一种工程益生菌的构建方法及其应用

1.本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种工程益生菌、构建方法、发酵工艺及其在医药，畜牧业，食品，保健或化工领域中的应用。


背景技术：

2.丁酸，别名正丁酸，酪酸(butanoic acid，简称ba)，是一种常见的短链脂肪酸，分子式为c4h8o2，分子量为88.11，为具有挥发性的无色油状液体，气味难闻且具有一定的刺激性。ba作为短链脂肪酸家族中重要的一员，大量的研究结果显示，丁酸参与众多重要的生理过程，包括参与物质代谢，细胞分化，诱导细胞自噬和凋亡，促进肠道组织发育，增强机体免疫等生物体过程，其对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要的作用。在临床应用上，丁酸可缓解并治疗多种重大消化道慢病，例如，结肠炎症，结肠癌，修复结肠屏障以及应对氧化应激等等，其中，最引人注目的莫过于丁酸良好的抗炎作用，因此其便被人们视为可以缓解并治疗重大肠道炎症，例如炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)的潜在用药之一。
3.丁酸的生产方法有化学合成法，发酵法两种，而目前国内外产业化生产普遍采用以石油为原料的化学合成法，该法又分为正丁醛氧化法和丙烯羰基合成法，前者以正丁醛为原料、氧气或空气作为氧化剂进行氧化反应，并将反应液通入精馏系统分离出丁酸；后者以丙烯和合成气为原料，先羰基化生成丁醛，再经空气氧化生成丁酸，无论是哪种方法，生产投资大，分离步骤操作难度大，且由于使用石油作为初始资源，造成了严重的环境污染。全球变暖的巨大担忧和对丁酸产品的日益增长的需求已经将工业注意力转向丁酸的发酵生产。相比于化学合成法，微生物发酵法生产丁酸具备如下的一些优点：条件温和，工艺简单，能够利用基本的碳源，且克服化学合成法中副产物过多的缺点，对环境影响也较小，优化发酵条件可达到持续生产要求等等是具有重大发展前景且值得开发的生产工艺。
4.梭菌属，严格厌氧细菌，由于其较高的丁酸生产率，长期以来一直被用于丁酸的微生物发酵生产。然而梭菌发酵模式太复杂而无法操作，此外，遗传工具和生理信息的较少可用性也阻碍了基于梭菌的丁酸盐生产过程的进展，细菌发酵丁酸又面临重复性差，产量不稳定，难以工业化等问题。益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物，包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等等，而酵母尤其是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)作为最重要的工业微生物之一，不仅具有工业化应用技术成熟，抗逆性强，为食品安全性gras微生物的优点，同时作为最早实现全基因组测序的微生物菌种，又是分子生物学和遗传学研究的最重要模式生物之一。随着遗传操作手段日益完善，丁酸代谢通路及其调控基因的基础研究愈加深入。遗憾的是目前国内外实现的丁酸微生物发酵都基于梭菌属，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等革兰氏阴性细菌，还没有以益生菌尤其是酵母属为底盘构建丁酸产菌的相关研究，若以合成生物学的手段于益生菌中实现丁酸代谢途径的构建，并利用代谢工程改造益生菌种实现过量生产丁酸，将极大地降低成本，简化工艺，从而为微生物发酵工艺生产丁酸开辟新的途径，结合
no:1所示，以上核苷酸序列均具有编码hbd蛋白的功能。
18.所述第二种基因包括但不限于来源于clostridium acetobutylicum的烯酰辅酶a水合基因crt或来源于faecalibacterium prausnitzii的echa，更优选的，所述第二种基因为crt。
19.烯酰辅酶a水合基因crt，其编码的蛋白质为两个三聚体的二聚化形成的六聚体。crt单体由一个中间结构域(ntd)和一个碳末端结构域(ctd)组成，ntd含有巴豆酶折叠，ctd则由三个a-螺旋组成，此结构域介导了crt的寡聚化。此外，延伸的a-螺旋与相邻单体的ntd相互作用，并因此参与底物结合位点的形成。该酶的底物特异性由a3螺旋区的结构特征和形成烯酰辅酶a结合部位的残基决定。紧密形成的a3螺旋和两个苯丙氨酸残基，phe143和phe233，有助于crt特异性容纳底物。
20.crt编码的核苷酸crt蛋白的氨基酸序列可以在例如genbank:aaa95967.1中找到。
21.crt的核苷酸例如可以在例如genbank:u17110.1的第178-963位中找到。
22.crt的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
23.在一个具体的实施方式中，所述crt的核苷酸序列：1)与seq id no:2具有至少90％的同一性，优选的，与seq id no:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于seq id no:2具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换，3)在严格杂交条件下与seq id no:2能够杂交；4)seq id no:2所示的互补或者简并序列；或者5)如seq id no:2所示，以上核苷酸序列均具有编码crt蛋白的功能。
24.所述第三种基因来源于treponema denticola的反式2-烯酰辅酶a还原基因ter或来源于faecalibacterium prausnitzii的ccra，更优选的，所述第三种基因为ter。
25.反式2-烯酰辅酶a还原基因ter，其编码的蛋白质为sdr酶的典型结构，并包含两个结构域:辅因子结合结构域和底物结合结构域，而活性位点位于两个结构域之间。辅因子结合结构域呈现典型的罗斯曼折叠，由一个六链平行β折叠组成，一侧为五个α-螺旋，另一侧为三个α-螺旋。底物结合结构域由一侧的五个α-螺旋、另一侧的两个α-螺旋、一个短α-螺旋和一个β-发夹以及一个覆盖顶部的β-发夹组成。活性位点中的某些残基在ter酶催化过程中可能起到重要的作用，lys 244在辅因子结合和质子转移中发挥重要作用；tyr235参与底物硫酯羰基的质子化和烯醇盐中间体的稳定；tyr225主要参与底物巴豆基部分的结合和稳定。
26.ter的氨基酸序列可以在例如genbank:q73q47.1的第1-397位中找到。
27.ter的核苷酸序列可以在例如genbank:nc_002967.9的第636109-637302位中找到。
28.ter的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
29.在一个具体的实施方式中，所述ter的核苷酸序列：1)与seq id no:3具有至少90％的同一性，优选的，与seq id no:3具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于seq id no:3具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换，3)在严格杂交条件下与seq id no:3能够杂交；4)seq id no:3所示的互补或者简并序列；或者5)如seq id no:3所示，以上核苷酸序列均具有编码ter蛋白的功能。
30.所述第四种基因来源于faecalibacterium prausnitzii的丁酰辅酶a:乙酸coa转移基因bcoat。
31.丁酰辅酶a:乙酸coa转移基因bcoat，在乙酸存在的条件下，丁酰coa可以在bcoat的作用下，将酰基转移给乙酸进而形成丁酸，并形成副产物乙酰辅酶a。这种丁酸代谢合成耦连乙酸是丁酸高产菌株的重要特征，该耦连作用可以在降低乙酸的浓度同时可以提高丁酸以及乙酰辅酶a的积累量。
32.bcoat编码的蛋白的氨基酸序列可以在例如genbank:qia42843.1中找到。
33.bcoat核苷酸序列可以在例如genbank:cp048437.1中第1460292—1461638找到。
34.bcoat的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
35.在一个具体的实施方式中，所述bcoat的核苷酸序列：1)与seq id no:4具有至少90％的同一性，优选的，与seq id no:4具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；；
36.2)相对于seq id no:4具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换，3)在严格杂交条件下与seq id no:4能够杂交；4)seq id no:4所示的互补或者简并序列；或者5)如seq id no:4所示，以上核苷酸序列均具有编码bcoat蛋白的功能。
37.经过上述丁酸代谢酶的四种外源基因的修饰，改造后的工程益生菌相比于未经基因修饰的工程益生菌，获得生产丁酸的能力，丁酸初步产量可达至少180mg/l，例如193mg/l。
38.优选的，上述四种基因的修饰使得编码酶的活性提高或过表达，更优选的，所述使得编码酶的活性提高或过表达的基因修饰方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或者融合共表达。进一步优选的，所述基因修饰方式包括连接强启动子，更为优选的，所述强启动子包括pgk1启动子、tpi1启动子、tef1启动子、tdh3启动子等等。优选的，上述工程益生菌还包括第五种基因修饰，以增加丁酸合成途径中前体物乙酰乙酰辅酶a的合成的正调控。
39.更优选的，所述第五种基因修饰对内源性基因乙酰辅酶a c-乙酰转移基因(acetyl-coa c-acetyltransferase)erg10进行修饰，进一步优选的，所述第五种基因修饰使得所修饰基因编码酶的活性提高或过表达。乙酰辅酶a在蛋白erg10的作用下聚合形成乙酰乙酰辅酶a，强化乙酰乙酰辅酶a的底物积累量，增加丁酸生成量。
40.erg10可将乙酰基从一个乙酰辅酶a分子转移到另一个分子上，形成乙酰乙酰辅酶a的胞质酶。
41.erg10编码的蛋白的氨基酸序列可以在例如genbank:kaf1901504.1中找到。
42.erg10的核苷酸序列可以在例如genbank:jaaeal010000015.1中第498528—499724找到。
43.erg10的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
44.优选的，上述第五种基因的修饰方式包括但不限于点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或者融合共表达。更优选的，所述基因修饰方式包括连接强启动子，提高拷贝数，更为优选的，所述强启动子包括pgk1启动子、tpi1启动子、tef1启动子、tdh3启动子
等等。
45.经过上述五种基因修饰，改造后的工程益生菌相对于四种基因修饰的工程益生菌，丁酸合成能力得到增强，丁酸产率至少提高了25％，例如25％、28％、30％、32％、35％，40％，甚至更高。
46.优选的，上述工程益生菌还包括第六种基因修饰，以增加丁酸合成途径中前体物乙酰乙酰辅酶a的合成的正调控。
47.更优选的，所述第六种基因修饰采用内源性基因丙二酰辅酶a：acp转移基因(malonyl-coa:acp transferase)mct1，丙二酰辅酶a在mct1对应催化酶的作用下形成乙酰乙酰辅酶a。进一步优选的，所述第六种基因修饰使得所修饰基因编码酶的活性提高或过表达。于第五种基因修饰的基础上进一步强化乙酰乙酰辅酶a的积累量，增加丁酸的生成量。
48.mct1编码的蛋白的氨基酸序列可以在例如genbank:kaf1902377.1中找到。
49.mct1的核苷酸序列可以在例如genbank:jaaeal010000014.1中第762615—763697位找到。
50.mct1的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
51.进一步优选的，上述第六种基因的修饰方式包括但不限于点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或者融合共表达。更优选的，所述基因修饰方式包括连接强启动子，提高拷贝数，更为优选的，所述强启动子包括pgk1启动子、tpi1启动子、tef1启动子、tdh3启动子等等。
52.经过上述六种基因修饰，改造后的工程益生菌相对于上述四种或者五种基因修饰的工程益生菌，丁酸合成能力进一步得到增强，丁酸产率进一步提高至少25％，例如25％、28％、31％、35％，40％、45％，甚至更高。
53.优选的，上述工程益生菌还包括第七种基因修饰，通过增加乙酰辅酶a的调控进而增加乙酰乙酰辅酶a，例如减少乙酰辅酶a的分流量，进一步提高丁酸产量。
54.更优选的，所述第七种基因为苹果酸合成基因(malate synthase)mls1，所述第七种基因修饰使得所修饰基因编码酶的活性降低或表达被抑制。
55.乙酰辅酶a在mls1的作用下可形成苹果酸，由于mls1活性降低或表达被抑制而导致乙酰辅酶a的分流量减少，乙酰辅酶a的积累量增加，进而强化丁酸产量。
56.mls1为苹果酸合成酶基因，参与乙醛酸循环，乙醛酸和乙酰辅酶a可以在mls1作用下形成苹果酸。
57.mls1编码的蛋白的氨基酸序列可以在例如genbank:kaf1903065.1中找到。
58.mls1的核苷酸序列可以在例如genbank:jaaeal010000013.1中第387832—389496位找到。
59.进一步优选的，上述第七种基因的修饰方式包括但不限于点突变，缺失，插入，反义polynucleotides，sirna，microrna，crispr，更为优选的，所述修饰方式包括点突变，缺失或插入一个或者多个核苷酸，点突变如单核苷酸的转换(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或者颠换(嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤)。核苷酸的突变可以导致在其表达的多肽中一个或者多个保守的或者非保守的氨基酸的置换，这种置换可能会导致多肽的构象发生变化，也可能失去部分或者全部功能，可能发生移码突变将导致整个多肽链从该点处开始编码一个完全不
同的多肽，也可能提前形成一个终止密码子使得多肽链残缺，甚至使基因沉默。
60.缺失或插入用核苷酸序列可以用pcr或者化学合成的方法得到，也可以利用细胞复制扩增得到。使基因酶活性或表达被完全抑制的基因修饰还可以通过提供或表达反义寡核苷酸antisense polynucleotides，sirna，microrna或其他可以阻止待修饰基因的mrna翻译为蛋白质的核苷酸的方法来实现。近年来发展的类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)和crisper技术
‑‑
规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)也可以用来失活基因。
61.本发明中提到的使基因酶活性降低或表达被抑制的基因修饰指的是能够使得这种酶/多肽的活性降低(与未经基因修饰的益生菌或野生型益生菌比较)至少95％(例如至少96％，97％，98％99％，或者100％)。
62.在一个具体的实施方式中，所述mls1的核苷酸序列部分或者全部缺失，所述缺失至少8bp，例如8、10、15、20、30、50、80、100甚至更多。优选的，所述mls1的核苷酸缺失部分位于mls1蛋白的功能区，例如对应编码mls1蛋白第170-200位的缺失，更优选的，对应编码mls1蛋白第175-190位的缺失，进一步优选的，对应编码mls1蛋白第179-182位的缺失。
63.上述第七种基因修饰，改造后的工程益生菌相对于上述四种、五种或者六种基因修饰的工程益生菌，丁酸合成能力进一步得到增强，产率提高至少15％、例如15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％，甚至更高。
64.优选的，上述工程益生菌还包括第八种基因修饰，通过增加乙酰辅酶a的调控进而进一步提高乙酰辅酶a的积累量，提高丁酸产量。
65.更优选的，所述第八种基因为乙酰辅酶a合成基因(acetyl coa synthetase)acs1，所述第八种基因修饰使得所修饰基因编码酶的活性提高或过表达。
66.乙酸在acs1对应催化酶的作用下形成乙酰辅酶a，由于acs1活性提高或过表达而导致乙酰辅酶a的底物积累量得到增强，更进一步提高丁酸产量。
67.进一步优选的，上述第八种基因的修饰方式包括但不限于点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或者融合共表达。更优选的，所述基因修饰方式包括连接强启动子，增加拷贝数。
68.acs1编码的蛋白的氨基酸序列可以在例如ncbi reference sequence:np_013254.1中找到。
69.acs1的核苷酸序列可以在例如ncbi reference sequence:nm_001182040.1中找到。
70.acs1的核苷酸序列也可以是上述野生型序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。
71.经过上述第八种基因修饰，改造后的工程益生菌相对于四种、五种、六种或者七种基因修饰的工程益生菌，丁酸合成能力得到进一步增强，产率提高至少10％，例如10％、12％、14％、16％、18|％、20％，甚至更高。
72.上述使得编码酶的活性提高或者过表达的基因修饰方式包括但不限于连接强启动子，提高拷贝数。例如，通过基因修饰使核苷酸序列与一个可表达的强启动子或增强子连接；改变核苷酸序列的启动子或者其他调节因子从而提高其表达水平(例如提高启动子序
列与转录起始因子的结合强度)；通过基因修饰于其他位点插入能够高表达的酵母内源性核苷酸序列表达框，提高相应内源基因的表达量。
73.优选的，上述强启动子包括pgk1启动子、tpi1启动子、tef1启动子、tdh3启动子等等。
74.更优选的，hbd基因连接pgk1启动子；
75.crt基因连接tpi1启动子；
76.ter基因连接pgk1启动子；
77.bcoat基因连接tpi1启动子；
78.erg10基因连接tef1启动子；
79.mct1基因连接tdh3启动子；
80.acs1基因连接tef1启动子。
81.本发明中提到的使基因酶活性提高或过表达的基因修饰指的是一个经过基因修饰的核苷酸序列编码的酶/多肽的活性或对底物的作用效率与野生型相比提高至少20％(例如，至少25％，30％，40％。50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％，100％或者更高)。
82.除了在工程益生菌中必须同时异源表达hbd，crt，ter，bcoat这四种丁酸关键合成基因的组合，不论以何种方式修饰前四种酶基因的表达使得相应酶活性增高或过表达以外，剩余第五到第八个基因可以不分先后，单一或者任一组合的被修饰。所述第五、第六、第七或第八种基因仅仅是为了区分彼此而进行的基因命名，并不表明时间的先后顺序，例如，可以在第一种至第四种基因修饰后，进行第七种基因的修饰，然后进行第五种基因的修饰，又例如可以在第一种至第四种基因修饰后，进行第八种基因的修饰，然后进行第五种基因修饰，等等。优选的，上述工程益生菌包括第五种基因至第八种基因中的一种或多种基因修饰，更优选的，上述工程益生菌包括第五种基因、第七种基因、第八种基因中的一种或多种基因修饰，进一步优选的，上述工程益生菌包括第六基因的修饰。
83.另一方面，丁酸的产生需要乙酰辅酶a在5种关键酶催化下先后经过转移，脱氢，水合，还原，转移这5种反应后形成，因此乙酰辅酶a的积累量能够影响5种酶的表达活性，进而能够影响丁酸的产量。工程益生菌中乙酸作为丁酸的竞争代谢物，过量合成会导致乙酰辅酶a的旁路代谢分流量增加，进而影响丁酸的产量。本发明描述的第四种基因酶可以将前底物丁酰辅酶a的酰基载体转移至乙酸，形成终产物丁酸的同时利用乙酸形成乙酰辅酶a，从而降低乙酸含量，增加乙酰辅酶a的积累量。为了进一步提高乙酰辅酶a的产量，本发明描述的第五种基因酶可以降低苹果酸合成率，降低乙酰辅酶a旁路代谢分流量，进而提高积累量；第六种基因酶可以强化乙酸到乙酰辅酶a的代谢量，降低竞争代谢物乙酸产量的同时进一步强化乙酰辅酶a的积累量，从而进一步强化丁酸产量。
84.进一步的，所述基因的修饰方式包含使用选择标记基因。优选的，所述选择标记基因包括但不限于ura3,leu2,his3,trp1。更优选使用ura3选择标记基因。更进一步优选的，所述基因的修饰方式是循环使用选择标记基因而不保留选择标记基因。
85.本发明所描述的工程益生菌，较未经基因修饰的酵母获得一定水平的丁酸合成能力，且合成水平得到了显著的增强。最优的方案中，本文描述的工程益生菌的丁酸产量可达465mg/l。
86.优选的，所述的工程益生菌包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆
菌、放线菌等等，更优选的，所述酵母菌包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，巴斯德酵母(saccharomyces pastorianus)，树干毕赤酵母(pichiastipitis)，saccharomyces bayanus和休哈塔假丝酵母(candida shehatae)中的任意一种。更优选的，所述酵母菌为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
87.本发明的第二方面，提供一种上述工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：
88.1)在工程益生菌中引入丁酸代谢的四种外源基因的修饰，使得工程益生菌以乙酰乙酰辅酶a为底物的基础上依次反应顺序合成3-羟基丁酰辅酶a，巴豆酰辅酶a，丁酰辅酶a，丁酸，完成丁酸合成的4步反应，所述四种外源基因包括：第一种基因编码3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶蛋白(3-hydroxybutyryl-coa dehydrogenase，hbd)，第二种基因编码烯酰辅酶a水合酶蛋白(enoyl-coa hydratase，crt)，第三种基因编码反式2-烯酰辅酶a还原酶蛋白(trans-2-enoyl-coa reductase，ter)，第四种基因编码丁酰辅酶a:乙酸coa转移酶蛋白(butyryl coa:acetate coa transferase，bcoat)。
89.优选的，所述构建方法中还包括2)对工程益生菌引入第五种基因修饰、第六种基因修饰、第七种基因修饰、和/或第八种基因修饰，其中，第五种，第六种基因修饰，以增加丁酸合成途径中前体物乙酰乙酰辅酶a的合成的正调控。第七种基因修饰，减少乙酰辅酶a分流量，增加乙酰辅酶a的积累量，调控乙酰乙酰辅酶a的积累，使得丁酸合成分泌上升。第八种基因修饰，增加乙酰辅酶a的积累量，强化工程益生菌丁酸合成能力。
90.更优选的，所述第五种基因修饰对内源性基因乙酰辅酶a c-乙酰转移基因(acetyl-coa c-acetyltransferase)erg10进行修饰；第六种基因修饰对内源性基因丙二酰辅酶a：acp转移基因(malonyl-coa:acp transferase)mct1进行修饰；所述第七种基因修饰对苹果酸合成基因(malate synthase)mls1进行修饰；所述第八种基因修饰对内源性乙酰辅酶a合成基因(acetyl coa synthetase)acs1进行修饰。
91.更优选的，所述第一种至第六种和第八种基因修饰使修饰后基因编码酶的活性提高或过表达，进一步优选的，所述使得编码酶的活性提高或者过表达的基因修饰方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或者融合共表达。
92.进一步优选的，上述强启动子包括pgk1启动子、tpi1启动子、tef1启动子、tdh3启动子等等。
93.更优选的，第七种基因修饰使修饰后基因编码酶的活性降低或表达被抑制，上述第七种基因的修饰方式包括但不限于点突变，缺失，插入，反义polynucleotides，sirna，microrna，crispr，更为优选的，所述修饰方式包括点突变，缺失或插入一个或者多个核苷酸，点突变如单核苷酸的转换(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或者颠换(嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤)。核苷酸的突变可以导致在其表达的多肽中一个或者多个保守的或者非保守的氨基酸的置换，这种置换可能会导致多肽的构象发生变化，也可能失去部分或者全部功能，可能发生移码突变将导致整个多肽链从该点处开始编码一个完全不同的多肽，也可能提前形成一个终止密码子使得多肽链残缺，甚至使基因沉默。
94.缺失或插入用核苷酸序列可以用pcr或者化学合成的方法得到，也可以利用细胞复制扩增得到。使基因酶活性或表达被完全抑制的基因修饰还可以通过提供或表达反义寡核苷酸antisense polynucleotides，sirna，microrna或其他可以阻止待修饰基因的mrna翻译为蛋白质的核苷酸的方法来实现。近年来发展的类转录激活因子效应物核酸酶
(transcription activator-like effector nuclease，talen)和crisper技术
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规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)也可以用来失活基因。
95.经所述修饰后，内源性第七种基因的核苷酸序列部分或者全部缺失，所述缺失至少8bp，例如8、10、15、20、30、50、80、100甚至更多。优选的，所述mls1的核苷酸缺失部分位于mls1蛋白的功能区，例如对应编码mls1蛋白第170-200位的缺失，更优选的，对应编码mls1蛋白第175-190位的缺失，进一步优选的，对应编码mls1蛋白第179-182位的缺失。
96.进一步优选的，所述步骤1)包括：(1-1)构建包含第一种和/或第二种基因的载体；(1-2)将步骤(1-1)的载体导入到工程益生菌，获得包含第一种和/或第二种基因的工程益生菌；(1-3)构建包含第三种和/或第四种的载体；(1-4)将步骤(1-3)的载体导入到步骤(1-2)的酵母菌种，获得包含第一种、第二种、第三种和第四种基因的工程益生菌。
97.所述步骤2)包括：(2-1)构建包含第五种、第六种、第七种和/或第八种基因的载体；(2-2)将步骤(2-1)的载体导入到步骤1)获得的工程益生菌，获得包含多种基因修饰。
98.优选的，所述载体包含调控元件，进一步优选的，所述调控元件包括启动子，终止子等等。
99.更优选的，上述载体包括：
100.hbd基因连接pgk1启动子(第一种基因)；
101.crt基因连接tpi1启动子(第二种基因)；
102.ter基因连接pgk1启动子(第三种基因)；
103.bcoat基因连接tpi1启动子(第四种基因)；
104.erg10基因连接tef1启动子(第五种基因)；
105.mct1基因连接tdh3启动子(第六种基因)；和/或，
106.acs1基因连接tef1启动子(第八种基因)。
107.进一步的，所述载体还包括左同源臂序列和右同源臂序列。优选的，所述导入包括利用crispr/cas9进行基因编辑。更优选的，使用grna和上述载体一起进行导入。
108.在一个具体的实施方式中，所述步骤1)包括：(1-1)构建包含第一种和第二种基因的载体v
h c
，所述载体依次包括h1左同源臂、pgk1启动子、hbd基因、pgk1终止子、tpi1启动子、crt基因、adh1终止子和h2右右同源臂；(1-2)将步骤(1-1)的载体导入到工程益生菌，获得包含第一种和第二种基因的工程益生菌；(1-3)构建包含第三种和第四种的载体v
t b
，所述载体依次包括h1左同源臂、pgk1启动子、ter基因、pgk1终止子、tpi1启动子、bcoat基因、adh1终止子、h2右同源臂；(1-4)将步骤(1-3)的载体导入到步骤(1-2)的酵母菌种，获得包含第一种、第二种、第三种和第四种基因的工程益生菌。
109.所述步骤2)包括：(2-1)构建包含第五种、第六种、第七种和/或第八种基因的载体；(2-2)将步骤(2-1)的载体导入到步骤1)获得的工程益生菌，获得包含多种基因修饰。
110.更优选的，所述包含第五种基因的载体ve依次包括h1左同源臂、tef1启动子、erg10基因、tef1终止子、h2右同源臂；
111.所述包含第六种基因的载体vm依次包括h1左同源臂、tdh3启动子、mct1基因、tdh3终止子、h2右同源臂；
112.所述包含第五种和第六种基因的载体v
e m
依次包括h1左同源臂、tef1启动子、
erg10基因、tef1终止子、tdh3启动子、mct1基因、tdh3终止子、h2右同源臂；
113.所述包含第七种基因的载体v
ml
依次包括h1左同源臂、部分或者全部缺失的供体片段、h2右同源臂；
114.所述包含第八种基因的载体va依次包括h1左同源臂、tef1启动子、acs1基因、tef1终止子、h2右同源臂。
115.除了在工程益生菌中必须同时异源表达hbd，crt，ter，bcoat这四种丁酸关键合成基因的组合，不论以何种方式修饰前四种酶基因的表达使得相应酶活性增高或过表达以外，剩余第五到第八个基因可以不分先后，任一组合的被修饰。所述第五、第六、第七或第八种基因仅仅是为了区分彼此而进行的基因命名，并不表明时间的先后顺序，例如，可以在第一种至第四种基因修饰后，进行第七种基因的修饰，然后进行第五种基因的修饰，又例如可以在第一种至第四种基因修饰后，进行第八种基因的修饰，然后进行第五种基因修饰，等等。
116.进一步优选的，核苷酸序列(如表达载体)可以通过多种方法导入到益生菌细胞或者其他宿主细胞中。这些方法包括(不局限于此)电穿孔法，磷酸钙沉淀法，热激法，脂质转染法，显微注射法，氯化锂法，醋酸锂法和病毒介导基因转移法。
117.除了益生菌细胞，宿主细胞还可以是任何可以用于标准分子生物学操作并产生核苷酸和多肽的细胞。包括但不仅限于细菌细胞(如e.coli)，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞(如cho或cos细胞)。益生菌细胞包括本文中描述的工程益生菌细胞。本文所指的宿主细胞不仅包括对其进行核苷酸转导的母细胞，还包括其子细胞。
118.在本发明的基因修饰过程中，供转入益生菌细胞筛选使用的选择标记基因包括但不仅限于益生菌可用的任何营养缺陷型基因，如ura3、leu2、his3、trp1、lys2。为了能进行尽可能多的基因修饰，同时避免营养缺陷型基因表达本身带来的可能干扰，优选能方便地被反复、循环使用的ura3基因。更进一步优选的，ura3等选择标记基因被循环使用而不保留在被基因修饰的菌株中。
119.虽然本发明所应用的策略针对s.cerevisiae菌株的基因和多肽，但是相同的策略同样适用于其它可发酵的酵母,优选能够进行工业发酵的工程益生菌。除了s.cerevisiae菌株外，合适的菌株还包括巴斯德酵母(saccharomyces pastorianus)、树干毕赤酵母(pichia stipitis)、saccharomyces bayanus和休哈塔假丝酵母(candida shehatae)。同样，这些策略也适合于其他益生菌，例如益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等，可以根据这些益生菌中内源基因的不同，而导入丁酸合成的其他外源基因，包括上述第一至第八基因的一种或者多种基因，并可根据益生菌的不同而对密码子进行优化。在这些菌株中通路或者基因名称或许稍有不同，但是可以应用同样的策略和技术来修饰相应的通路和同源基因。此处描述的基因工程工程益生菌是本领域的研究人员所熟知的。
120.本发明第三方面，提供一种利用上述的工程益生菌生产丁酸的方法，所述方法包括在培养基中培养上述工程益生菌。
121.优选的，所述方法中培养基包括碳源，氮源，微量元素。
122.更优选的，所述方法中，培养基包括葡萄糖浓度为16-25g/l,酵母提取物为8-12g/l，蛋白胨为15-25g/l。
123.本发明第四方面，提供一种利用上述的工程益生菌发酵生产的发酵产物。
124.优选的，所述发酵产物包括上述工程益生菌和分泌的丁酸。
125.更优选的，所述丁酸含量至少180mg/l，例如190、200、230、250、280、300、320、350、380、400、450、460mg/l以上，甚至更高。
126.本发明第五方面，提供上述任一的工程益生菌或者发酵产物在生产丁酸中的用途。
127.本发明第六方面，提供上述任一的工程益生菌或者发酵产物在医药，畜牧业，食品，保健品或化工领域的应用。
128.优选的，所述应用为作为畜牧业的饲料或饲料添加剂。
129.本发明第七方面，提供上述任一的工程益生菌或者发酵产物在制备医药，食品，保健品或化工等领域的产品中的应用。
130.本发明第八方面，提供一种制备医药，畜牧业，食品，保健品或化工领域的产品的方法，所述方法包括利用上述任一的工程益生菌或者所述任一的发酵产物制备上述产品。
131.优选的，所述方法包括将所述工程益生菌或者发酵产物进一步加工成任何其他剂型，更优选的，所述剂型包括可食用的剂型，进一步优选的，所述剂型为粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，或液体形式。更优选的，为低温干燥或喷雾干燥方法制备粉剂。
132.本发明第九方面，提供一种制剂，所述制剂包含上述任意的工程益生菌或上述任意的发酵产物。
133.优选的，所述制剂包括任意的剂型，更优选的，所述剂型包括可食用的剂型，进一步优选的，所述剂型为粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，或液体形式。更优选的，为低温干燥或喷雾干燥方法制备粉剂。
134.若非特殊说明，本文涉及的所有专业术语、技术概念都是本领域技术人员所熟知的。尽管有多种类似或等效的方法可以用来构建和测定本发明中涉及的工程益生菌,下文中将描述一种合适的方法和材料。这些材料、方法和例子只是作为举证，它不在任何程度上限制本发明。本文中提到的所有文献、专利和其他参考资料均尊重其完整性。本发明涉及的方法和材料将在下文中与详细说明和图表一同给出。
135.本发明的优点和益处
136.1、本发明首次将产丁酸途径引入到工程益生菌，所得重组工程益生菌具有低营养需求、容易培养、适合大规模发酵生产丁酸并易于实现产业化的性能；
137.2、通过基因工程手段进行相关基因修饰，在引入4种外源性关键丁酸合成基因时，赋予工程益生菌初步合成丁酸的能力，在加速丁酸前体物乙酰乙酰辅酶a的代谢流的同时，减少乙酰乙酰辅酶a前体关键物质乙酰辅酶a旁路代谢分流通量，强化乙酸到乙酰辅酶a的代谢通量，提高丁酸及其前体物质乙酰乙酰辅酶a的胞内外运输和积累，使所得重组工程益生菌能稳定，持续，高效生产丁酸，产量可达400mg/l。
138.3、本发明将各个基因的核苷酸序列进行优化，使其更适合在工程益生菌中表达，具有更高的蛋白活性，并进一步提高终产物丁酸的产量。在修饰四种基因后，丁酸产量可以达到193mg/l，增加第五种到第八种基因修饰后，丁酸产量可高达465mg/l。
139.4、本发明克服了传统化学合成法工艺复杂、原料昂贵、副产物多、环境污染严重的缺点，具有工艺操作简单、原料成本低、安全环保、可工业化生产的优点，为微生物发酵生产丁酸开辟了新的途径，结合益生菌的其它促进营养物质的消化吸收、提高机体免疫力等功
能，将推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，能广泛应用于医药、食品或化工领域,具有重要的经济价值和社会意义。
附图说明
140.图1为载体构建示意图，上图为单基因载体构建示意图，下图为双基因载体构建示意图。
141.图2为cas9质粒构建示意图。
142.图3为grna质粒构建示意图。
具体实施方式
143.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示,其并不作为对本发明的限制。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不偏离于本发明范围的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
144.实施例中所涉及的几种培养基如下：
145.(1)lb(luria bertani)
146.液体：酵母粉(w/v)：0.5％，胰化蛋白胨(w/v)：1％，nacl(w/v)：1％，调节培养基ph至7.5，于121℃灭菌15min。
147.固体：在液体lb培养基中加入终浓度1.5％(w/v)的琼脂粉，灭菌后稍微冷却即可倒平板。
148.lba培养基：灭菌后的lb液体或固体培养基中添加氨苄青霉素，氨苄青霉素的常规使用浓度为100μg/ml。
149.(2)ypd培养基
150.液体：酵母提取物(w/v)：1％，蛋白胨(w/v)：2％，于121℃灭菌15min后将培养基冷却至不烫手，向其中添加40％(w/v)葡萄糖母液(需单独灭菌：115℃，25min)，使培养基的葡萄糖终浓度为2％(w/v)。
151.固体：在ypd液体培养基基础上加入琼脂粉使其终浓度1.5％(w/v)，灭菌冷却后即可倒平板。
152.(3)完全极限省却成分培养基(cm)
153.ynb(w/v)：0.67％，
154.dropout powder(w/v)：0.083％，其所含组分的终浓度如下(mg/l)：
155.苏氨酸150、丝氨酸150、缬氨酸150、谷氨酸10、天冬氨酸100、苯丙氨酸50、赖氨酸30、酪氨酸30、异亮氨酸30、精氨酸20、甲硫氨酸20；
156.其它营养成分(mg/l)：
157.组氨酸100、亮氨酸100、色氨酸100、尿嘧啶50、腺嘌呤50；
158.液体培养基ph范围为5.6～5.8；固体培养基ph范围为6.5左右。
159.(4)cmg培养基
160.液体培养基：在cm的培养基中加入终浓度为2％的葡萄糖母液，即为cmg培养基；
161.固体培养基：在液体cmg培养基中按终浓度1.5％加入琼脂粉(w/v)。
162.cmg hyb 300固体培养基：在cmg液体或固体培养基中添加适量的潮霉素b，配制成抗生素筛选平板。
163.此外在cm培养基基础上删减部分氨基酸可配制成营养缺陷型筛选培养基/平板。
164.(5)5-氟乳清酸培养基(5
′‑
foa)
165.i、溶液i：制备50ml 5
′‑
foa下列溶液，其中包括：ynb aa：0.7g，dropout powder：0.085g，5
′‑
foa：0.1g，尿嘧啶：10mg，腺嘌呤：5mg，亮氨酸：20mg，组氨酸：15mg，色氨酸：10mg，葡萄糖：2g；于45℃溶解充分，过滤除菌后保存。
166.ii、溶液ii：制备50ml终浓度为3％的琼脂粉溶液，121℃灭菌15min后，将其冷却至45℃。将溶液i与溶液ii小心混匀，避免产生气泡，快速倒入无菌培养皿中，冷却成型后备用。
167.实施例中所涉及的引物序列见表1
168.表1：引物序列
169.170.171.[0172][0173]
实施例1：构建插入hbd,crt外源基因的酵母菌株
[0174]
利用crispr/cas9系统向酵母染色体中同时插入hbd,crt基因。首先利用醋酸锂法将cas9蛋白的载体质粒ycplac33-cas9转化酵母感受态细胞后，以ura3为筛选标记筛选出带有cas9质粒的阳性酵母转化子。接着构建用于引导cas9蛋白在特定位点切割的prs42h-ghbd/crt以及用于修补dna链的供体片段，将grna表达质粒以及供体片段转化酵母感受态细胞，对以ura3以及潮霉素作为双重筛选标记筛选出的阳性转化子进行pcr验证，筛选出发生同源重组的酵母菌株by4741-hbd-crt
[0175]
构建用引物见表1，示意图见图1-图3。
[0176]
一：prs42h-ghbd/crt质粒构建
[0177]
本研究使用的是经noti酶切线性化的prs42h-grna-noti质粒为模板，使用表1中ipcr-chr iv site3-up，ipcr-chr iv site3-dw所示序列为上下游引物对线性化模板进行反向pcr，诺唯赞公司生产的dna聚合酶，54℃退火15秒，72℃延伸4min，共30个循环，得到6600bp的pcr片段。利用无缝重组试剂盒对pcr片段进行自连反应，使得该片段两端同源序列相连，形成可特异性识别相应位点的prs42h-grna-orf质粒(orf为靶向位点的基因)。取10v转化至大肠感受态，并于筛选平板(lb amp100)上长出阳性转化子后，用lba液体培养基扩培转化子菌落，37℃、230rpm过夜摇培，提取质粒进行测序验证。得到质粒prs42h-ghbd/crt。所述grna序列其结构如seq id no:77的所示。
[0178]
二：hbd/crt供体片段构建
[0179]
于ncbi查询来源于clostridium acetobutylicum的hbd/crt核苷酸序列，相关基因序列交由金唯智生物公司进行基因合成，并进行密码子偏向优化。利用表1中chr iv site3 h1-up，chr iv site3 h1-dw，以酵母染色体为模板进行pcr反应，得到h1左同源臂片段，其结构如genbank:bk006938.2的第544265-544486位所示；利用表1中chr iv site3 ppgk1-up，chr iv site3 ppgk1-dw，以酵母染色体为模板进行pcr反应，得到pgk1启动子片段，其结构如genbank：bk006937.2的第137146-137745位所示；利用表1中hbd-up，hbd-dw，
以合成基因为模板进行pcr反应，得到hbd目的基因片段，其结构如seq id no:1的所示；利用表1中chr iv site3 tpgk1-up，chr iv site3 tpgk1-dw为引物，酵母染色体为模板进行pcr反应，得到pgk1终止子片段，其结构如genbank：bk006937.2的第138997-139440位所示。
[0180]
利用表1中chr iv site3 ptp1-up，chr iv site3 ptp1-dw为引物，酵母染色体为模板进行pcr反应，得到tpi1启动子片段，其结构如genbank：bk006938.2的第556473-557161位所示，利用表1中crt-up，crt-dw为引物，合成基因为模板进行pcr反应，得到crt目的基因片段，其结构如seq id no:2的所示，利用表1中chr iv site3 tadh1-up，chr iv site3 tadh1-dw为引物，酵母染色体为模板进行pcr反应，得到adh1终止子片段，其结构如genbank：bk006948.2的第159219-159547位所示，利用表1中chr iv site3h2-up，chr iv site3 h2-dw为引物，酵母染色体为模板进行pcr反应，得到h2右同源臂片段，其结构如genbank：bk006938.2的第544490-544789位所示。
[0181]
将h1左同源臂片段，pgk1启动子片段，hbd基因片段，pgk1终止子片段以一定比例混溶后，利用诺唯赞公司生产的dna聚合酶进行pcr反应，54℃退火15秒，延伸时间为2min，11个循环后，取1v反应体系用作下一步pcr反应模板。利用表1中chr iv site3 h1-up，chr iv site3 tpgk1-dw作为上下游引物进行pcr反应，54℃退火15秒，延伸时间为2min，35个循环.利用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化处理，获得hbd/crt供体片段前半部分。
[0182]
将tp1启动子，crt基因，adh1终止子片段，h2右同源臂以一定比例混溶后，利用诺唯赞公司生产的dna聚合酶进行pcr反应，54℃退火15秒，延伸时间为2min，11个循环后，取1v反应体系用作下一步pcr反应模板。利用表1中chr iv site3 ptp1-up，chr iv site3 h2-dw作为上下游引物进行pcr反应，54℃退火15秒，延伸时间为2min，35个循环.利用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化处理。获得hbd/crt供体片段后半部分。
[0183]
将供体片段前后两部分以一定比例混溶后，利用表1中chr iv site3 h1-up，chr iv site3 h2-dw引物对进行pcr反应，54℃退火15秒，延伸时间为4min，30个循环后利用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化处理，获得hbd/crt供体片段
[0184]
hbd/crt供体片段构建体系参照表2：表2：hbd/crt供体片段构建体系
[0185]
[0186]
三：by4741-hbd-crt菌株构建
[0187]
将ycplac33-cas9质粒转化至酿酒酵母by4741感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-ghbd/crt质粒以及hbd/crt供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行送测反应。整合成功，插入位置是在酵母4号染色体544487bp-544489bp处，将原基因组3bp替换成3697bp携带有表达框的hbd/crt目的基因，插入位置是在酵母4号染色体544487bp-544489bp处，阳性转化子菌株命名为by4741-hbd-crt。
[0188]
实施例2：构建插入ter,bcoat外源基因的酵母菌株
[0189]
一：prs42h-gter/bcoat质粒构建
[0190]
ter,bcoat外源基因的插入用质粒prs42h-gter/bcoat的构建，构建过程与实施例1中prs42h-ghbd/crt质粒构建一致，所用引物对为表1中ipcr-chr v his1-up，ipcr-chr v his1-dw，pcr产物为6600bpdna片段。得到质粒prs42h-gter/bcoat。所述grna序列其结构如seq id no:78的所示。
[0191]
二：ter/bcoat供体片段构建
[0192]
ter,bcoat外源基因的插入用供体片段ter/bcoat的构建，构建过程与实施例1中hbd/crt供体片段构建基本一致。于ncbi查询来源于treponema denticola的ter基因以及来源于faecalibacterium prausnitzii的bcoat基因的核苷酸序列，并委托金唯智生物公司进行密码子优化和基因合成。合成体系见表3。ter/bcoat供体片段构建体系参照表3：
[0193]
表3：ter/bcoat供体片段构建体系
[0194][0195]
载体中，所述h1左同源臂其其结构如genbank：cp020127.1的第265076-265364位所示；所述ter基因结构如seq id no:3所示，所述bcoat基因结构如seq id no:4所示，所述h2右同源臂其结构如genbank：cp020127.1的第265373-265594位所示。所述启动子、终止子与实施例1相同。
[0196]
三：by4741-hbd-crt-ter-bcoat菌株构建
[0197]
于实施例1成功构建的by4741-hbd-crt菌株基础上将ycplac33-cas9质粒转化至酿酒酵母by4741-hbd-crt感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-gter/bcoat质粒以及ter/bcoat供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行测序验证。整合成功，插入位置是在酵母5号染色体265595-265599bp处，将原基因组5bp替换成4621bp携带有表达框的ter/bcoat目的基因，阳性转化子菌株命名为by4741-hbd-crt-ter-bcoat。
[0198]
实施例3：构建过表达erg10内源基因的酵母菌株
[0199]
一：prs42h-gerg10质粒构建
[0200]
erg10内源基因的插入用质粒prs42h-gerg10的构建，构建过程与实施例1中prs42h-ghbd/crt质粒构建一致，所用引物对为表1中ipcr-chr iv site1-up，ipcr-chr iv site1-dw，pcr产物为6600bpdna片段。得到质粒prs42h-gerg10。所述grna序列其结构如seq id no:79的所示。
[0201]
二：erg10供体片段构建
[0202]
erg10内源基因的插入用供体片段erg10的构建。合成体系如表4所示。
[0203]
erg10供体片段构建体系参照表4：
[0204]
表4：erg10供体片段构建体系
[0205][0206][0207]
载体中，所述h1左同源臂其其结构如genbank：cp020126.1的第48865-49084位所示；所述tef1启动子，其结构如genbank：cp020138.1的第699794-700593位所示；所述erg10基因结构如genbank：ypl028w所示所示；所述tef1终止子，其结构如genbank：cp020138.1的第701971-702470位所示；所述h2右同源臂其结构如genbank：cp020126.1的第49093-49392位所示。
[0208]
三：by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10菌株构建
[0209]
于实施例2成功构建的by4741-hbd-crt-ter-bcoat菌株基础上将ycplac33-cas9质粒转化至酿酒酵母by4741-hbd-crt-ter-bcoat感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-gerg10质粒以及erg10供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行测序验证。整合成功，插入位置为酵母4号染色体49085-49089bp处，将原基因组5bp替换成2497bp携带有表达框的erg10目的
基因，阳性转化子菌株命名为by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10。
[0210]
实施例4：构建过表达erg10,mct1内源基因的酵母菌株
[0211]
一：prs42h-gerg10/mct1质粒构建
[0212]
erg10/mct1内源基因的插入用质粒prs42h-gerg10/mct1的构建，构建过程与实施例1中prs42h-ghbd/crt质粒构建一致，所用引物对为表1中ipcr-chr iv site1-up，ipcr-chr iv site1-dw，pcr产物为6600bpdna片段。得到质粒prs42h-gerg10/mct1。所述grna序列其结构如seq id no:80的所示。
[0213]
二：erg10/mct1供体片段构建
[0214]
erg10/mct1内源基因的插入用供体片段erg10/mct1的构建，构建过程与实施例1中hbd/crt供体片段构建基本一致。合成体系见表5。
[0215]
erg10/mct1供体片段构建体系参照表5：
[0216]
表5：erg10/mct1供体片段构建体系
[0217][0218]
载体中，所述tdh3启动子，其结构如genbank：cp020129.1的第882012-882811位所示；所述mct1基因结构如genbank：yor221c所示，所述tdh3终止子，其结构如genbank：cp020129.1的第883811-884310位所示,其余与实施例3相同。
[0219]
三：by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1菌株构建
[0220]
于实施例2成功构建的by4741-hbd-crt-ter-bcoat菌株基础上将ycplac33-cas9质粒转化至酿酒酵母by4741-hbd-crt-ter-bcoat感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-gerg10/mct1质粒以及erg10/mct1供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行测序验证。整合成功，插入位置为酵母4号染色体49085-49089bp处，将原基因组5bp替换成4880bp携带有表达框的erg10/mct1目的基因，阳性转化子菌株命名为by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1。
[0221]
实施例5：构建缺失mls1基因的酵母菌株
[0222]
一：prs42h-gmls1质粒构建
[0223]
mls1基因的缺失用质粒prs42h-gmls1的构建，构建过程与实施例1中prs42h-ghbd/crt质粒构建一致，所用引物对为表1中ipcr-chr xiv mls1-up，ipcr-chr xiv mls1-dw，pcr产物为6600bpdna片段。得到质粒prs42h-gmls1。所述grna序列其结构如seq id no:81的所示。
[0224]
二：mls1缺失供体片段构建
[0225]
mls1基因的缺失用mls1缺失供体片段的构建，利用表1中引物对chr xiv mls1 h1-up(mls1)，chr xiv mls1 h1-dw(mls1)合成h1左同源臂，利用表1中引物对chr xiv mls1 h2-up(mls1)，chr xiv mls1h2-dw(mls1)合成h2右同源臂；将h1左同源臂和h2右同源臂混溶后，利用表1引物对chr xiv mls1h1-up(mls1)，chr xiv mls1 h2-dw(mls1)进行pcr反应，并进行胶回收纯化获得mls1缺失供体片段，其中缺失片段为mls1蛋白编码序列的537bp至544bp，8bp碱基序列的缺失。
[0226]
mls1缺失供体片段构建体系参照表6：
[0227]
表6：mls1缺失供体片段构建体系
[0228]
引物对模板产物p69 p70by4741菌株染色体donor mls1缺失中h1左同源臂，222bpp71 p72by4741菌株染色体donor mls1缺失中h2右同源臂，300bpp69 p72h1,h2mls1缺失供体片段,522bp
[0229]
载体中的序列信息和实施例4相同。
[0230]
三：by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1
‑△
mls1菌株构建
[0231]
于实施例2、3和4成功构建的菌株基础上将ycplac33-cas9质粒转化至上述酿酒酵母。
[0232]
感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-gmls1质粒以及mls1缺失供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行送测反应。整合成功，利用同源重组，于mls1基因片段536bp处开始，缺失8bp碱基，阳性转化子菌株命名为by4741-hbd-crt-ter-bcoat
‑△
mls1、by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10
‑△
mls1、by4741-hbd-crt-ter-bcoat-mct1
‑△
mls1。
[0233]
实施例6：同时构建缺失mls1基因，过表达acs1基因酵母菌株
[0234]
一：prs42h-gmls1质粒构建
[0235]
构建缺失mls1基因，过表达acs1基因酵母菌株用质粒prs42h-gmls1的构建，构建过程同实施例5质粒构建一致。所述grna序列其结构如seq id no:82所示。
[0236]
二：acs1供体片段构建
[0237]
缺失mls1基因，过表达acs1基因用供体片段acs1的构建，构建过程与实施例3中erg10供体片段构建基本一致。合成体系如表7。
[0238]
acs1供体片段构建体系参照表7：
[0239]
表7：acs1供体片段构建体系
[0240][0241][0242]
载体中，所述h1左同源臂其其结构如genbank：ynl117w的第315-536位所示；所述acs1基因结构如genbank：yal054c所示；所述h2右同源臂其结构如genbank：ynl117w的第545-844位所示,tef1启动子和终止子与实施例3相同。
[0243]
三：by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1
‑△
mls1-acs1菌株构建
[0244]
于实施例2、3、4成功构建的菌株基础上将ycplac33-cas9质粒，grna转化至上述酿酒酵母感受态细胞中，并用ura3筛选标记筛选出阳性转化子，培养阳性转化子至感受态细胞后，加入prs42h-gmls1质粒以及acs1供体片段，并利用ura3以及潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子，对阳性转化子进行ypd液体培养，提取染色体dna，以其作为模板进行pcr验证，pcr产物进行测序验证。整合成功，利用同源重组，于mls1基因片段536bp开始，原有8bp缺失，3442bp带有表达框的acs1基因成功整合，阳性转化菌株命名为by4741-hbd-crt-ter-bcoat
‑△
mls1-acs1、by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10
‑△
mls1-acs1、by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1
‑△
mls1-acs1。
[0245]
实施例7：各种不同基因修饰酵母菌株生产丁酸能力评价
[0246]
对上述各种不同基因修饰酵母菌株进行了发酵生产丁酸评价，操作如下：
[0247]
1、种子液培养:挑取ypd固体培养基平板上生长的菌落，接入装有5ml ypd培养液的试管中，30℃、220rpm过夜培养,必要时进行二次扩大培养；
[0248]
2、发酵:发酵用培养基:酵母提取物10g/l,蛋白胨20g/l,葡萄糖20g/l,自然ph值；将新鲜种子液接种到装有25ml发酵培养基的100ml容量瓶中，控制初始od6oo值在0.1左右，30℃、220rpm下发酵；
[0249]
3、发酵液预处理：将收集的上清检测样品进行酸化处理。取2ml上清培养液于5ml聚乙烯离心管中，加入0.4ml 50％的硫酸溶液和乙醚，置于摇床中室温、200rpm培养45min，然后12000rpm离心5min，取出上清置于另外一个无菌离心管中，加入无水氯化钙进行脱水处理，之后取上清液，用孔径0.22μm滤膜过滤后，滤液用于气相检测；
[0250]
4、gc-ms气相色谱分析条件：色谱柱agilent 123-7032db-wax石英毛细管柱(30m x 320μm x 0.25μm)；升温程序：柱温的起始温度为60℃，保持2min，10℃/min的速度上升至220℃，保持20min，以氦气作为载气，流速为1ml/min，分流比20：1，进样体积2μl，进样口起始温度为250℃。质谱条件，ei离子源70ev，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，溶剂延迟时间2min，扫描质量范围m/z 20-150。
[0251]
5个批次，144h的发酵生产，平均丁酸产量见表8：
[0252]
表8：各种不同基因修饰酵母菌株丁酸产量
[0253]
菌株名称丁酸平均产量(mg/l)
by47410by4741-hbd-crt-ter-bcoat193by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10232by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1252by4741-hbd-crt-ter-bcoat
‑△
mls1261by4741-hbd-crt-ter-bcoat-acs1270by4741-hbd-crt-ter-bcoat
‑△
mls1-acs1333by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1
‑△
mls1322by4741-hbd-crt-ter-bcoat-erg10-mct1
‑△
mls1-acs1400
[0254]
由表8可知，引入的外源hbd/crt/ter/bcoat使得酵母具备合成丁酸的能力，初始丁酸产量平均为193mg/l，而通过强化乙酰乙酰辅酶a和乙酰辅酶a的代谢通量，又能直接强化丁酸的产量，相对于第一至第四基因的修饰，增加单个基因，例如第五基因修饰、第七基因修饰或者第八基因修饰后都可以显著的增加丁酸的产量，增加第五和第六基因修饰，相对于第一基因至第五基因，丁酸产量也显著的提高，多个基因的修饰进一步提高丁酸的产量，在八个基因修饰的菌株中，平均丁酸产量可提高至400mg/l，在部分批次中，丁酸产量甚至可以高达465mg/l。
[0255]
在本发明的构建策略中，产丁酸菌合成丁酸第一步，细胞内乙酰辅酶a在中心途径下，经过一系列的酶催化后形成丁酰辅酶a，丁酰辅酶a有两种途径形成丁酸，传统途径为丁酸激酶bk途径，此途径直接催化丁酰辅酶a脱去辅酶形成丁酸；另一种途径为非bk途径，即丁酰辅酶a:乙酸coa转移酶(bcoat)途径，该途径以丁酰辅酶a和乙酸作为底物，辅酶在转移酶作用下转移至乙酸形成乙酰辅酶a，从而解决丁酸的合成带来的乙酰辅酶a消耗过量问题，因此我们选择非bk途径用来解决酵母乙酰辅酶a的消耗过多问题。而酵母作为益生菌，引入的外源基因需要考虑在保证丁酸产率的前体下尽可能保留酵母自身的益生功能，因此4酶基因来源上我们选择肠道丁酸产菌丰度较高的菌，引入酵母基因组，最大程度保留酵母益生菌功能以及实现活体生物药体内治疗的目的。
[0256]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0257]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0258]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。