一种抗心肌缺血损伤的药物组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医学和药学领域，具体涉及一种抗心肌缺血损伤的药物组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.心血管疾病是全球的头号死因：每年死于心血管疾病的人数多于其它任何病因。高血压、冠心病、脑血管疾病、周围血管疾病、心力衰竭、先天性心脏病、心肌病等病患都会导致心肌缺血而使心肌细胞的形态、功能等受损，表现为胸闷、胸痛、心悸等。心肌缺血后恢复血液再灌注导致的心肌细胞损伤甚至坏死，称为心肌缺血再灌注损伤，而心肌细胞缺氧/复氧损伤是其主要发病机制之一。
3.治疗心血管疾病的中药组方中经常使用麝香、人参、苏合香、牛黄、肉桂、蟾酥、冰片等药材。麝香温通开窍，活血止痛；冰片、牛黄助麝香以开窍；蟾酥、苏合香开窍醒神，辟秽止痛；人参大补元气，肉桂温阳散寒。诸药配伍，有活血止痛，开窍辟秽之功。
4.蟾毒灵、蟾毒它灵、酯蟾毒配基、华蟾毒精、3-表蟾毒灵等来源于蟾酥的成分是已经检测到的蟾酥的部分入血成分(yan s,et al.chemical fingerprinting and quantitative analysis of volatiles in shexiang baoxin pill bygas chromatography with flame ionization and mass spectrometric detection[j].j anal chem,2009,64(2):149-155)。邵玲研究发现，蟾酥能改善缺血心肌代谢,纠正糖和脂肪酸代谢紊乱,阻止游离脂肪酸堆积造成的心肌损伤；蟾酥亦能明显升高心肌缺血再灌注损伤家兔sod活性,降低m da含量,提示其可能通过抑制脂质过氧化过程,并同时提高内源性抗氧化酶活性而减轻氧自由基对心肌的损伤(邵玲.低温及蟾酥对麻醉家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用[d].武汉：武汉大学，2005)。但是蟾酥的心脏毒性是令人无法忽视的问题。另有研究表明，冰片对异丙肾上腺素造成的急性心肌缺血损伤具有保护作用,可能的机理在于减轻细胞内钙超载,抑制细胞凋亡(荆焰.冰片对急性心肌缺血损伤的保护作用[d].四川：四川大学，2003)。
[0005]
2017年，心血管疾病导致的死亡占我国居民疾病死亡的40％以上，高于恶性肿瘤及其他疾病，且处于持续上升状态(陈伟伟，等.《中国心血管病报告2017》概要[j].中国循环杂志，2018，33(1):1-8)。因此，临床上对有效、安全的治疗心血管疾病的药物的需求依然没有得到满足。


技术实现要素：

[0006]
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种新的抗心肌缺血损伤的药物组合物。本发明的药物组合物对缺氧-复氧心肌细胞具有保护作用，与上市成药作用相当，但组方更简单、更安全。
[0007]
为此，本发明采用了如下的技术方案：
[0008]
一种抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：
[0009]
麝香2-10重量份、人参11-25重量份、苏合香6-13重量份、牛黄2-10重量份和肉桂10-26重量份。
[0010]
优选地，所述抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：
[0011]
麝香3-10重量份、人参12-25重量份、苏合香7-13重量份、牛黄3-10重量份和肉桂11-26重量份。
[0012]
更优选地，所述抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：
[0013]
麝香4-10重量份、人参13-25重量份、苏合香8-13重量份、牛黄4-10重量份和肉桂12-26重量份。
[0014]
优选地，所述人参选自人参药材或人参提取物。
[0015]
更优选地，所述人参提取物通过如下方法制备：取人参药材粉碎成颗粒，用75％乙醇回流提取，提取液趁热过滤，浓缩，浸膏真空干燥，即得。
[0016]
优选地，所述麝香选自天然麝香或人工麝香。
[0017]
更优选地，所述麝香为人工麝香。
[0018]
优选地，所述牛黄选自天然牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄。
[0019]
更优选的，所述牛黄为人工牛黄。
[0020]
本发明还有一个目的在于提供上述抗心肌缺血损伤的药物组合物的制备方法，包括按照所述重量份准备各组分，将各组分混合，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，制备成临床上可以接受的制剂。
[0021]
此外，本发明还提供上述药物组合物在制备治疗心肌缺血损伤相关疾病的药物中的应用。
[0022]
优选地，所述心肌缺血损伤相关疾病选自冠心病、心绞痛和心肌梗死中的一种或多种。
[0023]
在本说明书中，所述各组分的“重量份”表示的是各组分之间的相对的用量配比，而不是实际的绝对质量。根据实际情况，1重量份可以是1g、10g、50g、100g、500g、1kg或其它任意质量数。
[0024]
在本说明书中，所述“人参药材”是指五加科植物人参(panax ginseng c.a.mey.)的干燥根和根茎，包括野生的“山参”，栽培的“圆参”，播种在山林野生状态下自然生长的“林下山参”。
[0025]
所述“天然麝香”为鹿科动物林麝(moschus berezovskii flerov)、马麝(moschus sifanicus przewalski)或原麝(moschus moschiferus linnaeus)成熟雄体香囊中的干燥分泌物。
[0026]
所述“人工麝香”为濒危动物药材麝香的替代品，等同天然麝香使用。
[0027]
所述“牛黄”为牛科动物牛(bos taurus domesticus gmelin)的干燥胆结石。
[0028]
所述“体外培育牛黄”以牛科动物牛(bos taurus domesticus gmelin)的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成，以中国药典(2015或2020年版)的记载为准。
[0029]
所述“人工牛黄”，由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆固醇、微量元素等加工制成，以中国药典(2015或2020年版)的记载为准。
附图说明
[0030]
下面结合附图，对本发明做进一步说明。
[0031]
图1的柱状图示出的麝香保心丸在不同浓度时对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用。图中，***：与模型组比较，p《0.001。
[0032]
图2的柱状图示出的是麝香保心丸(sbp，75mg/l)对心肌细胞缺氧损伤后ldh、mda和no释放的作用。图中，***：与模型组比较，p《0.001。其中：
[0033]
a：麝香保心丸(sbp，75mg/l)对心肌细胞缺氧损伤后ldh释放的作用；
[0034]
b：麝香保心丸(sbp，75mg/l)对心肌细胞缺氧损伤后mda释放的作用；
[0035]
c：麝香保心丸(sbp，75mg/l)对心肌细胞缺氧损伤后no释放的作用。
[0036]
图3的柱状图示出的本发明实施例2的药物组合物在不同浓度时对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用。图中，**：与模型组比较，p《0.01；***：与模型组比较，p《0.001。
[0037]
图4的柱状图示出的本发明实施例2的药物组合物在不同浓度时对心肌细胞缺氧损伤后ldh(a)、mda(b)和no(c)释放的作用。图中，**：与模型组比较，p《0.01；***：与模型组比较，p《0.001。其中：
[0038]
a：实施例2的药物组合物不同浓度下对心肌细胞缺氧损伤后ldh释放的作用；
[0039]
b：实施例2的药物组合物不同浓度下对心肌细胞缺氧损伤后mda释放的作用；
[0040]
c：实施例2的药物组合物不同浓度下对心肌细胞缺氧损伤后no释放的作用。
[0041]
图5的柱状图示出的对比1、对比2、对比3、对比4、对比5和对比6在不同浓度时对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用。
具体实施方式
[0042]
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0043]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和药材购买情况如下：
[0044]
麝香保心丸：上海和黄药业有限公司，批号20190812；
[0045]
人工麝香：北京联馨药业有限公司，批号20190504；
[0046]
人参：辽宁行天健药材有限公司，批号20190113；
[0047]
苏合香：浙江森虹医药有限公司，批号20190328；
[0048]
人工牛黄：湖南迪博制药有限公司，批号20190329；
[0049]
肉桂：上海真仁堂药业有限公司，批号20190512；
[0050]
冰片：上海市药材有限公司，批号20190606；
[0051]
蟾酥：山东康源堂中药饮片股份有限公司，批号20190603。
[0052]
实施例1一种抗心肌缺血损伤的药物组合物
[0053]
人工麝香10重量份、人参25重量份、苏合香8重量份、牛黄4重量份和肉桂12重量份；其中1重量份＝1g。
[0054]
实施例2一种抗心肌缺血损伤的药物组合物
[0055]
人工麝香8重量份、人参13重量份、苏合香8重量份、牛黄10重量份和肉桂26重量
份；其中1重量份＝1g。
[0056]
实施例3一种抗心肌缺血损伤的药物组合物
[0057]
人工麝香4重量份、人参25重量份、苏合香8重量份、牛黄10重量份和肉桂20重量份；其中1重量份＝1g。
[0058]
试验例1本发明所述药物组合物对缺氧-复氧心肌的保护
[0059]
1.主要试剂材料
[0060][0061]
2.主要仪器
[0062][0063]
3.测试样品
[0064]
3.1本发明的药物组合物
[0065]
实施例2的药物组合物
[0066]
3.2麝香保心丸：
[0067]
3.4对比药物组合物
[0068]
对比药物组合物1(以下简称“对比1”)：人工麝香8g，人参20g，牛黄6g。称取人工麝香8g，人参20g，牛黄6g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0069]
对比药物组合物2(以下简称“对比2”)：人工麝香8g，人参20g，蟾酥1g。称取人工麝香8g，人参20g，蟾酥1g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0070]
对比药物组合物3(以下简称“对比3”)：人工麝香6g，人参15g，肉桂15g。称取人工麝香6g，人参15g，肉桂15g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0071]
对比药物组合物4(以下简称“对比4”)：人工麝香4g，苏合香13g，人参25g，蟾酥2g。称取人工麝香4g，苏合香12g，人参25g，蟾酥2g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0072]
对比药物组合物5(以下简称“对比5”)：人工麝香4g，人参25g，蟾酥2g，肉桂26g。称取人工麝香4g，人参25g，蟾酥2g，肉桂26g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0073]
对比药物组合物6(以下简称“对比6”)：人工麝香4g，苏合香13g，牛黄10g，肉桂26g。称取人工麝香4g，人参25g，蟾酥2g，肉桂26g粉碎成细粉并搅匀，即得。
[0074]
上述本发明的药物组合物、麝香保心丸和各对比药物组合物均在-20℃密封保存。
[0075]
称取测试样品，用dmso和完全培养液(dmem培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素配成的完全培养液)配成浓度为30000mg/l的溶液作为储备液(麝香保心丸的浓度为20000mg/l)，其中dmso的含量为百分之十。储备液稀释100倍得到300mg/l的溶液，300mg/l的溶液再稀释不同倍数得到相应的工作液。
[0076]
4.实验方法
[0077]
4.1心肌细胞h9c2缺氧损伤模型
[0078]
1)铺板：使用dmem，10％胎牛血清，1％双抗混合的完全培养液，按每孔6000个h9c2心肌细胞进行96孔板铺板，每孔100μl细胞悬液，过夜培养。
[0079]
2)第二天弃去孔内液体，加入配好的5mmol/l na2s2o4溶液200μl(用无糖rpmi1640配制)，放入细胞培养箱(37℃，5％co2)1.5h。
[0080]
4.2细胞存活率测定
[0081]
1)心肌细胞h9c2缺氧损伤1.5h后弃去孔中液体，对照组和模型组每孔加200μl完全培养液，给药组每孔加200μl测试样品溶液，放入细胞培养箱中24h。
[0082]
2)24h后弃去孔中液体，每孔加20μl 5mg/ml mtt，放入细胞培养箱中4h。
[0083]
3)4h后弃去孔中液体，每孔加入150μl dmso，置于摇床上10min，使用酶标仪在570nm处测定各孔的吸光度。
[0084]
4)计算细胞存活率，存活率(％)＝od模型组/od对照组*100；存活率(％)＝od给药组/od对照组*100。
[0085]
4.3 ldh释放测定
[0086]
1)心肌细胞h9c2缺氧损伤1.5h后弃去孔中液体，对照组和模型组每孔加200μl完全培养液，给药组每孔加200μl化合物液体，放入细胞培养箱中24h。
[0087]
2)24h后将细胞培养板400g离心5min，分别吸取上清液120μl加入到一个新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
[0088]
3)配制ldh检测工作液：根据待测样品个数配制不同体积的ldh检测工作液，如下表。
[0089][0090][0091]
4)各孔分别加入60μl ldh检测工作液。
[0092]
5)混匀后用铝箔包裹后置于水平摇床上缓慢摇动30min，在490nm处测定吸光度。
[0093]
4.4 mda测定
[0094]
1)铺板：使用dmem，10％胎牛血清，1％双抗混合的完全培养液，按每皿60万个h9c2心肌细胞进行小皿铺板。设置对照组、模型组和给药组，每皿加入2ml细胞悬液，培养过夜。
[0095]
2)第二天弃去皿内液体，对照组每皿加入2ml dmem，模型组和化合物组每皿加入2ml 5mmol/l na2s2o4溶液，放入细胞培养箱(37℃，5％co2)1.5h。
[0096]
3)1.5h后弃去皿中液体，对照组和模型组每皿加2ml dmem完全培养液，给药物组
每皿加入2ml不同浓度的测试样品溶液(化合物用生物级dmso和dmem完全培养液配制，dmso含量不超过千分之一)，放入细胞培养箱中24h。
[0097]
4)24h后弃去皿内液体，每皿加入1ml dpbs，用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞悬液转移至1.5ml ep管中。
[0098]
5)1000转/分离心10min，弃去上清液，加mda试剂盒中的试剂五提取液130μl，混匀2min，取样100μl于1.5ml ep管中。
[0099]
6)按试剂一：试剂二：试剂三＝0.2:3:1的比例进行配制工作液，每个样品加1ml工作液，涡旋混匀液体，用注射器针头在管盖上刺一个小孔，100℃加热40min。
[0100]
7)取出后冷却，4000转/分离心10min，吸取液体130μl到96孔板中，530nm测定吸光度。
[0101]
8)用bca试剂盒测定样品蛋白浓度。
[0102]
9)mda含量(nmol/mg prot)＝(od
测定-od
空白
)/(od
标准-od
空白
)*标准品浓度/样品蛋白浓度
[0103]
4.5 no测定
[0104]
1)铺板：使用dmem，10％胎牛血清，1％双抗混合的完全培养液，按每皿50万个h9c2心肌细胞进行小皿铺板。设置对照组、模型组和给药组，每皿加入2ml细胞悬液，培养过夜。
[0105]
2)第二天弃去皿内液体，对照组每皿加入1ml dmem，模型组和化合物组每皿加入1ml 5mmol/l na2s2o4溶液，放入细胞培养箱(37℃，5％co2)1.5h。
[0106]
3)1.5h后弃去皿中液体，对照组和模型组每皿加1ml dmem完全培养液，给药组每皿加入1ml不同浓度的测试样品溶液(化合物用生物级dmso和dmem完全培养液配制，dmso含量不超过千分之一)，放入细胞培养箱中24h。
[0107]
4)24h后弃去皿内液体，每皿加入1ml dpbs，用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞悬液转移至1.5ml ep管中。
[0108]
5)1000转/分离心10min，弃去上清液，加组织裂解液90μl，涡旋混匀使细胞裂解。
[0109]
6)按下表加入液体。
[0110]
nadph(2mm)(μl)5fad(μl)10nitrate reductase(μl)5
[0111]
7)涡旋混匀液体，37℃孵育30min。
[0112]
8)每管再加入以下液体，涡旋混匀液体，37℃孵育30min。
[0113]
ldh buffer(μl)10ldh(μl)10
[0114]
9)每管再加入以下液体，涡旋混匀液体，室温(20-30℃)孵育10min，540nm处测定吸光度。
[0115]
griess reagentⅰ(μl)50griess reagentⅱ(μl)50
[0116]
10)用bca试剂盒测定样品蛋白浓度。
[0117]
5.数据处理：数据以平均值
±
sem示出，进行单侧t检验。
[0118]
6.实验结果：
[0119]
6.1麝香保心丸的对心肌细胞缺氧损伤的保护作用
[0120]
6.1.1麝香保心丸在不同浓度时对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用
[0121]
麝香保心丸5mg/l、25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l、150mg/l和200mg/l浓度下对心肌细胞缺氧损伤的保护作用，与模型组相比，sbp在75mg/l能促进缺氧损伤的心肌细胞存活，具有显著性差异。具体见图1所示。由上述试验结果确定75mg/l为麝香保心丸的工作浓度，进行后续的各项试验。
[0122]
6.1.2麝香保心丸(75mg/l)对心肌细胞缺氧损伤后ldh、mda和no释放的作用
[0123]
与正常对照组相比，缺氧组心肌细胞ldh、mda和no的释放明显升高；与缺氧组相比，麝香保心丸在75mg/l时能降低ldh、mda和no的释放，具有显著性差异。结果分别见图2的a、b和c图。
[0124]
6.2本发明实施例2对心肌细胞缺氧损伤的保护作用
[0125]
6.2.1本发明实施例2对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用
[0126]
与模型组相比，本发明实施例在100mg/l和300mg/l的浓度下均能促进缺氧心肌细胞存活，具有显著性差异，且与麝香保心丸组相比，没有显著性差异。具体见图3。
[0127]
6.2.2本发明实施例对心肌细胞缺氧损伤后ldh、mda和no释放的作用
[0128]
与正常对照组相比，缺氧组心肌细胞ldh的释放明显升高；与缺氧组相比，实施例2在100mg/l和300mg/l浓度下均能降低ldh的释放，具有显著性差异；与麝香保心丸组相比，实施例2降低ldh释放的作用稍弱。具体见图4a。
[0129]
与正常对照组相比，缺氧组心肌细胞mda的释放明显升高；与缺氧组相比，实施例2在100mg/l和300mg/l时均能显著能降低mda的释放，与麝香保心丸组相比，没有显著性差异。具体见图4b。
[0130]
与正常对照组相比，缺氧组心肌细胞no的释放明显升高；与缺氧组相比，实施例2在100mg/l和300mg/l时均能显著能降低no的释放，与麝香保心丸组相比，没有显著性差异。具体见图4c。
[0131]
6.3对比药物组合物对心肌细胞缺氧损伤后存活率的作用
[0132]
对比1、对比2、对比3、对比4、对比5和对比6在100mg/l和300mg/l浓度时对心肌细胞缺氧损伤后存活率没有促进作用。具体见图5。
[0133]
7.结论
[0134]
本发明实施例的药物组合物具有显著的抗心肌细胞缺血损伤保护作用，作用与麝香保心丸基本相当。各对比药物组合物没有抗心肌细胞缺血损伤作用。

技术特征：
1.一种抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：麝香2-10重量份、人参11-25重量份、苏合香6-13重量份、牛黄2-10重量份和肉桂10-26重量份。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：麝香3-10重量份、人参12-25重量份、苏合香7-13重量份、牛黄3-10重量份和肉桂11-26重量份。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，更优选地，所述抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：麝香4-10重量份、人参13-25重量份、苏合香8-13重量份、牛黄4-10重量份和肉桂12-26重量份。4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述人参选自人参药材或人参提取物。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述人参提取物通过如下方法制备：取人参药材粉碎成颗粒，用75％乙醇回流提取，提取液趁热过滤，浓缩，浸膏真空干燥，即得。6.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述麝香选自天然麝香或人工麝香；更优选地，所述麝香为人工麝香。7.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述牛黄选自天然牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄；更优选的，所述牛黄为人工牛黄。8.权利要求1至7中任一项所述的药物组合物的制备方法，包括按照所述重量份准备各组分，将各组分混合，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，制备成临床上可以接受的制剂。9.权利要求1至7中任一项所述的药物组合物或按照权利要求8所述的制备方法制备得到的药物组合物在制备治疗心肌缺血损伤相关疾病的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述心肌缺血损伤相关疾病选自冠心病、心绞痛和心肌梗死中的一种或多种。

技术总结
本发明提供一种抗心肌缺血损伤的药物组合物，包括如下重量份的组分：麝香2-10重量份、人参11-25重量份、苏合香6-13重量份、牛黄2-10重量份和肉桂10-26重量份。本发明还提供所述药物组合物的制备方法和应用。药物组合物的制备方法和应用。


技术研发人员：詹常森 张建革 周俊杰 汪飞云 姜鹏
受保护的技术使用者：上海和黄药业有限公司
技术研发日：2020.11.20
技术公布日：2022/5/25