OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用

oscrkd1基因在控制水稻抗旱性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及oscrkd1基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的基因的cds序列为seq id no.1所示。


背景技术：

2.植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白和渗透调节物质以适应不利的生长环境(xiong等，cell signaling during cold,drought and salt stress.plant cell.14(suppl),s165
–
s183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。
3.蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质可逆磷酸化是信号转导过程中发生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一个磷酸基团；而蛋白激酶酶通过去除底物的磷酸基团行使相反的功能。在一个酶上添加或去除一个磷酸基团一般会导致酶的激活或失活，正是通过这样的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性调控中发挥着重要的作用，进而调控着酶参与的生物学过程。类受体蛋白激酶(rlks)定位于细胞质膜上，是一种含有氨基末端胞外结构域和羧基末端胞内激酶结构域的跨膜蛋白，通过其胞外结构域结合信号分子，激活胞内激酶结构域，从而完成信号的转导。植物rlks与动物pelle蛋白激酶家族同源，正如动物细胞具有受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶一样，植物rlks也可分为受体蛋白激酶和非受体蛋白激酶，共同命名为“rlks家族”。其中，rlks代表具有细胞外结构域的类受体蛋白激酶，而rlcks只含有细胞质激酶结构域，不具有胞外结构域。已被证实为细胞受体的rlks被认为是受体激酶(rks)。不同的rlks能够通过其胞外结构域识别并接受不同的配体，所以胞外域的氨基酸序列差异较大，如富含亮氨酸重复序列(lrr)、含有功能未知结构域26(duf26)、富含脯氨酸序列(proline-rich)等，根据这一特征，可将rlks分为不同的亚类。其中，富含半胱氨酸类受体激酶(crks)的胞外结构域含有一个或多个duf26，由于duf26内含有富含半胱氨酸的重复序列，所以crks属于富含半胱氨酸的类受体激酶。
4.拟南芥含有46个crks，目前，关于拟南芥crks的研究多集中于生长发育和植物免疫领域。已有研究表明，拟南芥crk突变体普遍存在异常的生长发育表型，包括生长缺陷，早期衰老，花期提前，发芽延迟，子叶细胞密度降低以及根长变长。拟南芥crk2突变体与野生型相比植株矮小，出现明显的生长缺陷；在长日照条件下(16h光照/8h黑暗)，34个crk突变体(crk2，crk3，crk4，crk5，crk28，crk29，crk40等)出现早期衰老的表型，4个crk突变体(crk7，crk16，crk19，crk38)花期提前；通过观察其胚乳破裂情况，发现32个crk突变体(crk2，crk11，crk21，crk25，crk28，crk41，crk45等)出现发芽延迟的现象；11个crk突变体(crk3，crk13，crk25，crk40等)的子叶细胞密度降低；此外，crk28，crk29和crk42突变体还
存在根长变长的表型。除了参与植物生长发育调控，拟南芥crks也与植物抗病性相关。例如，拟南芥crk4，crk5，crk6，crk13，crk20，crk2，crk45和crk36能够参与丁香假单胞杆菌dc3000的免疫；拟南芥crk36也能够与bik1互作，调控气孔免疫；拟南芥crk28能够结合fls2/bak1复合体并增强植物免疫应答。除拟南芥外，小麦，大麦和水稻中也存在与抗病相关的crks。小麦tacrk1对丝核菌属的病原菌禾谷丝核菌有抵抗作用，大麦hvcrk1参与白粉病的抗性调控，水稻oscrk10和oscrk6参与bth诱导的免疫反应。
5.本发明涉及的oscrkd1基因属于水稻crks家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻crks被报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供oscrkd1基因在控制水稻抗旱性改良中的应用，所述oscrkd1基因编码的氨基酸序列为seq no.2所示。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.oscrkd1基因在调控水稻抗旱性中的应用，所述的应用过程包括利用本发明的常规方案，通过控制oscrkd1基因的表达，以控制水稻的抗旱性，所述的oscrkd1基因的序列为seq id no.1所示，编码的蛋白质序列为seq id no.2所示；
9.以上所述的应用中，优选的是通过crispr/cas9的方法，在oscrkd1基因内选取靶位点将该基因敲除，获得的水稻突变体为干旱敏感型水稻；
10.以上所述的应用中，优选的是通过转基因方法，使oscrkd1基因在水稻中超表达，以提高水稻对干旱胁迫耐受能力。
11.以上所述的应用中，优选的所述的干旱敏感型水稻包含seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。
12.携带有本发明oscrkd1基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射或电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998,method for plant molecular biology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plant molecular biology(2nd edition)。
13.本发明oscrkd1基因的表达载体可以转化的宿主是包括水稻等多种植物宿主，用于培育抗旱植物新品种。
14.本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。
15.下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
16.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
17.本发明涉及的oscrkd1基因，属于水稻crks家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻crks被报道。
附图说明
18.图1为水稻oscrkd1 crispr突变体基因编辑情况；
19.oscrkd1-24和oscrkd1-51为2个oscrkd1 crispr突变体纯合无cas9家系。
20.图2为水稻oscrkd1 crispr突变体苗期干旱胁迫表型；
21.oscrkd1-24和oscrkd1-51为2个oscrkd1 crispr突变体纯合无cas9家系，中花11(zh11)作为对照；
22.其中a图和b图为oscrkd1-24家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态；c图和d图为oscrkd1-51家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态。
23.图3为水稻oscrkd1 crispr突变体苗期干旱胁迫存活率统计；
24.oscrkd1-24和oscrkd1-51为2个oscrkd1 crispr突变体纯合无cas9家系，中花11(zh11)作为对照；
25.其中：a图为oscrkd1-24家系苗期干旱胁迫存活率统计情况；b图为oscrkd1-51家系苗期干旱胁迫存活率统计情况。
26.图4为水稻oscrkd1 crispr突变体成株期干旱胁迫表型；
27.oscrkd1-24和oscrkd1-51为oscrkd1 crispr突变体纯合无cas9家系，中花11(zh11)作为对照；
28.a图为oscrkd1-24家系和对照zh11在干旱处理前的生长状态；b图为oscrkd1-24家系和对照zh11在干旱处理下的生长状态；c图为oscrkd1-51家系和对照zh11在干旱处理前的生长状态；d图为oscrkd1-51家系和对照zh11在干旱处理下的生长状态。
具体实施方式
29.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
30.实施例1：
31.oscrkd1基因的分离和克隆
32.设计引物oscrkd1-fl-f：5
’-
atgtcccttctcgtcgtcttgttct-3’、oscrkd1-fl-r：5
’-
ttatctcccttcctcgatggtggtg-3’。以水稻品种日本晴叶片cdna作为模板，使用引物oscrkd1-fl-f和oscrkd1-fl-r扩增oscrkd1基因编码的cds序列，扩增的序列为seq id no:1所示，编码的氨基酸序列为seq id no.2所示。
33.pcr反应条件为：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，33个循环；72℃延伸5min。
34.将扩增获得的pcr产物通过ta克隆的方法连入pgem-t easy载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得oscrkd1的cds序列，其序列为seq id no.1所示，该克隆命名为pgem-oscrkd1质粒。
35.实施例2：
36.oscrkd1基因超量表达载体的构建
37.将实施例1中得到的阳性克隆pgem-oscrkd1质粒用引物oscrkd1-oe-f：5
’-
tacgaacgatagccggtaccatgtcccttctcgtcgtcttgttct-3’和oscrkd1-oe-r：5
’-
ttgcggactctagaggatccttatctcccttcctcgatggtggtg-3’扩增出包含oscrkd1基因完整编码区段的dna片段；
38.pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72
℃延伸5min。将获得的pcr产物通过gibson assembly的方法连入经限制性内切酶kpni和bamhi消化的pu1301载体，对载体进行测序确认，最终获得可用于遗传转化的oscrkd1基因超量表达载体。
39.实施例3：
40.构建oscrkd1 crispr突变体
41.从水稻基因数据库rice data(http://www.ricedata.cn/gene/)中获得oscrkd1基因的基因序列。根据crispr-p v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)挑取两个靶位点。crispr突变体株系的载体oscrkd1-crispr构建可参照相关文献(谢卡斌等.boosting crispr/cas9 multiplex editing capability with the endogenous trna-processing system.pnas.2015,112:3570-3575.)。
42.在crispr-p v2.0网站中选取的靶位点如下：
43.靶位点1：cccctccgtgaagttgcccc
44.靶位点2：ggtcccggccgcagagcgcg。
45.通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将构建好的crispr载体oscrkd1-crispr转入到水稻品种“中花11”(一个常规水稻品种，来自中国农业科学院水稻科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在hiei等人报道的方法(hiei等，efficient transformation of rice，oryza sativa l.，mediated by agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the t-dna，plant j，6:271-282，1994)基础上进行。
46.本实施例的具体遗传转化步骤如下：
47.(1)电转化：将最终crispr目标载体oscrkd1-crispr，用1800v电压，电转化入农杆菌eha105菌株，涂到带有对应抗性选择的la培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。
48.(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(hgcl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25
±
1℃。
49.(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25
±
1℃。
50.(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25
±
1℃。
51.(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的la培养基上预培养农杆菌eha105(来源于cambia，商用菌株，携带有本发明的crispr载体oscrkd1-crispr)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
52.(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至od
600 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，培养温度19-20℃。
53.(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄
青霉素(cn)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。
54.(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
55.(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
56.(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
57.根据上述基因编辑靶位点，设计引物，对突变体中oscrkd1基因的编辑情况进行检测。用引物(oscrkd1-cr-f：5
’-
agaaacacgcactaatcaaacaatc-3’和oscrkd1-cr-r：5
’-
cactcacagatgtctcacgaaaa-3’)。对oscrkd1基因进行特异的pcr扩增，将扩增出来的pcr产物进行测序，同时检测是否含有cas9。测序结果显示(图1)，在oscrkd1-24 crispr纯合无cas9突变体家系(包含seq id no.3所示序列)中，oscrkd1基因内部缺失224个碱基，在oscrkd1-51 crispr纯合无cas9突变体家系(包含seq id no.4所示序列)中，oscrkd1基因在靶位点1处插入1个碱基，在靶位点2处插入1个碱基，即两个突变体家系中oscrkd1基因发生突变。
58.实施例4：
59.oscrkd1 crispr突变体苗期干旱胁迫表型的鉴定
60.将已鉴定好基因型的纯合突变体oscrkd1(oscrkd1-24和oscrkd1-51)和对照野生型(即，非转基因，下同)水稻品种中花11(zh11)催芽后直播到小圆桶中，小圆桶一半种植突变体材料，另一半种植对照野生型水稻品种中花11，各12株。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的水稻植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与zh11对照相比，crispr纯合突变体植株表现为干旱敏感表型(图2)。干旱复水后小圆桶中oscrkd1突变体和对照zh11的存活率统计结果表明，oscrkd1突变体在干旱复水后，存活率显著低于对照野生型zh11(图3)。
61.实施例5：鉴定oscrkd1 crispr突变体成株期干旱胁迫表型
62.为了鉴定突变体成株期的表型，将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土大田中，南方水稻土与粗沙按体积比为1:2混合而成，每行10株每家系种植2行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再复水生长。与zh11对照相比，纯合突变体植株oscrkd1-24和oscrkd1-51表现为干旱敏感表型(图4)。

技术特征：
1.oscrkd1基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的oscrkd1基因编码的蛋白质序列为seq id no.2所示。2.权利要求1所述的应用，所述的oscrkd1基因的序列为seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其应用过程是通过crispr/cas9的方法，将oscrkd1基因敲除，获得干旱敏感型水稻。4.根据权利要求3所述的应用，所述的干旱敏感表型水稻含有seq id no.3或seq id no.4所示的序列。

技术总结
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的OsCRKD1基因。所述OsCRKD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明克隆到控制水稻干旱应答基因OsCRKD1，并对候选基因进行CRISPR突变体表型鉴定，通过苗期及成株期干旱胁迫表型鉴定表明，缺失该基因片段时，水稻耐干旱胁迫能力降低，证实了该基因的功能及应用途径。证实了该基因的功能及应用途径。


技术研发人员：熊立仲 叶田田 肖本泽
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2020.11.20
技术公布日：2022/5/25