一种基于壳聚糖的可注射DNA水凝胶的制备方法

一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法
技术领域
1.本发明涉及新型免疫佐剂技术领域，尤其涉及一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.可注射水凝胶是一类应用十分广泛的凝胶材料，可为药物的局部递送提供充分的储备平台，并可充当细胞支架修复组织缺损。dn分子是生物的遗传物质，近些年来的研究发现长链的dna分子可通过多种交联剂形成水凝胶，最具代表性的是采用纳米硅酸盐作为交联剂形成的可注射水凝胶体系。其基本原理是将长链的dna高温变性，在退火的时候双链之间发生碱基交叉配对，形成预凝胶；利用纳米硅酸盐带正电的特性，与dna预凝胶中带负电的磷酸基团发生作用，形成最终的凝胶。由于dna分子的内源性特点，具有极佳的生物相容性，因此可注射dna水凝胶在修复组织缺损中具有很好的优势。然而纳米硅酸盐来源有限，成本较高，且在体内蓄积可能会产生一定的毒性。
3.壳聚糖由天然的甲壳素脱乙酰得到，是天然的带正电的高分子材料，具有来源广泛、成本低廉、生物相容性好等优势；更为重要的是，壳聚糖分子中的大量氨基团在质子化后带有大量的正电，可与带负电的核酸发生静电结合，被广泛的应用于包括质粒dna在内的基因递送中。因此我们推测，采用壳聚糖分子作为交联剂可能也可实现dna水凝胶的制备。通过一系列实验摸索，我们成功制备出可注射dna-壳聚糖水凝胶，优化出理想的参数，可以实现药物存储递送，且无细胞毒性。


技术实现要素：

4.针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，成本低廉、易于操作，且制备出来的水凝胶生物相容性好、可降解，可用于药物递送、生物粘附制剂、组织工程等。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
7.s1：配制dna溶液；
8.s2：配制不同浓度的壳聚糖溶液；
9.s3：制备dna预凝胶；
10.s4：制备不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶；
11.s5：分析不同浓度dna-壳聚糖终凝胶的性能，确定最佳壳聚糖溶液浓度；
12.s6：利用最佳浓度的壳聚糖溶液制备负载dex的凝胶。
13.进一步的，步骤s1中配制的dna溶液浓度为2％。
14.进一步的，步骤s1的具体操作步骤包括：称取适量dna，溶解于去离子水中，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为2％的dna溶液。
15.进一步的，步骤s2中配制的壳聚糖溶液浓度分别为0.1％、0.25％、0.5％和1％。
16.进一步的，步骤s2的具体操作步骤包括：称取适量壳聚糖，加入不同体积的0.5％乙酸溶液中，混匀，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为0.1％、0.25％、0.5％和1％的壳聚糖溶液。
17.进一步的，步骤s3的具体操作步骤包括，将步骤s1中配制的dna溶液在90℃水浴中加热45s，在37℃保持2h，得到dna预凝胶。
18.进一步的，步骤s4的具体操作步骤包括，将步骤s3中制备的dna预凝胶与步骤s2中配制的不同浓度的壳聚糖溶液等体积混合，混匀2min，37℃过夜，得到不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶。
19.进一步的，步骤s5的具体操作步骤包括，采用sem观察不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的孔隙，并利用imagej软件测量孔径大小；测定不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的流变学性能和溶胀率，确定最佳壳聚糖溶液浓度。
20.进一步的，步骤s6的具体操作包括，将适量的dex与步骤s5中确定的最佳浓度的壳聚糖溶液同时加入步骤s3中制备出来的dna预凝胶中，混匀2min，37℃过夜，形成负载dex的凝胶。
21.进一步的，负载dex的凝胶中dex的浓度为1mg/ml。本发明的有益效果是：
22.本发明中将壳聚糖作为交联剂制备dna-壳聚糖水凝胶，所使用的壳聚糖是生物相容性良好的天然高分子材料，成本低廉、易于操作和化学修饰，将dex与壳聚糖和dna凝胶进行聚合制备成dna-壳聚糖水凝胶，可以高效递送dex，并在目标部位缓释，发挥dex诱导巨噬细胞m2极化的功能，以控制局部炎症。
附图说明
23.图1为本发明不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶sem图；
24.图2为本发明dna-壳聚糖凝胶孔径与壳聚糖浓度的关系图；
25.图3为本发明dna-壳聚糖凝胶流变学参数与壳聚糖浓度的曲线图；
26.图4为本发明dna-壳聚糖凝胶溶胀率与壳聚糖浓度的关系图；
27.图5为本发明dex标准释放曲线和载dex凝胶的dex体外释放曲线；
28.图6为本发明dna-壳聚糖凝胶对巨噬细胞raw264.7活力的影响。
具体实施方式
29.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
30.一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，包括以下步骤，
31.s1：配制dna溶液；
32.具体的，所述dna溶液浓度为2％，所述dna溶液的配制方法为：称取20mg的絮状鲑鱼精dna(sigma)，溶解于1ml去离子水中，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为2％的dna溶液。
33.s2：配制不同浓度的壳聚糖溶液；
34.具体的，所述壳聚糖溶液浓度分别为0.1％、0.25％、0.5％和1％；
35.所述壳聚糖溶液的配制方法具体为：称取10mg壳聚糖，分别加入体积为10ml，4ml，
2ml，1ml的0.5％乙酸溶液中，混匀，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为0.1％、0.25％、0.5％和1％的淡黄色清澈透明壳聚糖溶液。
36.s3：制备dna预凝胶；
37.具体的，将步骤s1中配制的dna溶液在90℃水浴中加热45s，在37℃保持2h，得到dna预凝胶。
38.s4：制备不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶；
39.具体的，将步骤s3中制备的dna预凝胶与步骤s2中不同浓度的壳聚糖溶液等体积混合，混匀2min，37℃过夜，得到透明均质的不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶。
40.s5：分析不同浓度dna-壳聚糖终凝胶的性能，确定最佳壳聚糖溶液浓度；
41.具体的，步骤s3中制备出来的dna预凝胶呈溶液状，加入壳聚糖溶液后，变成果冻样的溶胶状，随着壳聚糖浓度的增加，胶体的粘度增加。采用sem观察不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的孔隙，结果如附图1所示。附图中还示出了肉眼大体观察到的不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的孔隙情况。
42.利用imagej软件测量孔径大小，具体结果如下表1所示。
43.表1不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶孔径测量结果
44.壳聚糖浓度0％0.1％0.25％0.5％1.0％孔径(μm)61.3058.2150.4842.3227.97
45.不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的孔径与壳聚糖浓度的关系如附图2所示。结合附图1和附图2可以看出，sem下，不同浓度的dna-壳聚糖终凝胶呈网络结构，孔隙分布较规则，孔径随着壳聚糖浓度的增加而减小。加入1％的壳聚糖后，胶体较粘稠，不易通过7号注射针头。
46.进一步的，测定不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的流变学性能(粘度、剪切应力和储能模量)和溶胀率，结果如附图3和附图4所示。从附图3和附图4中可以看出，凝胶的粘度、剪切应力和储能模量(g’)随着壳聚糖浓度的增加而增加，溶胀率随着壳聚糖浓度的增加而减小。
47.综合上述可以确定最佳壳聚糖溶液浓度为0.5％。
48.s6：利用最佳浓度的壳聚糖溶液制备负载dex的凝胶。
49.具体的，将2mg的dex与1ml浓度为0.5％的壳聚糖溶液同时加入1ml步骤s3中制备出来的dna预凝胶中，形成负载dex的凝胶，负载dex的凝胶中dex的浓度为1mg/ml。
50.测定最终制备出来的负载dex的凝胶体外释放dex曲线，与标准曲线进行对比，如附图5所示。从附图5中可以看出，该凝胶对负载的dex有缓释作用，半数释放量的时长从2天延长至4.5天。
51.将制备出的dna-壳聚糖处理raw264.7细胞后采用cck8检测对细胞活力的影响，如附图6所示，从附图6中可以看出，将制备出的dna-壳聚糖处理raw264.7细胞后未见明显的细胞活性抑制，反而有一定的促进作用。
52.综上所述，利用本发明中的制备方法制备出来的dna-壳聚糖水凝胶质地透明均匀，有规则致密的网络结构，对负载的dex有缓释作用。
53.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本
发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，s1：配制dna溶液；s2：配制不同浓度的壳聚糖溶液；s3：制备dna预凝胶；s4：制备不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶；s5：分析不同浓度dna-壳聚糖终凝胶的性能，确定最佳壳聚糖溶液浓度；s6：利用最佳浓度的壳聚糖溶液制备负载dex的凝胶。2.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s1中配制的dna溶液浓度为2％。3.根据权利要求2所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s1的具体操作步骤包括：称取适量dna，溶解于去离子水中，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为2％的dna溶液。4.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s2中配制的壳聚糖溶液浓度分别为0.1％、0.25％、0.5％和1％。5.根据权利要求4所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s2的具体操作步骤包括：称取适量壳聚糖，加入不同体积的0.5％乙酸溶液中，混匀，置于37℃恒温箱中过夜，配制成浓度为0.1％、0.25％、0.5％和1％的壳聚糖溶液。6.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s3的具体操作步骤包括，将步骤s1中配制的dna溶液在90℃水浴中加热45s，在37℃保持2h，得到dna预凝胶。7.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s4的具体操作步骤包括，将步骤s3中制备的dna预凝胶与步骤s2中配制的不同浓度的壳聚糖溶液等体积混合，混匀2min，37℃过夜，得到不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶。8.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s5的具体操作步骤包括，采用sem观察不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的孔隙，并利用image j软件测量孔径大小；测定不同壳聚糖浓度的dna-壳聚糖终凝胶的流变学性能和溶胀率，确定最佳壳聚糖溶液浓度。9.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s6的具体操作包括，将适量的dex与步骤s5中确定的最佳浓度的壳聚糖溶液同时加入步骤s3中制备出来的dna预凝胶中，混匀2min，37℃过夜，形成负载dex的凝胶。10.根据权利要求9所述的一种基于壳聚糖的可注射dna水凝胶的制备方法，其特征在于，负载dex的凝胶中dex的浓度为1mg/ml。

技术总结
本发明公开了一种基于壳聚糖的可注射DNA水凝胶的制备方法，包括以下步骤，S1：配制DNA溶液；S2：配制不同浓度的壳聚糖溶液；S3：制备DNA预凝胶；S4：制备不同壳聚糖浓度的DNA-壳聚糖终凝胶；S5：分析不同浓度DNA-壳聚糖终凝胶的性能，确定最佳壳聚糖溶液浓度；S6：利用最佳浓度的壳聚糖溶液制备负载Dex的凝胶。本发明中利用生物相容性良好的天然高分子材料的壳聚糖与DNA进行复合，制备出负载Dex的DNA-壳聚糖水凝胶可以高效递送Dex，定向诱导周围巨噬细胞M2极化，分泌抑制性细胞因子，减轻炎症反应，成本低廉，易于操作。易于操作。易于操作。


技术研发人员：宋文 陈芳浩 马志伟 张玉梅 李哲 何奕德 孟凡辉 李沛汉 郎凯
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2020.11.21
技术公布日：2022/5/25