。
31.一种包括上述lamp引物组的快速检测鳞球茎茎线虫的试剂盒，也在本发明的保护范围内。
32.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
33.1)快速、便捷。本发明只需要45min即可完成lamp反应，而且对仪器设备要求低，不需要pcr仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测。
34.2)特异性强。本发明只能够特异地扩增鳞球茎茎线虫，供试其它植物线虫均未发生扩增，具有物种特异性。
35.3)灵敏度较高。检测灵敏度为1/4000条线虫。
36.4)步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增。
37.5)结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察颜色或浊度就能够判断扩增与否，实现了结果可视化，还可采用实时浊度仪等方法判定。
38.6)对人和环境安全，检测过程不需要使用eb等有毒试剂。
附图说明
39.图1为lamp特异性检测la-320c柱状图；图中，block a中1-8号样本分别为鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：仙客来水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：葡萄风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：黄水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；block b中1-8号样本分别为腐烂茎线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：鸢尾；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：狗牙根；来源：美国)；茎属线虫(寄主植物材料：兰花；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：大丽花；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：木薯；来源：迪拜)；茎属线虫(寄主植物材料：蔷薇科植物；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：凤梨种苗；来源：比利时)；block c中1-8号样本分别为粒属线虫(寄主植物材料：鸭茅种子；来源：丹麦)；剪股颖粒线虫(寄主植物材料：匍匐茎剪股颖种子；来源：美国)；维氏粒线虫(寄主植物材料：弯叶画眉草种子；来源：美国)；穿刺短体线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；咖啡短体线虫(寄主植物材料：万年青；来源：日本)；北方根结线虫(寄主植物材料：百子莲；来源：荷兰)；无花果孢囊线虫(寄主植物材料：树苗；来源：卡塔尔)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；block d中1-8号样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：紫苜蓿干草；来源：加拿大)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：柠檬树；来源：荷兰)；肾形肾状线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；厚皮拟毛刺线虫(寄主植物材料：海棠树；来源：德国)；肾形拟毛刺线虫(寄主植物材料：杜鹃；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；去离子水；
40.图2为lamp特异性检测la-320c速率曲线图；图中，block a中ch1-ch8样本分别为鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：仙客来水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：葡萄风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：黄水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；block b中ch1-ch8样本分别为腐烂茎线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：鸢尾；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：狗牙根；来源：美国)；茎属线虫(寄主植物材料：兰花；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：大丽花；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：木薯；来源：迪拜)；茎属线虫(寄主植物材料：蔷薇科植物；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：凤梨种苗；来源：比利时)；block c中ch1-ch8样本分别为粒属线虫(寄主植物材料：鸭茅种子；来源：丹麦)；剪股颖粒线虫(寄主植物材料：匍匐茎剪股颖种子；来源：美国)；维氏粒线虫
(寄主植物材料：弯叶画眉草种子；来源：美国)；穿刺短体线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；咖啡短体线虫(寄主植物材料：万年青；来源：日本)；北方根结线虫(寄主植物材料：百子莲；来源：荷兰)；无花果孢囊线虫(寄主植物材料：树苗；来源：卡塔尔)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；block d中ch1-ch8样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：紫苜蓿干草；来源：加拿大)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：柠檬树；来源：荷兰)；肾形肾状线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；厚皮拟毛刺线虫(寄主植物材料：海棠树；来源：德国)；肾形拟毛刺线虫(寄主植物材料：杜鹃；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；去离子水；
41.图3为lamp特异性检测la-320c扩增曲线图；图中，block a中ch1-ch8样本分别为鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：仙客来水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：葡萄风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：黄水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；block b中ch1-ch8样本分别为腐烂茎线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：鸢尾；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：狗牙根；来源：美国)；茎属线虫(寄主植物材料：兰花；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：大丽花；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：木薯；来源：迪拜)；茎属线虫(寄主植物材料：蔷薇科植物；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：凤梨种苗；来源：比利时)；block c中ch1-ch8样本分别为粒属线虫(寄主植物材料：鸭茅种子；来源：丹麦)；剪股颖粒线虫(寄主植物材料：匍匐茎剪股颖种子；来源：美国)；维氏粒线虫(寄主植物材料：弯叶画眉草种子；来源：美国)；穿刺短体线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；咖啡短体线虫(寄主植物材料：万年青；来源：日本)；北方根结线虫(寄主植物材料：百子莲；来源：荷兰)；无花果孢囊线虫(寄主植物材料：树苗；来源：卡塔尔)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；block d中ch1-ch8样本分别为菊花滑刃线虫(寄主植物材料：紫苜蓿干草；来源：加拿大)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：柠檬树；来源：荷兰)；肾形肾状线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；厚皮拟毛刺线虫(寄主植物材料：海棠树；来源：德国)；肾形拟毛刺线虫(寄主植物材料：杜鹃；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；去离子水；
42.图4为显色法呈现lamp特异性检测的结果；图中，1-32管的样本分别为鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：洋葱；来源：伊朗)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：仙客来水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：葡萄风信子；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：独尾草；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：黄水仙；来源：荷兰)；鳞球茎茎线虫(寄主植物材料：苜蓿草；来源：美国)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：大蒜；来源：韩国)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：酢浆草；来源：荷兰)；腐烂茎线虫(寄主植物材料：鸢尾；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：狗牙根；来源：美国)；茎属线虫(寄主植物材料：兰花；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：大丽花；来源：荷兰)；茎属线虫(寄主植物材料：木薯；来源：迪拜)；茎属线虫(寄主植物材料：蔷薇科植物；来源：日本)；茎属线虫(寄主植物材料：凤梨种苗；来源：比利时)；粒属线虫(寄主植物材料：鸭茅种子；来源：丹麦)；剪股颖粒线虫(寄主植物材料：匍匐茎剪股颖种子；来源：美
国)；维氏粒线虫(寄主植物材料：弯叶画眉草种子；来源：美国)；穿刺短体线虫(寄主植物材料：百合；来源：荷兰)；咖啡短体线虫(寄主植物材料：万年青；来源：日本)；北方根结线虫(寄主植物材料：百子莲；来源：荷兰)；无花果孢囊线虫(寄主植物材料：树苗；来源：卡塔尔)；松材线虫(寄主植物材料：木包装；来源：不详)；菊花滑刃线虫(寄主植物材料：紫苜蓿干草；来源：加拿大)；次薄滑刃线虫(寄主植物材料：大花葱；来源：荷兰)；柑橘半穿刺线虫(寄主植物材料：柠檬树；来源：荷兰)；肾形肾状线虫(寄主植物材料：种苗；来源：越南)；厚皮拟毛刺线虫(寄主植物材料：海棠树；来源：德国)；肾形拟毛刺线虫(寄主植物材料：杜鹃；来源：日本)；长岭发垫刃线虫(寄主植物材料：玉米；来源：中国)；去离子水；
43.图5为lamp灵敏度检测la-320c柱状图；图中，1-6号样本分别为鳞球茎茎线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、50倍、100倍及去离子水；
44.图6为lamp灵敏度检测la-320c速率曲线图；图中，ch1-ch6样本分别为鳞球茎茎线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、50倍、100倍及去离子水；
45.图7为lamp灵敏度检测la-320c扩增曲线图；图中，ch1-ch6样本分别为鳞球茎茎线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、50倍、100倍及去离子水；
46.图8为显色法呈现lamp灵敏度检测的结果；图中，1-6管的样本分别为鳞球茎茎线虫dna系列稀释的模板1倍、5倍、10倍、50倍、100倍及去离子水。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.以下实施例所使用的供试线虫dna均保存在上海海关动植物与食品检验检疫技术中心实验室。线虫dna及其寄主植物材料和来源见表1。
49.表1供试线虫dna及其寄主植物材料和来源
[0050][0051][0052]
以下实施例所使用的主要试剂与仪器为：
[0053]
试剂：loopamp dna扩增试剂盒、loopamp荧光目视检测试剂盒均购自荣研生物科技(中国)有限公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0054]
仪器：lamp实时浊度仪la-320c；旋涡混合器；微量移液器；冰箱；离心机。
[0055]
实施例1
[0056]
1、线虫dna提取
[0057]
线虫dna提取使用dneasy blood&tissue kit(qiagen)试剂盒，提取方法按照试剂盒使用说明书进行。
[0058]
2、lamp引物设计
[0059]
lamp引物设计比常规pcr方法要复杂，一般反应至少包括4条特异性引物：外引物(f3、b3)和内引物(fip、bip)，分别针对基因上的6个区域进行设计，分别位于3
′
端的f3c区段，f2c区段，f1c区段和5
′
端的b1区段，b2区段，b3区段。有时还可通过增加设计两条环引物(f-loop primer、b-loop primer)促进lamp反应，可使反应速度提升1/2～1/3。
[0060]
根据ncbi公布的鳞球茎茎线虫及其近似种序列进行了大量的研究、分析：包括线虫属内比较、属间比较，以及其它大量其它物种进行比较。在此基础上，设计了适用于鉴定鳞球茎茎线虫的lamp特异性检测引物，包括一对外引物f3/b3，-对内引物fip/bip和一对环引物lf/lb。引物序列如下(下列所有引物序列方向均是5
′
端到3
′
端)：
[0061]
f3：cgggattgctttttggtgaga；(如seq id no.1所示)；
[0062]
b3：atcaccagtgagcatcgtg；(如seq id no.2所示)；
[0063]
fip：tcgataatgatccggcagcaggtttgaaccgggcaaaagtcg；(如seq id no.3所示)；
[0064]
bip：acactaggaattggacctggctgcggcaccctcttggacta；(如seq id no.4所示)；
[0065]
lf：tcacctacagccaccttgt；(如seq id no.5所示)；
[0066]
lb：gaccttttccgtagaatgaggaat；(如seq id no.6所示)。
[0067]
3、lamp扩增和检测
[0068]
25μl反应体系如下：2.5μldna模板、每条引物各1μl、反应酶1μl、荧光试剂钙黄绿素1μl、rm反应液12.5μl。用去离子水补足体系。
[0069]
反应条件：63℃恒温反应45min，80℃灭活5min结束反应。
[0070]
分别以实时浊度仪和显色法(即直接目视观察反应管内溶液颜色是否变为绿色)观察检测结果。
[0071]
4、lamp特异性检测
[0072]
将供试23种植物寄生线虫，包括茎属线虫8种(见表1中编号1-16，其中1-7为1种，8-10为1种，11-16为6种)、粒属线虫3种(见表1中编号17-19)、其他植物线虫12种(见表1中编号20-31)的dna作为lamp反应的模板，进行lamp扩增。
[0073]
使用lamp实时浊度仪实时监测lamp反应，63℃运行45min，验证lamp反应的特异性。
[0074]
分别以实时浊度仪和显色法(即直接目视观察反应管内溶液颜色是否变为绿色)观察检测结果。
[0075]
图1-3为实时浊度仪la-320c呈现lamp特异性检测的结果。可见，所有样本中，仅鳞球茎茎线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。
[0076]
图4为显色法呈现lamp特异性检测的结果。可见，第1-7反应管中的溶液呈现绿色(阳性)，其它反应管内溶液均呈现橙黄色(阴性)，也即，所有样本中，仅鳞球茎茎线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。
[0077]
上述结果显示，只有鳞球茎茎线虫样本呈阳性扩增，其它植物线虫样本均未发生扩增。因此，本发明的lamp引物及方法具有良好的物种特异性。
[0078]
5、lamp灵敏度检测
[0079]
供试鳞球茎茎线虫dna进行系列稀释，依次为1倍，5倍，10倍，50倍，100倍，进行灵敏度试验。
[0080]
分别以实时浊度仪和显色法观察检测结果。
[0081]
供试鳞球茎茎线虫dna提取时得到的体积为200μl，用于提取dna的线虫为1条。
[0082]
图5-7为实时浊度仪la-320c呈现lamp灵敏度检测的结果。可见，线虫dna在至50倍稀释度时，依然呈阳性扩增，自100倍稀释度开始未发生扩增。
[0083]
图8为显色法呈现lamp灵敏度检测的结果。可见，第1-4反应管中的溶液呈现绿色(阳性)，其它反应管内溶液均呈现橙黄色(阴性)，也即，线虫dna在至50倍稀释度时，依然呈阳性扩增，自100倍稀释度开始未发生扩增。
[0084]
经计算，建立的鳞球茎茎线虫lamp检测方法检测灵敏度为1/4000条线虫。
[0085]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不局限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以待测样品的dna为模板，利用鳞球茎茎线虫的lamp引物组进行lamp扩增；2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；所述鳞球茎茎线虫的lamp引物组包括一对外引物f3/b3，一对内引物fip/bip和一对环引物lf/lb，引物的核苷酸序列分别如seq id no.1-seq id no.6所示。2.根据权利要求1所述的鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，若发生特异性的扩增，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；若未发生特异性的扩增，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。3.一种鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以待测样品的dna为模板，利用鳞球茎茎线虫的lamp引物组进行lamp扩增，lamp扩增的反应体系中还包括有荧光染料；2)根据扩增产物的显色情况判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫，实现鳞球茎茎线虫的lamp可视化检测；所述鳞球茎茎线虫的lamp引物组包括一对外引物f3/b3，一对内引物fip/bip和一对环引物lf/lb，引物的核苷酸序列分别如seq id no.1-seq id no.6所示。4.根据权利要求3所述的鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，所述荧光染料为钙黄绿素；当扩增产物呈绿色，则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫；当扩增产物呈橙黄色，则表明待测样品中不含有鳞球茎茎线虫。5.根据权利要求3所述的鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，lamp扩增的反应体系为：2.5μl待测样品的dna模板、lamp引物组中每条引物各1μl、反应酶1μl、荧光染料1μl、rm反应液12.5μl，用去离子水补足体系，总反应体系体积为25μl。6.根据权利要求3所述的鳞球茎茎线虫的lamp快速检测方法，其特征在于，lamp扩增的反应条件为：63℃恒温反应45min；80℃灭活5min结束反应。7.用于快速检测鳞球茎茎线虫的lamp引物组，其特征在于，所述引物组包括seq id no.1所示的正向外引物f3，seq id no.2所示的反向外引物b3，seq id no.3所示的正向内引物fip，seq id no.4所示的反向内引物bip，seq id no.5所示的正向内引物lf，seq id no.6所示的反向内引物lb。8.权利要求7所述的lamp引物组在快速检测植物组织样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。9.权利要求7所述的lamp引物组在快速检测混合线虫样品中是否含有鳞球茎茎线虫中的应用。10.一种快速检测鳞球茎茎线虫的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括权利要求7所述的lamp引物组。

技术总结
本发明公开了一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法，属于植物病害的分子生物学检测领域。包括以下步骤：1)以待测样品的DNA为模板，利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增；2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎茎线虫；其中，LAMP引物组包括一对外引物F3/B3，一对内引物FIP/BIP和一对环引物LF/LB，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。本发明快速、便捷；特异性强；灵敏度较高；步骤简单；结果判定简便；同时对人和环境安全，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，能够满足检验检疫一线实验室快速、准确鉴定鳞球茎茎线虫的检测需求。确鉴定鳞球茎茎线虫的检测需求。确鉴定鳞球茎茎线虫的检测需求。


技术研发人员：俞禄珍 宋绍禕 李帅 于翠 王一椒 李丽
受保护的技术使用者：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2022/5/25