一种水溶性生物质衍生碳点及其制备方法与应用

1.本发明涉及碳纳米材料及应用领域，具体涉及一种水溶性生物质衍生碳点及其制备方法与应用。


背景技术：

2.据联合国报告，2050年全球人口将超过97亿，届时粮食产量必须增产70％才能满足日益增长人口的需求。然而，可用于农业生产的土地资源有限，且全球气候急剧变化，植物遭受各种非生物胁迫，如土壤盐渍化和矿质元素缺失等，显著阻碍农作物生长，对农作物产量和品质造成严重的负面影响。目前，虽然转基因技术在提高作物产量和品质方面具有显著的效果，但其社会接受度低，阻碍了其产业化应用。
3.纳米技术的快速发展使其成为改善农业生产的一个有利工具。纳米材料与植物之间的相互作用，极大地促进了纳米产品在农业中的应用，如作为生长调节剂、农药、化肥、抗菌剂和抗逆性调节剂等。碳点作为一种典型的零维碳基纳米材料具有良好生物相容性、低毒性、水溶性和优异的生物化学性能，具有广阔的应用前景。其中，生物质衍生碳点因其制备方法简便、原料来源丰富、价格低廉、绿色环保而备受关注，同时生物质赋予碳点丰富的表面官能团(羟基、羧基和羰基)，使其具有优良的化学和生物学特性。然而不同碳源、粒径、浓度、化学和生物学特性的碳点对植物的影响不同。因此，制备一种提高植物抗逆性的碳点对农作物生产具有重要的研究意义和实际应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种水溶性生物质衍生碳点及其制备方法与应用，该方法具有工艺简单、易于操作、成本低、无污染的优点，可用于产业化生产；制备的水溶性生物质衍生碳点尺寸小，具有良好的生物相容性和水溶性，碳点表面丰富的含氧官能团使其具有缓解植物非生物胁迫的潜力，能够有效提高植物的抗逆性。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种水溶性生物质衍生碳点的制备方法，包括以下步骤：
6.s1、将生物质均匀分散在蒸馏水中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：(10～30)ml，搅拌10～20min形成悬浮液；
7.s2、将步骤s1得到的悬浮液置于高压反应釜中，在100～210℃下反应4～12h形成水溶性衍生碳点溶液；
8.s3、将步骤s2得到的水溶性衍生碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点。
9.优选的，步骤s1中，生物质为丹参粉末、甘薯秸秆粉末、红茶粉末、金银花粉末中的一种或多种。
10.优选的，步骤s1中，生物质与蒸馏水之间的质量体积比为1g：20ml，搅拌10min。
11.优选的，步骤s2中，悬浮液在150℃下反应6h形成水溶性碳点溶液。
12.优选的，步骤s3中，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da。
13.一种水溶性生物质衍生碳点，所述水溶性生物质衍生碳点由上述制备方法制备得到。根据上述制备方法制备获得的水溶性碳点，其表面含有丰富的含氧官能团，含氧官能团使碳点具有优异的生物学特性，这为其在提高植物抗逆性中的应用提供了可能性。
14.上述制备方法制备得到的水溶性生物质衍生碳点在提高植物抗逆性中的应用。
15.优选的，将水溶性生物质衍生碳点配制成碳点浓度为0.3～2.0mg/ml的碳点营养液。
16.优选的，将水溶性生物质衍生碳点配制成碳点浓度为1.5mg/ml的碳点营养液。
17.优选的，水溶性生物质衍生碳点采用水培、土培和叶面喷施的方式应用在提高植物的抗逆性中。
18.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
19.(1)本发明以含酚酸的天然生物质为原材料，如丹参粉末、甘薯秸秆粉末、红茶粉末、及金银花粉末等一系列生物质，以蒸馏水为溶剂通过一步水热反应制备碳点，原材料来源广且绿色环保；
20.(2)本发明工艺简单，易于操作，成本低，产率高达20～30％，反应在4～12h内完成，无污染，可用于产业化生产；
21.(3)本发明提供的生物质衍生碳点可以应用在植物种植方面，由于碳点表面含有丰富的含氧官能团，从而赋予其优异的生物学特性，使其诱导植物根系ca
2
内流，从而形成钙信号，调节相应防御基因表达，提高植物的抗逆性；碳点不仅能够激活植物根系细胞质膜na

/h

逆向转运蛋白基因sos1表达，降低植物对na

吸收，从而显著缓解植物盐胁迫，而且可以提高植物低铁响应基因的过表达，从而提高植物对铁元素的利用效率，缓解植物低铁胁迫。因此，本发明制备的碳点能够有效缓解植物非生物胁迫，提高植物抗逆性。
附图说明
22.图1为本发明实施例三制备得到生物质衍生碳点的透射电镜图；
23.图2为本发明实施例三制备得到生物质衍生碳点的粒径分布图；
24.图3为本发明实施例一至六制备得到生物质衍生碳点的ftir图；
25.图4为盐胁迫下，不同处理对甘薯幼苗表型的影响；
26.图5为盐胁迫下，不同处理对甘薯幼苗根、茎和叶中na

积累的影响；
27.图6为盐胁迫24h后，不同处理对甘薯幼苗根系na

流的影响；
28.图7为盐胁迫下，不同处理对甘薯幼苗na

/h

逆向转运蛋白基因ibsos1、ibsos2、ibsos3相对表达量的影响；
29.图8为低铁胁迫下，不同处理对甘薯幼苗表型的影响；
30.图9为低铁胁迫下，不同处理对甘薯幼苗根、茎和叶中fe
2
积累的影响；
31.图10为低铁胁迫下，不同处理对甘薯幼苗叶绿素含量的影响；
32.图11为低铁胁迫下，不同处理对甘薯幼苗光合速率的影响；
33.图12为低铁胁迫下，不同处理对甘薯根系中基因表达量的影响，(a)为ibcbl1基因，(b)为ibfit基因，(c)为ibirt1基因；
34.图13为碳点处理对甘薯幼苗根系ca
2
流的影响。
具体实施方式
35.以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
36.实施例一
37.称取6.0g丹参粉末均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在100℃下反应4h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为20％。
38.实施例二
39.称取3.0g丹参粉末均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在120℃下反应6h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为27％。
40.实施例三
41.称取3.0g丹参粉末均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌10min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在150℃下反应6h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为30％。
42.实施例四
43.称取3.0g生物质(丹参粉末与甘薯秸秆粉末1:1比例混合)均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌15min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在150℃下反应8h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为25％。
44.实施例五
45.称取2.5g生物质(丹参粉末与红茶粉末2:1比例混合)均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌15min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在180℃下反应10h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为26％。
46.实施例六
47.称取2.0g生物质(红茶粉末与金银花粉末2:1比例混合)均匀分散于60ml蒸馏水中，在室温下搅拌20min，随后将悬浮液置于高压反应釜中，在210℃下反应12h形成碳点溶液，将形成碳点溶液冷却至室温后分别利用水系微孔滤膜过滤和透析袋进行透析，水系微孔滤膜的孔径为0.22μm，透析袋的分子量为3500da，除去杂质后获得纯净的水溶性生物质衍生碳点，其产率约为21％。
48.将实施例一至六制备的生物质碳点进行透射电镜测试，具体以实施例三制备的生物质碳点为例，结果如图1所示，从图中可以看出，本发明获得的生物质碳点均呈球形颗粒，具有良好的单分散性。
49.以实施例三制备的生物质碳点为例，从透射电镜图中测量超过150个碳点的直径，
获得碳点的粒径分布图，结果如图2所示，从图中可以看出，本发明获得的生物质碳点的粒径分布在1～5.5nm之间，其平均粒径为3.3nm。
50.将实施例一至六制备的生物质碳点进行红外光谱分析，结果如图3所示，从图中可以看出，所制备的碳点在3100～3700cm-1
处有宽吸收带，这归因于-cooh和-oh的伸缩振动，表明存在酚羟基和羧酸。在2928cm-1
处的峰对应于c-h的伸缩振动，1613cm-1
处的特征峰归因于羧酸和芳香酮的c＝o伸缩，1524cm-1
、1418cm-1
和1355cm-1
处的锋为c-h的伸缩振动和弯曲振动，1200～1000cm-1
处的峰为c-o的伸缩振动，为多糖的特征吸收锋。这些结果表明制备的碳点中含有丰富的-cooh、-oh、c＝o。
51.根据实施例三制备的碳点，将碳点应用在植物中提高植物的抗逆性，以盐胁迫和低铁胁迫为例，包括如下步骤：
52.(1)选择甘薯作为植物模型，剪取15cm生长健壮的甘薯藤蔓扦插在1/4霍格兰溶液中诱导不定根生长，每隔两天换一次营养液，培养条件：光照时间为16h，光照温度为28℃，黑暗时间为8h，黑暗温度为23℃，相对湿度均为60％；
53.(2)培养7天后，选取大小一致，长势均匀的甘薯幼苗进行盐胁迫处理和低铁胁迫处理；
54.(3)盐胁迫处理：分别将甘薯幼苗移植于四组营养液中，分别为1/4霍格兰营养液(对照组)、含150mm nacl的1/4霍格兰营养液、含1.5mg/ml碳点的1/4霍格兰营养液、含1.5mg/ml碳点和150mm nacl的1/4霍格兰营养液。每隔2天更新一次处理溶液，每个处理设置6个重复。
55.(4)低铁胁迫处理：分别将甘薯幼苗移植于四组营养液中，分别为1/4霍格兰营养液(对照组)、缺铁的1/4霍格兰营养液(含1μm fe-edta)、含1.5mg/ml碳点的1/4霍格兰营养液、含1.5mg/ml碳点和缺铁的1/4霍格兰营养液(含1μm fe-edta)。每隔2天更新一次处理溶液，每个处理设置6个重复。
56.以上霍格兰营养液由945mg/l四水硝酸钙、506mg/l硝酸钾、80mg/l硝酸铵、136mg/l磷酸二氢钾、493mg/l七水硫酸镁、2.5ml铁盐溶液和5ml微量元素液组成。
57.铁盐溶液由1.39g/l七水硫酸亚铁和1.87g/l乙二胺四乙酸二钠组成。
58.微量元素溶液由0.83mg/l碘化钾、6.2mg/l硼酸、22.3mg/l硫酸锰、8.6mg/l硫酸锌、0.25mg/l钼酸钠、0.025mg/l硫酸铜和0.025mg/l氯化钴组成。
59.为了探究本发明所制备碳点对盐胁迫下甘薯幼苗生长的影响，处理12天后观察不同处理下甘薯幼苗的表型，如图4所示，与对照相比，单独碳点处理的甘薯幼苗生长良好，与对照相比没有显著差异，然而150mm nacl处理显著抑制甘薯幼苗生长，植株呈现枯死状态，碳点处理下甘薯幼苗的盐胁迫得到显著缓解，植株的生长活力明显增强。大量研究表明，盐胁迫抑制植物生长的主要原因是植物体内na

过量积累导致植株产生na

毒害。因此，利用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测定甘薯幼苗根、茎和叶中na

含量，如图5所示，与对照和单独碳点处理的甘薯幼苗相比，盐胁迫下甘薯幼苗根、茎和叶中na

含量显著增加，而碳点处理后盐胁迫下的甘薯幼苗根、茎和叶中na

含量显著降低，由此可知，本发明制备得到的碳点显著抑制盐胁迫下甘薯幼苗对na

的吸收和积累，从而缓解na

毒害。
60.植物细胞中na

/h

逆向转运蛋白是应对盐胁迫的一种重要蛋白，可以调控na

外排，减少植物对na

的吸收以缓解植物的盐毒害。因此，利用非损伤微测技术探究不同处理
对甘薯幼苗根系na

流动的动态变化影响。如图6所示，盐处理24小时后碳点显著促进甘薯根伸长区细胞na

外排活性，而在处理液中添加入na

/h

逆向转运蛋白抑制剂阿米洛利(amiloride)后，na

外排活性被抑制，由此可知，本发明制备得到的碳点通过激活植物根系细胞质膜na

/h

逆向转运蛋白活性调控na

外排，降低根系对na

的吸收。
61.已有的研究表明，由sos1、sos2和sos3三个蛋白组成的sos途径是植物响应盐胁迫的主要信号途径，其中位于质膜上的na

/h

逆转运蛋白基因sos1调控植物根系na

的外排，sos2和sos3的作用是调节sos1活性。因此，本发明测定了sos信号途径中三个基因的相对表达量，如图7所示，盐胁迫下，碳点显著上调甘薯幼苗根系ibsos2和ibsos3的表达，从而有效上调ibsos1基因表达。由此可知，本发明制备得到的碳点主要通过激活sos信号途径，上调相关基因表达，从而增强na

/h

逆向运输活性，促进甘薯根系na

外排，缓解na

毒害。
62.为了探究本发明所制备碳点对低铁胁迫下甘薯幼苗生长的影响，处理10天后观察不同处理下甘薯幼苗的表型，如图8所示，与对照相比，单独碳点处理对甘薯幼苗的生长没有显著影响，低铁胁迫下甘薯幼苗出现低铁胁迫症状，新叶明显失绿变黄，而碳点处理下甘薯幼苗的低铁胁迫症状得到显著缓解。进一步利用icp-ms测定甘薯幼苗根、茎和叶中铁离子含量，如图9所示，低铁胁迫下甘薯幼苗根和叶中的铁离子含量明显降低，而碳点处理下低铁胁迫的甘薯幼苗根和叶中铁离子含量显著增加。由此可知，本发明制备得到的碳点能够有效提高甘薯幼苗对铁离子的吸收利用效率。
63.铁元素与植物体光合作用有着密切的联系，不仅影响光合作中的氧化还原系统，还直接参与co2还原过程，同时铁参与植物叶绿素的生物合成，因此缺铁会使叶绿体结构发育不完整，导致植株叶片缺铁黄化，光合能力下降，使得农作物的产量和品质受到巨大损失。如图10所示，低铁胁迫下甘薯幼苗的叶绿素含量显著降低，而碳点处理下低铁胁迫的甘薯幼苗的叶绿素含量显著增加，上述结果进一步证明本发明制备得到的碳点能够有效提高甘薯幼苗对铁离子的吸收利用效率。图11表示不同处理下甘薯幼苗叶片的净光合速率，由图可知，低铁胁迫会显著影响甘薯幼苗的净光合速率，而碳点处理下低铁胁迫的甘薯幼苗的净光合速率显著增加。由此可知，本发明制备得到的碳点通过提高低铁胁迫下甘薯幼苗对铁离子的吸收利用效率而提高植物的光合能力。
64.为了探究碳点提高植株铁吸收和利用效率的分子机制，我们测定了调控植物低铁胁迫响应相关基因的表达量。irt1基因是双子叶植物中最重要的fe
2
转运蛋白基因，是一种广泛的二价金属离子载体。研究表明，低铁胁迫下，fit分别在转录和蛋白水平上调控irt1基因表达。ca
2
感受器cbl1正调控fit基因。因此，如图12所示，碳点处理显著促进甘薯根系ibcbl1和ibfit基因上调表达。同样，低铁胁迫120h后，与单独低铁胁迫的甘薯幼苗相比，碳点处理下低铁胁迫的甘薯幼苗根系中ibcbl1和ibfit基因显著上调表达，从而使得fe
2
转运蛋白基因ibirt1明显上调表达，促进甘薯根系对铁力的吸收，缓解甘薯低铁胁迫。
65.综上所述，本发明制备得到的碳点通过上调低铁胁迫响应相关基因的表达，促进甘薯幼苗根系对铁离子的吸收和利用效率，提高甘薯幼苗的光合能力，从而缓解甘薯幼苗的低铁胁迫。
66.由于逆境胁迫能够诱导植物细胞ca
2
信号产生，进而激发磷酸化级联反应并作用于细胞防御蛋白，调节相应防御基因表达，进而提高植物的抗逆性。研究表明，植物盐胁迫和低铁胁迫最先被ca
2
信号的感受器所感知，然后调控植物sos途径相关基因和fe
2
转运蛋
白基因表达，从而提高植物的耐盐性和抗低铁胁迫的能力。因此，我们检测碳点对植物根系ca
2
流动变化的影响，如图13所示，碳点处理30min后植物根系ca
2
显著内流。综合上述，本发明制备的碳点通过激活植物中ca
2
信号调节相应防御基因表达，从而提高不同胁迫下植物的抗逆性。其中数据分析采用单因素方差分析和最小显著差法进行差异显著性检验，图中星号表示不同处理之间分别在p《0.01(**)和p《0.01(***)p《0.0001(****)，时，具有显著差异，“ns”表示没有显著差异。
67.由以上实施例可知，本发明所用的碳源均为天然的生物质，来源丰富，价格便宜，适宜在农业中广泛应用。本发明提供的碳点具有制备方法简单、产量高、水溶性好及生物相容性良好等特性，其在提高植物抗逆性中的应用方面具有显著效果。