一种发酵生产尼莫克汀的方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产尼莫克汀的方法。


背景技术：

2.化学农药制造业属于重污染行业之一，随着全社会环境保护和食品安全意识的不断增强，高毒化学农药逐步退出市场，而生物农药因其毒副作用小、对环境友好等特点，日益受到重视。
3.尼莫克汀(nemadectin)是由蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)发酵生产的一种大环内酯类化合物，属于米尔贝霉素(milbemycin)家族抗生素。以尼莫克汀为原料经过化学合成，可以得到价值更高的新型抗寄生虫药莫西菌素(moxidectin)。与传统的化学农药相比，它们具有高效、低毒、高选择性以及与环境相容性高的特点，且由于本身的亲脂特性强，较阿维菌素、米尔贝霉素等有着更高的安全性。目前，国内对尼莫克汀的研究尚处于起步阶段，关于尼莫克汀的菌种选育、发酵工艺等方面的研究较少，生产水平不高。鉴于此，本发明开发了一种发酵生产尼莫克汀的方法。


技术实现要素：

4.为了解决尼莫克汀发酵单位偏低的问题，本发明提供了一种发酵生产尼莫克汀的方法。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种发酵生产尼莫克汀的方法，所述方法包括以下步骤：
7.(1)斜面培养：将保存的尼莫克汀生产菌株接种于斜面培养基上，25-30℃，20％-60％湿度条件下培养6-9天，得到成熟的斜面孢子；
8.(2)种子培养：将步骤(1)中得到的成熟的斜面孢子接种到种子培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件，200-240rpm，培养24-36h，得到成熟的种子液；
9.(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的成熟的种子液按照5-10％接种量接种至发酵培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件，200-240rpm，培养6-12天，得到含有尼莫克汀的发酵液。
10.优选的，所述的斜面培养基的各成分的重量百分比为：葡萄糖0.1-0.4％，麦芽糖0.05-0.2％，酵母粉0.2-0.5％，玉米淀粉0.3-0.6％，低温豆粉0.3-0.6％，硝酸钾0.05-0.2％，磷酸氢二钾0.05-0.1％，氯化钠0.05-0.1％，硫酸镁0.01-0.03％，硫酸亚铁0.01-0.03％，碳酸钙0.01-0.03％，琼脂1.8-2.2％，使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
11.优选的，所述的斜面培养基的各成分的重量百分比为：葡萄糖0.3％，麦芽糖0.1％，酵母粉0.4％，玉米淀粉0.5％，低温豆粉0.5％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.01％，碳酸钙0.01％，琼脂2.0％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
12.优选的，所述的种子培养基的各成分的重量百分比为：葡萄糖0.5-1.5％，玉米糊精0.5-1.5％，玉米淀粉0.5-2.0％，高温豆粉1.0-2.0％，棉籽饼粉0.3-1.0％，酵母粉0.5-1.0％，氯化钠0.05-0.1％，硫酸镁0.05-0.1％，磷酸氢二钾0.05-0.2％，玉米油为体积百分比的0.3-1.0％，使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
13.优选的，所述的种子培养基的各成分的重量百分比为：葡萄糖1.0％，玉米糊精1.0％，玉米淀粉1.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，玉米油为体积百分比的0.5％，使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
14.优选的，所述的发酵培养基的各成分的重量百分比为：葡萄糖1.0-2.0％，乳糖1.0-3.0％，玉米淀粉4.0-6.0％，高温豆粉1.0-2.5％，棉籽饼粉0.5-1.5％，硝酸钾0.05-0.2％，硫酸镁0.05-0.2％，硫酸锌0.001-0.003％，硫酸锰0.001-0.003％，钼酸钠0.001-0.003％，碳酸钙0.4-1.0％，α-淀粉酶为玉米淀粉重量的0.05-0.1％，表面活性剂0.05-0.5％，玉米油为体积百分比的1.0-6.0％，使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
15.优选的，所述的发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉5.0％，高温豆粉1.2％，棉籽饼粉0.6％，硝酸钾0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.4％，α-淀粉酶为玉米淀粉重量的0.05％，鼠李糖脂0.1％，玉米油为体积百分比的4.0％，使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
16.优选的，所述的表面活性可以是硬脂酸、油酸、脂肪酸甘油酯、十二烷基苯磺酸钠、鼠李糖脂、槐糖脂等的任意一种或几种。
17.优选的，所述的尼莫克汀生产菌株为蓝灰链霉菌streptomyces cyaneogriseus。
18.优选的，所述的成熟的种子液标准为：外观粘稠挂壁，菌丝镜检粗壮，ph5.5-6.2，菌浓16％-32％。
19.较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明种子培养基和发酵培养基均采用葡萄糖、玉米淀粉、玉米油作为复合碳源，在种子培养阶段中加入少量的玉米油，诱导菌株用油酶系的激活，刺激代谢途径向用油转化，且在发酵培养基内加入适量的表面活性剂，提高了发酵的用油效率。通过优化包括斜面培养基、种子培养和发酵培养基在内的组合培养基及工艺条件，尼莫克汀的产量较优化前提高了37.47％。本发明提供的生产尼莫克汀的方法，大大提高了尼莫克汀的产量，且原材料简单易得，价格低廉，适用于工业化生产。
20.对本发明的具体说明请参照本发明的实施例。本发明的其它方面，由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
21.图1为尼莫克汀结构式
具体实施方式
22.以下实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
23.由本发明的精神所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之
内。
24.实施例1：
25.以蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)dc057为实验菌株，进行优化前的原始工艺对照。采用培养基为：
26.斜面培养基的成分及其含量为：葡萄糖0.4％，麦芽糖0.05％，酵母粉0.2％，玉米淀粉0.3％，玉米糊精0.2％，低温豆粉0.4％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，碳酸钙0.01％，琼脂1.8％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
27.种子培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，玉米糊精2.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
28.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖2.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉3.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉1.0％，硫酸镁0.05％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.5％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
29.取s.cyaneogriseus dc057砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，30℃，20％-60％湿度条件下培养8天，得到成熟的斜面孢子；斜面成熟接种至种子培养基，28℃，20％-60％湿度条件，200rpm，培养30h；种液成熟后，按照10％接种量接种到发酵培养基中，20％-60％湿度条件，200rpm，培养12天，得到含有尼莫克汀的发酵液，经检测，效价为1089μg/ml。
30.实施例2：
31.以蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)dc057为实验菌株，进行工艺优化。采用培养基为：
32.斜面培养基的成分及其含量为：葡萄糖0.3％，麦芽糖0.1％，酵母粉0.4％，玉米淀粉0.5％，低温豆粉0.5％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.01％，碳酸钙0.01％，琼脂2.0％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
33.种子培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，玉米糊精2.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
34.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉6.0％，高温豆粉1.2％，棉籽饼粉0.6％，玉米油(v/v)3.0％，硝酸钾0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.4％，α-淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.05％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
35.取s.cyaneogriseus dc057砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养8天，得到成熟的斜面孢子；斜面成熟接种至种子培养基，28℃，20％-60％湿度条件，200rpm，培养30h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，20％-60％湿度条件，220rpm，培养12天，得到含有尼莫克汀的发酵液，经检测，效价为1144μg/ml。
36.实施例3：
37.以蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)dc057为实验菌株，进行工艺优化。采用培养基为：
38.斜面培养基的成分及其含量为：葡萄糖0.3％，麦芽糖0.1％，酵母粉0.4％，玉米淀
粉0.5％，低温豆粉0.5％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.01％，碳酸钙0.01％，琼脂2.0％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
39.种子培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，玉米糊精2.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
40.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉6.0％，高温豆粉1.2％，棉籽饼粉0.6％，玉米油(v/v)3.0％，硝酸钾0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.4％，α-淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.05％，鼠李糖脂0.1％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
41.取s.cyaneogriseus dc057砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养8天，得到成熟的斜面孢子；斜面成熟接种至种子培养基，28℃，20％-60％湿度条件，200rpm，培养30h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，20％-60％湿度条件，220rpm，培养12天，得到含有尼莫克汀的发酵液，经检测，效价为1286μg/ml。
42.实施例4：
43.以蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)dc057为实验菌株，进行工艺优化。采用培养基为：
44.斜面培养基的成分及其含量为：葡萄糖0.3％，麦芽糖0.1％，酵母粉0.4％，玉米淀粉0.5％，低温豆粉0.5％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.01％，碳酸钙0.01％，琼脂2.0％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
45.种子培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，玉米糊精1.0％，玉米淀粉1.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，氯化钠0.05％，玉米油(v/v)0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
46.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉6.0％，高温豆粉1.2％，棉籽饼粉0.6％，玉米油(v/v)3.0％，硝酸钾0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.4％，α-淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.05％，鼠李糖脂0.1％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
47.取s.cyaneogriseus dc057砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养8天，得到成熟的斜面孢子；斜面成熟接种至种子培养基，28℃，20％-60％湿度条件，220rpm，培养32h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，20％-60％湿度条件，220rpm，培养10天，得到含有尼莫克汀的发酵液，经检测，效价为1412μg/ml。
48.实施例5：
49.以蓝灰链霉菌(streptomyces cyaneogriseus)dc057为实验菌株，进行工艺优化。采用培养基为：
50.斜面培养基的成分及其含量为：葡萄糖0.3％，麦芽糖0.1％，酵母粉0.4％，玉米淀粉0.5％，低温豆粉0.5％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.01％，碳酸钙0.01％，琼脂2.0％。使用纯化水配制，用20％的naoh调节ph至6.8-7.0。
51.种子培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，玉米糊精1.0％，玉米淀粉1.0％，高温豆粉1.5％，棉籽饼粉0.6％，酵母粉1.0％，氯化钠0.05％，玉米油(v/v)0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
52.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，乳糖2.0％，玉米淀粉5.0％，高温豆粉1.2％，棉籽饼粉0.6％，玉米油(v/v)4.0％，硝酸钾0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.001％，硫酸锰0.001％，钼酸钠0.002％，碳酸钙0.4％，α-淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.05％，鼠李糖脂0.1％。使用自来水配制，用20％的naoh调节ph至7.0-7.2。
53.取s.cyaneogriseus dc057砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养8天，得到成熟的斜面孢子；斜面成熟接种至种子培养基，28℃，20％-60％湿度条件，220rpm，培养32h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，20％-60％湿度条件，220rpm，培养10天，得到含有尼莫克汀的发酵液，经检测，效价为1497μg/ml。