一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-IFT46及其应用

一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46及其应用
技术领域
1.本发明属于生物肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46及其应用。


背景技术：

2.目前，皮肤黑素瘤(cutaneous malignant melanoma，cm)是最具侵袭性的皮肤癌类型，仍然是世界范围内皮肤癌相关死亡的首要原因。近年，免疫疗法和靶向治疗方法为黑素瘤的治疗提供了新的思路，其治疗具有一定的效果，一定程度上能够延长患者的生存期，但是符合临床使用标准的治疗手段仍然有限，并且对于已经出现了肿瘤转移的晚期黑色素瘤患者而言，现有药物和包括靶向治疗在内的不同治疗策略并未显著提高晚期黑素瘤患者的生存率和生存期。因此，寻找新的诊断标志物，提供更有效的治疗靶点是迫切和必要的。
3.环状rna(circrna)是一种特殊类型的非编码rna，与线性rna相比，circrna是通过非规范剪接产生的，没有游离的3
′
端和5
′
端，这使得它们能够抵抗核糖核酸酶；同时，作为一种共价封闭的环状分子，circrnas比其他rna更稳定。此外，circrna在真核细胞中广泛存在，具有一定的组织特异性，时空特异性和疾病特异性，其中大多数是高度保守的。越来越多的证据表明，circrnas通过多种机制在肿瘤进展和转移中发挥着潜在的中介作用。因此，circrnas很可能成为有用的治疗靶点分子，并被证明是治疗癌症的理想生物标志物。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有药物和包括靶向治疗在内的不同治疗策略并未显著提高晚期黑素瘤患者的生存率和生存期。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：以生物大分子为主要代表的肿瘤标志物，虽然研究广泛，但是符合临床使用标准的肿瘤标志物仍然有限；靶向治疗药物精准且缓解率高，但维持时间短暂，且不能避免耐药情况发生，对于晚期患者收益不佳；同时黑素瘤治疗方法首选手术，并根据不同分期对手术切除界限进行调整，而术中往往很难判断，因此亟待寻找可靠的术前肿瘤标志物，对肿瘤分期进行判断。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：皮肤bcc、cscc及黑色素瘤中circrna的显著上调或下调及其在其他肿瘤系的异常表达提示，肿瘤的发生与致癌基因异常剪接circrna有密切关系。circrna可作为一种快速诊断指标，可指导对患者预后的判断及指导手术方法。此外，circrna作为mirna海绵的作用，即circrna的多个mirna结合位点来吸附mirna，或与rna结合蛋白相结合来影响mrna表达，可为未来靶向治疗肿瘤提供新思路。通过适当修改circrna分子，沉默与癌症相关的重要结合位点，也可以针对特定的分子药物来改变下游的基因表达以治疗癌症。由此来看circrna在临床诊断和治疗中的应用有望成为转化医学和精准医学的新的立足点。
7.虽然肿瘤标志物的研究如火如荼，各种生物大分子在肿瘤中的差异表达的研究也不断深入，但是符合临床使用标准的肿瘤标志物仍然非常有限。基于现有技术的现状与基础，本技术的发明人拟提供一种具有特异性的标志物，具体涉及一种诊断早期肿瘤的标志物、检测试剂盒及其用途。
8.黑色素瘤具有恶性程度高、进展迅速，转移早等特征，而且，近年来，免疫疗法和靶向治疗方法的飞速进展使得黑色素瘤的临床病史发生了革命性的变化，其治疗具有一定的效果，能够显著性地延长患者的生存期，但是这受限于临床的运用，并且对于已经出现了肿瘤转移的晚期黑色素瘤患者而言，目前仍然还没有令人满意的治疗方法。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46及其应用，尤其涉及has_circ-ift46及其在制备皮肤黑素瘤诊断制剂中的应用和诊断试剂盒。
10.本发明是这样实现的，一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46，所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46的核苷酸序列为seq id no.1。
11.本发明的另一目的在于提供一种所述的皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46作为皮肤黑素瘤靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤药物中的应用。
12.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46的用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂。
13.进一步，所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为seq id no.2，所述下游引物的核苷酸序列为seq id no.3。
14.本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备诊断皮肤黑素瘤的产品中的应用。
15.进一步，所述诊断皮肤黑素瘤的产品包括检测hsa_circ-ift46的检测试剂。
16.进一步，所述诊断皮肤黑素瘤的产品还包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
17.本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备皮肤黑素瘤的诊断试剂盒中的应用。
18.进一步，所述皮肤黑素瘤的诊断试剂盒还包括组织rna提取试剂、检测hsa_circ-ift46的检测试剂、去基因组dna试剂和一步法逆转录pcr试剂。
19.进一步，所述皮肤黑素瘤的诊断试剂盒用于检测肿瘤组织hsa_circ-ift46的表达水平。
20.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46中，基于基因芯片测序的结果，筛选出在早期cm中特异性低表达的分子circ-ift46，通过在组织样本中验证其表达量，发现circ-ift46有潜力作为cm的肿瘤标志物，并有希望应用于疾病的诊断和治疗靶点的开发。
21.本发明提供了一种用于检测has_circ-ift46分子靶标的试剂及诊断试剂盒，该试剂和试剂盒可以检测组织has_circ-ift46的表达水平进而衡量患者皮肤黑素瘤的恶性程度，从而区分皮肤黑素瘤患者的不同肿瘤进展阶段，为预测黑素瘤进展及判断转归的分子靶标。
22.本发明提供了一种用于检测circ-ift46靶标的检测试剂盒及应用，circ-ift46作为皮肤黑素瘤分子靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤的药物中的用途。本发明通过收集12例皮肤黑素瘤组织及其癌旁组织，利用qrt-pcr技术检测了circ-ift46的
表达情况；利用qrt-pcr技术检测了circ-ift46在黑素瘤细胞株(wm451，wm35)和正常黑色素细胞(hem1)中表达情况。结果显示，与癌旁组织相比，circ-ift46在12例皮肤黑素瘤组织中明显低表达，circ-ift46表达水平在皮肤黑素瘤组织中大约是癌旁组织的0.5倍(p＝0.0010)；circ-ift46表达水平在wm451，wm35中也在hme1表达水平的0.5倍以下(p《0.001)。因此，circ-ift46在皮肤黑素瘤组织中低表达，提示circ-ift46可能成为皮肤黑素瘤诊断标志物，以及用于制备诊断皮肤黑素瘤的试剂，对于皮肤黑素色瘤的诊断和治疗具有重大价值。
23.本发明中的circ-ift46可作为早期黑素瘤诊断生物标志物，其在早期黑素瘤肿瘤或早期mm患者血清中呈特异性低表达现象；通过检测受试者体内的circ-ift46表达，可以快速、准确及清楚的评估黑素瘤的进展阶段。circ-ift46的表达降低对cm具有及时有效的指示作用，敏感性和特异性俱佳，从而为早期mm的发现提供了新的线索，为临床医生对于早期mm的诊断提供了参考依据。本发明通过液体诊断的方法，降低患者创伤程度和诊断成本，良好的敏感性和特异性对早期mm做出判断，适用于大规模的早期mm人群筛查。
24.综上，本发明的优点和积极效果在于：
25.1.本发明公开了circ-ift46在皮肤黑素瘤患者肿瘤组织中的表达情况以及circ-ift46在皮肤黑素瘤细胞中发挥的功能。
26.2.首次发现circ-ift46可作为皮肤黑素瘤诊断生物标志物和药物治疗靶点。
27.3.与正常对照相比，circ-ift46在皮肤黑素瘤患者肿瘤组织显著下调。
28.4.本发明的结果表明circ-ift46过表达可以抑制皮肤黑素瘤细胞的迁移及侵袭能力，表明circ-ift46在皮肤黑素瘤的发生发展中发挥抑癌基因的作用，为临床治疗黑素瘤提供了新的靶点。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明实施例提供的circrna微阵列杂交图像。
31.图2是本发明实施例提供的circrna层次聚类示意图。
32.图3是本发明实施例提供的hme1、wm35、wm451中circ-ift46的表达情况示意图。
33.图4是本发明实施例提供的12例早期cm组织及匹配的正常组织中circ-ift46的表达情况示意图。
34.图5是本发明实施例提供的根据组织中circ-ift46的表达情况绘制的roc曲线示意图。
35.图6是本发明实施例提供的fish实验检测circ-ift46在wm35、wm451细胞中分布情况示意图。
36.图7是本发明实施例提供的mtt实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞增殖能力的变化示意图。
37.图8是本发明实施例提供的流式细胞仪检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、
wm451细胞凋亡能力的变化示意图。
38.图9是本发明实施例提供的transwell实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞转移能力的变化示意图。
39.图10是本发明实施例提供的划痕实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞转移能力的变化示意图。
40.图11-12是本发明实施例提供的过表达circ-ift46后的cm细胞比对照组cm细胞增殖能力明显被抑制的效果图。
具体实施方式
41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
42.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
43.本发明实施例提供的皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46，作为皮肤黑素瘤靶标，用于制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤药物；所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46的核苷酸序列为seq id no.1。
44.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
45.实施例1：circ-ift46作为靶点在抑制皮肤黑素瘤药物中的应用
46.本发明涉及生物技术领域，尤其是提供了一种用于检测circ-ift46靶标的检测试剂盒及应用，circ-ift46作为皮肤黑素瘤分子靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤的药物中的用途。收集12例皮肤黑素瘤组织及其癌旁组织，利用qrt-pcr技术检测了circ-ift46的表达情况；利用qrt-pcr技术检测了circ-ift46在黑素瘤细胞株(wm451，wm35)和正常黑色素细胞(hem1)中表达情况。结果显示，与癌旁组织相比，circ-ift46在12例皮肤黑素瘤组织中明显低表达，circ-ift46表达水平在皮肤黑素瘤组织中大约是癌旁组织的0.5倍(p＝0.0010)；circ-ift46表达水平在wm451，wm35中也在hme1表达水平的0.5倍以下(p《0.001)。因此，circ-ift46在皮肤黑素瘤组织中低表达，提示circ-ift46可能成为皮肤黑素瘤诊断标志物，以及用于制备诊断皮肤黑素瘤的试剂。对于皮肤黑素色瘤的诊断和治疗具有重大价值。
47.本发明实施例提供的用于检测has_circ-ift46分子靶标的试剂及诊断试剂盒，该试剂和试剂盒可以检测组织has_circ-ift46的表达水平进而衡量患者皮肤黑素瘤的恶性程度，从而区分皮肤黑素瘤患者的不同肿瘤进展阶段，为预测黑素瘤进展及判断转归的分子靶标。
48.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
49.作为本发明所述用途的优选实施方式，所述has_circ-ift46的核苷酸序列如seq id no.1所示。
50.本发明是一种黑素瘤诊断标志物，所述诊断标志物为环状rna circ-ift46，核苷酸序列如seq id no.1所示。
51.环状rnacirc-ift46在制备早期黑素瘤诊断工具中的应用。
52.进一步的，所述工具为试剂盒。
53.进一步的，所述工具包括用来扩增特异性识别环状rna circ-ift46的核酸序列的引物对。
54.进一步的，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，circrna引物的设计不同于普通线性rna，是针对circrna的back-spliced junction位点设计特异性的引物(divergent primers)。
55.所述的试剂盒的制备可采用本领域已知的生物试剂盒的常规制造方法，本发明中的circ-ift46可以是天然的或是人工合成的。
56.本发明中circ-ift46可作为早期黑素瘤诊断生物标志物，其在早期黑素瘤肿瘤或早期mm患者血清中呈特异性低表达现象；通过检测受试者体内的circ-ift46表达，可以快速、准确及清楚的评估黑素瘤的进展阶段。circ-ift46的表达降低对cm具有及时有效的指示作用，敏感性和特异性俱佳，从而为早期mm的发现提供了新的线索，为临床医生对于早期mm的诊断提供了参考依据。本发明通过液体诊断的方法，降低患者创伤程度和诊断成本，良好的敏感性和特异性对早期mm做出判断，适用于大规模的早期mm人群筛查。
57.实施例2：黑素瘤细胞中差异表达的circrna的筛选及验证过程如下：
58.1.细胞培养和试剂
59.人类黑色素细胞hme1、低转移性黑素瘤细胞系wm35和高转移性黑素瘤细胞系wm451购自美国类型培养物收藏中心(atcc；manassas，va，usa)。将细胞与dulbecco改良eagle培养基(dmem；gibco；thermo fisher scientific，inc.，waltham，ma，usa)在37℃的5％co2培养箱中培养，该培养基含有10％胎牛血清(fbs)。本研究中的试剂包括无rna提取试剂盒(invitrogen life technologies，carlsbad，ca，usa)，opti mem i还原血清培养基(invitrogen life technologies)、transwell 6孔板(孔径8-μm；美国纽约州康宁市康宁公司)、matrigel基底膜(美国新泽西州富兰克林湖区becton、dickinson和company)、核糖核酸酶水中的无核糖核酸酶糖原(invitrogen life technologies)、arraystar人类circrna阵列(8
×
15k；arraystar，rockville，md，usa)包括5396个circrna，goldview染料(sbs genetech co.，ltd.，上海，中国)，2
×
pcr主混合物(arraystar)和上标
tm
iii逆转录酶(invitrogen life technologies)。实验由康晨生物科技有限公司(中国上海)进行。
60.2.rna提取
61.根据制造商的说明，使用rna提取试剂盒从细胞中提取总rna，并通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。28s和18s条带清晰，28s条带的亮度约为18s条带的两倍，表明总rna的完整性。紫外分光光度计用分光光度法测定rna的浓度和纯度。d260/d280nm的比率为1.8～2.1。这些结果表明总rna的纯度适用于随后的circrna微阵列分析和定量荧光pcr。
62.3.circrna微阵列
63.为了分析采集的阵列图像，执行agilent feature extraction软件(version 11.0.1.1；agilent technologies，inc.，santa clara，ca，usa)。遵循arraystar super rna标记工具包(arraystar)的说明，每个样本的总rna用随机引物扩增并反转录成荧光标记的crna。随后，荧光标记的crna在arraystar人类circrna阵列(8
×
15k；arraystar)上杂交然后在65℃的安捷伦杂交烘箱中培养17小时。洗涤后，在agilent扫描仪(g2505c)上扫描
样品。
64.4.circrna微阵列的数据收集与分析
65.荧光强度在微阵列扫描仪中扫描，并加载到agilent特征提取软件以读取和分析原始数据http://www.cytoscape.org/3.3.2，r语言用于分位数标准化和随后的数据处理。通过fold change和p值筛选组间差异表达的circrna。p《0.05的值被认为是具有统计学意义的差异。聚类分析显示使用cluster 3.0软件的差异表达circrna(r编程语言包：gplots)。如图1所示，circrna微阵列杂交图像：arraystar human circrna阵列在hme1、wm35和wm451细胞中检测到5396个circrna。hme1、wm35和wm451细胞的基因组扫描。如图2所示，circrna层次聚类：hme1、wm35和wm451细胞中部分差异表达的环状rna的热图和层次聚类。红色，高表达；绿色，低表达。
66.由以上筛选过程锁定了3个高质量的circrna，这3个circrna的测序结果见表1。
67.表1 circrna测序结果
[0068][0069]
6.在对这3个circrna的表达情况在hme1、wm35、wm451中进行qrt-pcr检测，结果见表2，circ0008157在黑素瘤细胞中表达情况见图3。
[0070]
表2 qrt-pcr检测结果
[0071][0072][0073]
7.根据qrt-pcr结果，最终选定circ0008157，即circ-ift46用于进一步研究。circ-ift46是发明人通过二代测序发现的新的环状rna分子，由发明人命名，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其序列在申请日前未经公开。
[0074]
8.组织样本收集
[0075]
在实施例一的基础上，采用相同的处理方式，发明人收集12例cm组织以及12例与肿瘤相邻的正常组织(距离癌组织5cm)(用于研究的样本采样，分装，保存条件统一)；以上研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
[0076]
9.trizol法提取rna及浓度、纯度检测
[0077]
根据制造商的说明，使用使用trizol试剂(thermofisher，carlsbad，ca，美国)从
组织样本中分离和纯化总rna，主要步骤如下：取少量步骤1中的组织样本置于液氮中研磨后转至1.5ml的无rnase的ep管，加1ml的trizol溶液反复颠倒混匀，室温静置5min；ep管中加0.5ml氯仿后摇匀，室温静置5min后4℃、12000rpm离心15min；取上清至新的1.5ml的无rnase ep管中(约400～500μl)，加入500μl异丙醇，充分混匀，室温静置10min后4℃、12000rpm离心10min；弃上清，用提前预冷的75％的乙醇(含depc水)振荡洗涤rna后，4℃、7500rmp离心5min；弃上清，加20μl的depc水后溶解。提取的rna采用nanodrop
tm
one(thermo scientific
tm
)超微量紫外-可见光分光光度计检测其浓度及纯度，并迅速进行下一步反转录。
[0078]
10.cdna合成
[0079]
根据制造商的说明，使用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(fermentas#k1631；thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)在42℃2min去除基因组dna后，37℃ 15min，85℃ 5sec将组织rna逆转录成cdna。使用revertaid h minus first strand cdna synthesis kit(thme1rmo scientific
tm
)在25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min条件下将血清rna逆转录成cdna，并立即储存在-80℃直至使用。
[0080]
11.使用定量逆转录酶聚合酶链反应(qrt-pcr)测量circ-ift46在组织中的表达。
[0081]
为了定量，使用qpcr sybr green master mix(yeasen)试剂盒在quantstudio
tm 5real-time pcr system，96-well，0.2ml(applied biosystems
tm
)上进行实时pcr分析。qrt-pcr在以下条件下进行：95℃进行5分钟的初始变性步骤，接下来45个循环的95℃ 10sec，特异性退火温度60℃ 30sec。circ-ift46的引物序列如下：上游引物circ-ift46-f的序列为：5
′‑
gcacaacaucacagacuuctt-3
′
，如seq id no.2所示；下游引物circ-ift46-r的序列为：5
′‑
gaagucugugauguugugctt-3
′
，如seq id no.3所示。
[0082]
12.结果分析
[0083]
所有统计分析均使用spss 21.0软件进行。对于连续变量，如果遵循正态分布，则使用学生t检验来比较差异。进行roc曲线分析以估计诊断灵敏度和特异性。所有统计学检验均为双侧，p《0.05被认为具有统计学意义。
[0084]
如图4所示，在12例早期mm组织与12例正常组织中验证其表达量，结果与测序结果一致，circ-ift46在早期mm组织中特异性高表达，p《0.0001，差异有统计学意义，并根据qrt-pcr结果绘制roc曲线，如图5所示，auc＝0.896，(95％ci:0.001to 0.704，p＝0.0001)。结果表明，circ-ift46作为cm诊断的标志物具有良好的敏感性和特异性。
[0085]
实施例3：circ-ift46影响黑素瘤进展的体内体外实验验证
[0086]
使用rna-fish与免疫荧光共染色验证circ-ift46在细胞中位置分布情况。
[0087]
circ-ift46探针由ribobio(中国)设计和提供。根据制造商的说明，首先将细胞固定在4％甲醛中10分钟，然后用0.5％triton x-100在pbs中洗涤5分钟。固定细胞在37℃下与标记的fish探针杂交过夜。杂交后，对载玻片进行冲洗、干燥，并用抗淬灭封片剂进行封片。使用荧光显微镜获取图像。dapi(蓝色显示)用于标记核dna，u6用作内部对照。结果如图6所示，circ-ift46在细胞核和细胞质中均有分布，但主要位于细胞核内。
[0088]
使用mtt实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞增殖能力的变化情况。
[0089]
用sirna或质粒处理的细胞在96孔板(每孔500个细胞)中培养。首先，将50μl mtt
添加到孔中的细胞中并培养4h。随后，添加150μl二甲基亚砜以溶解mtt晶体。使用分光计在570nm处测量每个孔的光吸收值。结果如图7所示，与circ-ift46上调细胞相比，circ-ift46沉默细胞的增殖显著增加。
[0090]
使用流式细胞仪检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞凋亡能力的变化情况。
[0091]
通过离心收集细胞。根据制造商的方案，使用annexin v-fluorescein isothiocyanate(fitc)/propidium iodide(pi)染色试剂盒(mb-chem mumbai，india)在室温下黑暗中对细胞进行15分钟的染色。在1小时内通过双色流式细胞术对细胞进行分析。所有试验均一式三份进行。结果如图8所示，与circ-ift46上调细胞相比，circ-ift46表达沉默可下调wm451和wm35细胞的凋亡能力。
[0092]
使用transwell实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞转移能力的变化情况。
[0093]
将100μl无血清培养基中的细胞(2
×
103)种植在24孔板中的transwell小室(孔径8μm，bd biosciences，newjersey，usa)的上腔中。transwell小室预涂有300ug/ml的matrigel基质(美国新泽西州生物科学公司)，并将完整培养基添加到下腔。48小时后，用甲醇固定下腔的侵入细胞，并用0.2％结晶紫染色。随机采集6个放大20倍的视野，并计数浸润的肿瘤细胞数量。结果如图9所示，circ-ift46沉默的cm细胞显示出比circ-ift46上调细胞更高的迁移和侵袭能力。
[0094]
使用划痕实验检测上调或下调circ-ift46表达后，wm35、wm451细胞转移能力的变化情况。
[0095]
细胞(1
×
105/ml)在6孔板中培养并生长至90％汇合。使用10μl移液管头在单层中部划开贴壁细胞，用pbs洗涤细胞两次，去除细胞碎片。在显微镜下于0小时拍摄照片。将平板置于37℃下5％co2的增湿大气中，并在48小时后再次拍摄伤口。图像上两个测量宽度之间的差异表示细胞迁移的程度。结果如图9,10所示，沉默circ-ift46后的cm细胞比circ-ift46上调细胞具有更高的迁移和侵袭能力。
[0096]
由此可以得出circ-ift46可抑制黑素瘤的进展，circ-ift46低表达可以预测黑素瘤低转移性、增殖性，高凋亡性。
[0097]
实施例4：
[0098]
使用circ-ift46过表达质粒在体内实验中验证高表达circ-ift46对黑素瘤进展的影响。
[0099]
1.circ-ift46过表达质粒的构建
[0100]
circ-ift46过表达质粒由吉凯(中国)设计和提供。根据制造商说明，circ-ift46过表达质粒的构建方法：首先合成人类circ-ift46的全长互补的cdna，并将这些cdna克隆到表达载体plc5-cir(吉赛)中形成circ-ift46过表达质粒(pcmv-circ-ift46-egfp)，其组成部分主要有增强启动子cmv、circ-ift46的全长互补的cdna克隆位点(mcs)、抗生素表达序列(puro及amp)和绿色荧光标签egfp，并将空白质粒(pcmv-egfp)作为对照组，用于后续体内实验的研究。
[0101]
2.步骤2，转染
[0102]
试验分为两组，分别为：(1)转染对照组：转染空质粒载体；(2)转染过表达质粒组：
转染circ-ift46过表达质粒。每孔的配置，取wm451、wm45，以1
×
106/孔的细胞数接种于6孔板中，1.5ml含10％胎牛血清、1％双抗，dmem细胞培养基；24小时内细胞汇合约达到70％；在250μl的dmem无血清培养基加入20μmol/l mimic 5μl混匀；用250μl无血清的dmem稀释7.5μl lipofectamin3000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的mimic和lipofectamin 3000试剂混合，混匀，室温放置25分钟；将500μl复合物加到含有细胞的培养板孔内，补加1ml的dmem无血清培养基，来回轻柔摇晃细胞培养板。将细胞在37℃的co2，培养箱中孵育过夜后，更换2ml培养基，继续孵育；待48h后，进行扩增。
[0103]
3.体内实验研究
[0104]
将正常培养wm35、wm451细胞，约3天传一代，至一定数量后开始各项分组操作。以1
×
106cells细胞量注射雄性balb/c裸鼠(4-6w周龄)，每注射点接种总体积0.2ml，选择皮下靠近四肢部位，该较容易成瘤。饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(约一周左右)。开始测量瘤体大小(最长径w和最短径h，3天一次，连续6次)。以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线[肿瘤体积按照公式(单位：mm3)：v＝w
×
h2×
0.52]。取瘤组织并照相。结果如图11,12所示，过表达circ-ift46后的cm细胞比对照组cm细胞增殖能力明显被抑制。
[0105]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46，其特征在于，所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46的核苷酸序列为seq id no.1。2.一种如权利要求1所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46作为皮肤黑素瘤靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤药物中的应用。3.一种应用如权利要求1所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-ift46的用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂。4.如权利要求3所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂，其特征在于，所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为seq id no.2，所述下游引物的核苷酸序列为seq id no.3。5.一种如权利要求3～4任意一项所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备诊断皮肤黑素瘤的产品中的应用。6.如权利要求5所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备诊断皮肤黑素瘤的产品中的应用，其特征在于，所述诊断皮肤黑素瘤的产品包括检测hsa_circ-ift46的检测试剂。7.如权利要求5所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备诊断皮肤黑素瘤的产品中的应用，其特征在于，所述诊断皮肤黑素瘤的产品还包括芯片、试剂盒或核酸膜条。8.一种如权利要求3～4任意一项所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备皮肤黑素瘤的诊断试剂盒中的应用。9.如权利要求8所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备皮肤黑素瘤的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述皮肤黑素瘤的诊断试剂盒包括组织rna提取试剂、检测hsa_circ-ift46的检测试剂、去基因组dna试剂和一步法逆转录pcr试剂。10.如权利要求8所述用于检测hsa_circ-ift46的检测试剂在制备皮肤黑素瘤的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述皮肤黑素瘤的诊断试剂盒用于检测肿瘤组织hsa_circ-ift46的表达水平。

技术总结
本发明属于生物肿瘤标志物技术领域，公开了一种皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-IFT46及其应用，所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-IFT46的核苷酸序列为SEQ ID No.1；所述皮肤黑素瘤诊断标志物has_circ-IFT46作为皮肤黑素瘤靶标，用于制备筛选预防、缓解和/或治疗皮肤黑素瘤药物。本发明circ-IFT46在皮肤黑素瘤组织中低表达，且低表达利于预后，提示circ-IFT46可成为皮肤黑素瘤诊断标志物，以及用于制备诊断皮肤黑素瘤的试剂，对于皮肤黑素色瘤的诊断和治疗具有重大价值；通过检测受试者体内circ-IFT46的表达，快速、准确及清楚的评估黑素瘤的进展阶段。评估黑素瘤的进展阶段。评估黑素瘤的进展阶段。


技术研发人员：周建大 史可 陈翔 陈舒悦 陈佳 刘灿
受保护的技术使用者：中南大学湘雅三医院
技术研发日：2022.03.08
技术公布日：2022/5/25