一种pH敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法及其应用

一种ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是一种ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.根据国际糖尿病联合会（idf)公布的 《2021idf全球糖尿病地图（第10版）》数据显示，2021年全球成年糖尿病患者人数达到5.37亿（10.5%），折算比例，约十分之一的成年人受到影响。糖尿病带来的健康负担绝对是对个人、家庭和社会的重大挑战。虽然在过去几十年里，通过对糖尿病患者皮下注射胰岛素进行血糖控制，但是长期通过这种痛苦的注射来维持正常血糖，严重影响糖尿病患者日常生活，此外皮下注射时，胰岛素通过外周循环在体内移动，这可以产生外周高胰岛素血症，所以有必要探索一种无创胰岛素输送系统来治疗糖尿病。然而通过口服多肽药物递送仍然是一个挑战，特别是考虑到这些肽的口服生物利用度低。尽管存在这些挑战，但口服途径的优点是显著的，改善了非肠道途径的缺点。在治疗2型糖尿病(t2dm)等慢性疾病方面尤其如此，口服治疗性胰岛素可以显著改善必须定期接受注射胰岛素的糖尿病患者的生活质量；而且口服胰岛素更方便，它可以通过肝门静脉以更高浓度进入肝脏，避免广泛的全身暴露及其相关副作用。
3.然而，在实践中口服胰岛素给药一直难以实施的原因主要有两个，我们针对临床转化复杂性的顺序依次进行讨论。首先，由于胃肠道的酸性环境和丰富的肽酶、蛋白酶，易使蛋白质药物变性或降解，所以口服胰岛素需要在胃肠道环境中得到保护；包括胰岛素在内的生物分子在其功能活性状态下的口服生物利用度最多为1-2%。其次，口服给药需要克服肠道粘液屏障和上皮细胞屏障进入血液，这需要频繁的剂量或持续的生物利用度。
4.目前，口服多肽药物递送系统已受广泛关注，已经开发出许多口服胰岛素聚合物给药系统和不同配方的聚合物。目前，有效的胰岛素口服给药技术大多利用一种阳离子天然聚合物壳聚糖（cs），因其低毒、良好的生物相容性和可获得性等优点而广受欢迎，它不仅能粘附在肠道表面的黏液，从而延长肠道停留时间，还能打开小肠上皮细胞间的紧密连接，递送胰岛素到达血液循环，所以壳聚糖作为口服胰岛素递送载体而受到广泛关注。但是壳聚糖纳米制剂在经过胃组织时会吸附大量蛋白质和其他物质，使到达小肠时壳聚糖的粘液滞留作用和肠上皮细胞间隙打开作用被掩盖。因此实现壳聚糖纳米粒在小肠特异性释放对口服胰岛素递送具有重要意义。
5.天然植物花粉，作为一种丰富的天然可再生生物资源，近年来在生物医学领域的应用越来越受到重视，且被美国食品药品监督管理局fda认定为一种安全材料。天然植物花粉经过化学处理方法提取成无过敏原花粉壳，外层由孢粉素构成，内壁由纤维素组成，且其结构均匀、机械和化学稳定、具有单分散尺寸、孔隙度和大内腔，它们在微胶囊化和药物控释方面显示出了巨大的潜力。许多研究已经证明了花粉在体内作为药物递送载体方面的强大潜力，因为它们的大内腔和坚固的外结构孢粉生物聚合物，被认为是封装药物、蛋白质、疫苗、油等材料的新型运载工具。花粉具有各种各样的形状，选择表面具有刺突状结构的野
菊花花粉相较于普通的球形花粉在小肠的滞留更具有优势。另外，我们发现天然花粉本身就含有碳水化合物，虽然经过一系列化学处理除去该成分，但是花粉作为天然的糖负载器仍然能够吸附碳水化合物，以减少糖类在肠道的吸收，这能从根源上直接减少糖的摄入从而降低血糖，因此，发明一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器势在必行。


技术实现要素：

6.针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法及应用，可有效解决糖尿病的治疗问题。
7.本发明解决的技术方案是，一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法，采用天然绿色、高生物相容性且具有糖吸附性的花粉粒，经过化学处理方法提取无过敏原花粉壳为基本材料，超声搅拌利用酸性条件下γ-聚谷氨酸（γ-pga）丰富的游离羧基与壳聚糖（cs）大量氨基之间强烈的的静电作用力，选择胰岛素作为降血糖药物，自组装制备成纳米凝胶负载于花粉壳内部，构建ph敏感性植物微胶囊纳米粒挤出器。
8.具体包括以下步骤：1）称取20~30g植物花粉溶于300~400ml丙酮中加入1000ml圆底烧瓶，在70℃的油浴锅中搅拌回流12h，待溶液冷却后真空过滤，得到回收花粉；2）将步骤1）回收花粉，用400~500ml 85% (w/w)磷酸溶解并加入1000ml的圆底烧瓶中，在60
°
c油浴锅中搅拌回流12h，花粉溶液经磷酸处理后冷却过滤，并依次用水、丙酮、2m hcl、2m naoh、水、丙酮、70%乙醇洗涤抽滤，得一次抽滤花粉；3）将步骤2）一次抽滤花粉，用300~400ml 6% (w/v) koh溶液溶解并加入1000ml圆底烧瓶中，在80
°
c油浴锅中回流6h，然后将抽滤花粉溶液冷却，用水稀释过滤，然后用水、丙酮和70%乙醇洗涤抽滤，得二次抽滤花粉；4）将步骤3）二次抽滤花粉在60
°
c的烘箱中烘干24h，测定最终干燥花粉的重量，所有干燥花粉在实验使用前均置于室温下保存；5）在室温搅拌（600 r/min）下，将20~30mg壳聚糖（cs）溶解于10~15ml1%醋酸溶液中，然后取步骤4）200~500mg干燥花粉加入上述壳聚糖溶液中，超声使其溶解后搅拌10min后以1500rpm、2min离心，弃上清，用1%醋酸溶液重悬；然后取20~30mgγ-聚谷氨酸（γ-pga）和10~20mg胰岛素溶于5ml去离子水中并加入占总体积1%的醋酸溶液，将γ-pga醋酸溶液缓慢滴加于搅拌中的花粉壳聚糖溶液中，搅拌10~15min后使溶液自然沉降，弃上清后经1%醋酸溶液洗涤3次，离心去除游离，即得包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器。
9.所述的植物花粉为天然野菊花、益母草、向日葵中的一种或两种以上任意比例的混合物。
10.所述的包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的粒径为20μm左右。
11.所述的包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器在制备糖尿病口服药物递送系统中的应用。
12.本发明制备方法简单，所制备的载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器由于其刺突状形貌能有效地保护药物通过崎岖的胃环境，并能迅速运输到肠道环境，ph敏感型植物微胶囊在酸性胃环境下不膨胀，而进入碱性的肠道细胞间隙下能随花粉粒在小肠的蠕动从花粉壳孔径中持续挤出壳聚糖纳米粒，使药物能准确定位在小肠且持续释放胰岛素发挥治疗
作用，是微胶囊纳米挤出器上的一大创新。
附图说明
13.图1为本发明包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器糖吸附能力效果图。
具体实施方式
14.以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
15.实施例1本发明在具体实施时，一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法具体包括以下步骤：1）称取20g天然野菊花花粉溶于300ml丙酮中加入1000ml圆底烧瓶，在70℃的油浴锅中搅拌回流12h，待溶液冷却后真空过滤，得到回收花粉；2）将步骤1）回收花粉，用400ml 85% (w/w)磷酸溶解并加入1000ml的圆底烧瓶中，在60
°
c油浴锅中搅拌回流12h，花粉溶液经磷酸处理后冷却过滤，并依次用水、丙酮、2m hcl、2m naoh、水、丙酮、70%乙醇洗涤抽滤，得一次抽滤花粉；3）将步骤2）一次抽滤花粉，用300ml 6% (w/v) koh溶液溶解并加入1000ml圆底烧瓶中，在80
°
c油浴锅中回流6h，然后将花粉溶液冷却，用水稀释过滤，然后用水、丙酮和70%乙醇洗涤抽滤，得二次抽滤花粉；4）将步骤3）二次抽滤花粉在60
°
c的烘箱中烘干24h，测定最终干燥花粉的重量，所有干燥花粉在实验使用前均置于室温下保存；5）在室温搅拌（600 r/min）下，将20~30mg壳聚糖（cs）溶解于10~15ml1%醋酸溶液中，然后取步骤4）200mg干燥花粉加入上述壳聚糖溶液中，超声使其溶解后搅拌10min后以1500rpm、2min离心，弃上清，用1%醋酸溶液重悬；然后取20mg γ-聚谷氨酸（γ-pga）和10mg胰岛素溶于5ml去离子水中并加入占总体积1%的醋酸溶液，将γ-pga醋酸溶液缓慢滴加于搅拌中的花粉壳聚糖溶液中，搅拌10min后使溶液自然沉降，弃上清后经1%醋酸溶液洗涤3次，离心去除游离，即得包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器。
16.实施例2本发明在具体实施时，一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法具体包括以下步骤：1）共称取25g天然野菊花、益母草花粉溶于300~400ml丙酮中加入1000ml圆底烧瓶，在70℃的油浴锅中搅拌回流12 h，待溶液冷却后真空过滤，得到回收花粉；2）将步骤1）回收花粉，用450ml 85% (w/w)磷酸溶解并加入1000ml的圆底烧瓶中，在60
°
c油浴锅中搅拌回流12h，花粉溶液经磷酸处理后冷却过滤，并依次用水、丙酮、2m hcl、2m naoh、水、丙酮、70%乙醇洗涤抽滤，得一次抽滤花粉；3）将步骤2）一次抽滤花粉，用350ml 6% (w/v) koh溶液溶解并加入1000ml圆底烧瓶中，在80
°
c油浴锅中回流6h，然后将花粉溶液冷却，用水稀释过滤，然后用水、丙酮和70%乙醇洗涤抽滤，得二次抽滤花粉；4）将步骤3）二次抽滤花粉在60
°
c的烘箱中烘干24h，测定最终干燥花粉的重量，所有干燥花粉在实验使用前均置于室温下保存；
5）在室温搅拌（600 r/min）下，将25mg壳聚糖（cs）溶解于12ml1%醋酸溶液中，然后取步骤4）350mg干燥花粉加入上述壳聚糖溶液中，超声使其溶解后搅拌10min后以1500rpm、2min离心，弃上清，用1%醋酸溶液重悬；然后取25mg γ-聚谷氨酸（γ-pga）和15mg胰岛素溶于5ml去离子水中并加入占总体积1%的醋酸溶液，将γ-pga醋酸溶液缓慢滴加于搅拌中的花粉壳聚糖溶液中，搅拌12min后使溶液自然沉降，弃上清后经1%醋酸溶液洗涤3次，离心去除游离，即得包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器。
17.实施例3本发明在具体实施时，一种载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的制备方法具体包括以下步骤：1）共称取30g天然野菊花、益母草、向日葵花粉溶于400ml丙酮中加入1000ml圆底烧瓶，在70℃的油浴锅中搅拌回流12h，待溶液冷却后真空过滤，得到回收花粉；2）将步骤1）回收花粉，用500ml 85% (w/w)磷酸溶解并加入1000ml的圆底烧瓶中，在60
°
c油浴锅中搅拌回流12h，花粉溶液经磷酸处理后冷却过滤，并依次用水、丙酮、2m hcl、2m naoh、水、丙酮、70%乙醇洗涤抽滤，得一次抽滤花粉；3）将步骤2）一次抽滤花粉，用400ml 6% (w/v) koh溶液溶解并加入1000ml圆底烧瓶中，在80
°
c油浴锅中回流6h，然后将花粉溶液冷却，用水稀释过滤，然后用水、丙酮和70%乙醇洗涤抽滤，得二次抽滤花粉；4）将步骤3）二次抽滤花粉在60
°
c的烘箱中烘干24h，测定最终干燥花粉的重量，所有干燥花粉在实验使用前均置于室温下保存；5）在室温搅拌（600 r/min）下，将20~30mg壳聚糖（cs）溶解于15ml1%醋酸溶液中，然后取500mg干燥花粉加入上述壳聚糖溶液中，超声使其溶解后搅拌10min后以1500rpm、2min离心，弃上清，用1%醋酸溶液重悬；然后取30mg γ-聚谷氨酸（γ-pga）和20mg胰岛素溶于5ml去离子水中并加入占总体积1%的醋酸溶液，将γ-pga醋酸溶液缓慢滴加于搅拌中的花粉壳聚糖溶液中，搅拌15min后使溶液自然沉降，弃上清后经1%醋酸溶液洗涤3次，离心去除游离，即得包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器。
18.由上述可以看出，本发明采用天然绿色、高生物相容性且具有糖吸附性的花粉粒，经过化学处理方法提取无过敏原花粉壳为基本材料，超声搅拌利用酸性条件下γ-聚谷氨酸（γ-pga）丰富的游离羧基与壳聚糖（cs）大量氨基之间强烈的的静电作用力，选择胰岛素作为降血糖药物，自组装制备成纳米凝胶负载于花粉壳内部，构建具有双管齐下发挥口服治疗糖尿病作用的ph敏感性植物微胶囊纳米粒挤出器递送系统，并经实验，取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下（以实施例1为例）：一、包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的粒径经实施例1所述方法制备的植物微胶囊纳米挤出器经扫描电镜和透射电镜观察，结果显示粒径均一，平均粒径在20μm左右。
19.二、包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器的形貌经实施例1所述方法制备的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器分别在ph2和ph7.2条件下通过扫描电镜测其形貌，表现为在酸性条件下ph敏感型壳聚糖纳米凝胶负载于花粉壳内部，而在碱性条件下通过花粉孔挤出壳聚糖纳米粒。
20.三、包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器对人结肠癌细胞的毒性
体外细胞毒性试验以人结肠癌细胞为研究对象，设置空白对照组和花粉组，用不同浓度的花粉对细胞进行处理，继续培养24h，通过cck-8法考察其对血管内皮细胞的毒性，结果表明，花粉壳对人结肠癌细胞的活性影响很小。
21.四、包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器在小肠代谢能力考察以空白小鼠作为给药动物模型，通过灌胃给药方式考察花粉壳微胶囊进入小肠的能力。实验设置三组：1、空白组ir783；2、益母草@ir783；3、野菊花@ir783。按照20 mg/只的给药量对各组小鼠进行灌胃给药。给药结束分别于2h、4h、8h、12h、24h后避光解剖小鼠取小肠，用镊子轻轻夹住小肠组织用生理盐水清洗干净，然后用活体成像仪观察小肠荧光强度，明显刺突状的野菊花组荧光强度强。
22.五、包载胰岛素的ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器糖吸附能力的考察为了研究花粉吸附糖而避免糖在肠腔内酶解的效果，在体外pbs中模拟体内过程。对于蔗糖，分别用pbs作为溶剂配制10ml花粉溶液(10mg/ ml)、10 ml双糖溶液(10mg/ ml)并混合，以及5ml α-葡萄糖苷酶溶液(70万u/ ml)。而对照组，双糖与α-葡萄糖苷酶混合，pbs溶液不含花粉，将花粉和糖条件下的混合溶液在37
°
c的摇床上以200 rpm的转速培养4小时，重复3次，然后，使用葡萄糖检测试剂盒，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定每种溶液中的葡萄糖水平，实验结果如图1所示。经反复实验，其他实施例均能取得和实施例1相同或相似的实验结果，不再一一详述，同时，要指出的是，上述仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或者修饰为等同变化的等效实施例，均落在本发明的保护范围内。
23.本发明利用酸性条件下γ-聚谷氨酸（γ-pga）丰富的游离羧基与壳聚糖（cs）大量氨基之间强烈的的静电作用力，选择胰岛素作为降血糖药物，自组装制备成纳米凝胶负载于花粉壳内部，随着 ph逐渐增大，cs的氨基逐渐去质子化不带电，与γ-pga的羧基之间的静电作用减小，导致花粉内部纳米凝胶膨胀以致于从花粉孔挤出不规则大小的纳米粒。花粉利用自身优势作为ph敏感型纳米粒挤出器，可避免内容物胰岛素在经过酸性胃环境中释放，但在经过碱性小肠环境下膨胀持续挤出纳米粒逐渐释放出胰岛素，有效保护被包裹的胰岛素不被胃酸破坏且准确定位在小肠持续发挥治疗作用，同时花粉又是天然的糖负载器能够吸附碳水化合物，以减少糖类在肠道的吸收，利用花粉的独特优势制备成的ph敏感型植物微胶囊不仅可以吸附糖从根源上减少糖的吸收还可以作为保护性载体运输胰岛素发挥降血糖疗效，双管齐下治疗糖尿病。
24.本发明制备方法简单，所制备的载药ph敏感型植物微胶囊纳米挤出器由于其刺突状形貌能有效地保护药物通过崎岖的胃环境，并能迅速运输到肠道环境，ph敏感型植物微胶囊在酸性胃环境下不膨胀，而进入碱性的肠道细胞间隙下能随花粉粒在小肠的蠕动从花粉壳孔径中持续挤出壳聚糖纳米粒，使药物能准确定位在小肠且持续释放胰岛素发挥治疗作用，同时花粉又是天然的糖负载器能够吸附碳水化合物，以减少糖类在肠道的吸收，是微胶囊纳米挤出器上的一大创新，具有良好的应用和推广价值。