一种在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及用于非人灵长类动物示踪人源间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)是一种存在于骨髓、脂肪、肌肉等胚内组织以及胎盘和脐带等胚外组织的未分化多能细胞，具有自我更新、高增殖、多向分化、无免疫原性等特点。msc在体内还可以归巢到受损器官组织，达到修复的作用。不仅如此，msc在刺激下可分泌趋化因子、生长因子、细胞因子以及抗炎小分子等，在治疗炎症性疾病中，可调控炎症微环境而改善疾病。截止到2021年,世界范围内在clinicaltrials.gov上登记的msc相关的临床试验己超过1090项,其中国内超过270项。超过240项旨在为msc在多种疾病治疗中的安全性和有效性做出初步评估的研究己经完成,其中主要涉及到炎症性疾病、移植排斥、心血管疾病和器官损伤等。
3.尽管msc在治疗多种疾病上取得了进展,然而现有的基于msc的治疗方法大多是关注于这些细胞在治疗中的安全性和有效性的初步研究。由于人体试验的伦理和安全性等限制，对于其归巢到受损部位而发挥作用的具体机制尚不清楚。因此，利用动物模型进行临床前研究可为其提供重要的基础评价。相比较其他动物，非人灵长类实验动物是人类的近亲，与人类的遗传物质相似性约为75％-98.5％，在神经系统、组织结构、生理和代谢功能等方面的生物学特征同人类相似。利用非人灵长类动物建立的疾病动物模型，因其疾病发展过程、临床症状、发病机制与人类具有相似性，已成为解决人类健康与疾病问题的基础研究和应用研究的理想动物模型。但与此同时也会存在弊端，由于遗传性高度相似，很难区分出猴模型组织中的人源细胞。这就为研究带来了一定困难。
4.名称为“人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法”的中国专利申请文件(申请号202011399065x)，提出了通过荧光定量pcr，检测动物组织脏器中人源间充质干细胞的dna浓度，从而推算细胞数，但该方法只是检测动物组织里是否含有细胞，并没有彻底解决细胞究竟具体存在组织脏器的哪个具体位置。事实上，对于疾病模型或者患病人体中，注射的细胞会归巢到受损部位的某个位置，受损程度不同，内环境不同，也会有不同的归巢效应。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，不但能避免在间充质干细胞中引入外源标记基因，而且能够精确检测到细胞存在哪个位置。
6.本发明的特征在于：将人源间充质干细胞引入到非人灵长类动物体内，处死该动物后对其相应的组织进行人特异性基因arhgap11b能观测的检测，该人特异性基因的分布情况就是人源间充质干细胞的分布情况。
7.如何将人源间充质干细胞引入到非人灵长类动物体内，以及如何对非人灵长类动物arhgap11b进行能观测的检测都是已有技术，为本专业技术人员所知晓。
8.例如，按照本发明方法，其具体步骤可以是：
9.方法一。将体外培养人源msc静脉注射到非人灵长类动物内，然后处死动物,对相应的器官组织制作成冰冻切片，随后用rnascope技术对组织切片进行arhgap11b染色和观察。
10.方法二。将体外培养人源msc静脉注射到非人灵长类动物内，然后处死动物,对相应的器官组织制作成冰冻切片，随后对组织切片进行arhgap11b免疫荧光染色和观察。
11.所述的非人灵长类动物优选猕猴。所述进行人特异性基因arhgap11b检测优选上面的方法一。
12.本发明通过对人特异性基因arhgap11b(rho gtpase-activating protein 11b)的鉴定，可成功区分出在猴组织中的人源间充质干细胞，这就为猴模型中人源间充质干细胞的示踪提供了技术方法，同时避免了在间充质干细胞中引入外源标记基因，使其更加安全，更易使用于临床研究中。
13.本发明的原理是：arhgap11b为人特异性基因，非人灵长类动物中不能表达，而人源间充质干细胞必然表达。我们的实验也证实了该事实(见图1)。
14.第一步：体外获得人源脐带来源的间充质干细胞(huc-msc)，trizol提取rna，反转录成cdna后用rt-pcr方法进行arhgap11b的鉴定。
15.第二步：收集猕猴各脏器(心、肝、脾、肺、肾)组织，trizol提取rna，反转录成cdna后用rt-pcr方法进行arhgap11b的鉴定。
16.第三步：结果显示，在猕猴各个组织中不表达arhgap11b。人源脐带来源的间充质干细胞表达arhgap11b。
17.本发明的优点是不但能避免在间充质干细胞中引入外源标记基因，而且能够精确检测到细胞存在哪个位置，特异性高。
附图说明
18.图1为rt-pcr方法检测arhgap11b表达的凝胶电泳图。其中纵坐标为dna的大小(kd)值，横坐标中1为阴性对照水。2为猕猴心组织。3，4为猕猴肝组织。5为猕猴脾组织。6，7为猕猴肺组织。8为猕猴肾组织。9，10，11为人脐带来源间充质干细胞。
19.图2为猕猴心脏组织中人源细胞的arhgap11b的表达图。
20.图3为猕猴肝脏组织中人源细胞的arhgap11b的表达图。
21.图4为猕猴脾脏组织中人源细胞的arhgap11b的表达图。
22.图5为猕猴肺脏组织中人源细胞的arhgap11b的表达图。
23.图6为猕猴肾脏组织中人源细胞的arhgap11b的表达图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
25.实施例1
26.第一步：体外扩增huc-msc，将细胞收集到生理盐水中，静脉注射到猕猴体内。猕猴安乐死后取材，心脏组织在4％的多聚甲醛液固定后，移至切片机中，制作心脏组织冰冻切片。
27.第二步：将制作好的冰冻切片室温平衡后经过rna-scope方法染色后，结果显示，可明显观察到移植细胞的猕猴心脏组织表达arhgap11b(如图2所示)。
28.实施例2
29.第一步：体外扩增huc-msc，将细胞收集到生理盐水中，静脉注射到猕猴体内。猕猴安乐死后取材，肝组织在4％的多聚甲醛液固定后，移至切片机中，制作肝组织冰冻切片。
30.第二步：将制作好的冰冻切片室温平衡后经过rna-scope方法染色后，结果显示，可明显观察到移植细胞的猕猴肝组织表达arhgap11b(如图3所示)。
31.实施例3
32.第一步：体外扩增huc-msc，将细胞收集到生理盐水中，静脉注射到猕猴体内。猕猴安乐死后取材，脾脏组织在4％的多聚甲醛液固定后，移至切片机中，制作脾脏组织冰冻切片。
33.第二步：将制作好的冰冻切片室温平衡后经过rna-scope方法染色后，结果显示，可明显观察到移植细胞的猕猴脾脏组织表达arhgap11b(如图4所示)。
34.实施例4
35.第一步：体外扩增huc-msc，将细胞收集到生理盐水中，静脉注射到猕猴体内。猕猴安乐死后取材，肺组织在4％的多聚甲醛液固定后，移至切片机中，制作肺组织冰冻切片。
36.第二步：将制作好的冰冻切片室温平衡后经过rna-scope方法染色后，结果显示，可明显观察到移植细胞的猕猴肺组织表达arhgap11b(如图5所示)。
37.实施例5
38.第一步：体外扩增huc-msc，将细胞收集到生理盐水中，静脉注射到猕猴体内。猕猴安乐死后取材，肾组织在4％的多聚甲醛液固定后，移至切片机中，制作肾组织冰冻切片。
39.第二步：将制作好的冰冻切片室温平衡后经过rna-scope方法染色后，结果显示，可明显观察到移植细胞的猕猴肾组织表达arhgap11b(如图6示)。

技术特征：
1.一种在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，其特征在于：将人源间充质干细胞引入到非人灵长类动物体内，处死动物后对其相应的组织进行人特异性基因arhgap11b能观测的检测，该人特异性基因的分布就是人源间充质干细胞的分布。2.如权利要求1所述的在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，其特征在于：将体外培养人源msc静脉注射到非人灵长类动物内，然后处死动物,对相应的器官组织制作成冰冻切片，随后用rnascope技术对切片进行arhgap11b染色和观察。3.如权利要求1所述的在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，其特征在于：将体外培养人源msc静脉注射到非人灵长类动物内，然后处死动物,对相应的器官组织制作成冰冻切片，随后对切片进行arhgap11b免疫荧光染色和观察。4.如权利要求1所述的在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的非人灵长类动物为猕猴。

技术总结
一种在非人灵长类动物中示踪人源间充质干细胞的方法，属生物技术领域。将人源间充质干细胞引入到非人灵长类动物体内，处死动物后对其相应的组织进行人特异性基因ARHGAP11B能观测的检测，该特异性基因的分布就是人源间充质干细胞的分布。按本发明，可将体外培养人源MSC静脉注射到非人灵长类动物内，然后处死动物,对相应器官组织制作成冰冻切片，用RNAscope技术对切片进行ARHGAP11B染色和观察，或进行ARHGAP11B免疫荧光染色和观察。原理是ARHGAP11B为人特异性基因，非人灵长类动物中不能表达，而人源间充质干细胞必然表达。本发明不但能避免在间充质干细胞中引入外源标记基因，而且能够精确检测到细胞存在哪个位置，特异性高。特异性高。特异性高。


技术研发人员：李珊珊 司维 严亚萍
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2022.03.09
技术公布日：2022/5/25