恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型及应用

1.本发明属于恶性胸腔积液相关病症诊疗相关领域，尤其涉及恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型及应用。


背景技术：

2.恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,mpe)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。肺腺癌是mpe的常见病因，mpe的出现表明肿瘤已播散至晚期，缺乏有效治疗方式。因此，建立一种简便的方式，用于分析mpe患者的部分临床指标和实验室检查结果，从而快速准确地判断其预后，对于mpe患者的临床治疗而言至关重要。mpe中富集着大量淋巴细胞、胸膜间皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞。这些细胞处于液态的肿瘤微环境中，合成并分泌了大量的细胞因子，参与细胞自身和细胞之间的信息传递和信号转导，精细地调控着微环境的免疫状态和代谢状态。虽然mpe中的细胞因子易于检测，但受限于检查方式和细胞因子的种类，简单地测定细胞因子的水平无法有效预测mpe患者的预后。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明提供恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型及应用，主要解决了现有的预后检测方法精确度低等问题。
4.为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
5.恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型，
6.细胞因子预后指数crpi＝n1*x1+n2*x2...n32*x32；其中，n1～n32分别依次为下表中所示系数，x1～x32分别依次为下表中细胞因子相对表达量
7.[0008][0009]
恶性胸腔积液患者预后评估的装置，包括检测单元和分析单元；
[0010]
所述检测单元检测样本中细胞因子的相对表达量；
[0011]
所述分析单元将细胞因子的相对表达量作为输入变量，输入预测模型，分析恶性胸腔积液患者预后状态；
[0012]
所述预测模型的方程式为：
[0013]
crpi＝-3.115330e-0*i-tac+1.429897e-01*mcp-3+4.677601e+00*il-22-1.052234e+00*psma1+9.575812e-01*cd172g+2.759669e+00*baff-1.049788e+00*langerin-2.477888e-01*cyr61+4.526791e+01*nesfatin-1-2.021309e-03*leptin-1.850907e-02*micb+3.083276e+00*igf-i sr-9.469615e+00*par1+1.963119e+00*pdgf-bb-2.563176e-01*grk5-1.756475e+00*nrf2+9.113579e+03*rcor1+9.154689e-03*galnt3-6.545235e-01*ve-cadherin-3.508497e-01*hao-1+1.127533e+00*trance-6.364047e-02*gpr111+4.366576e-02*ca5b+9.202173e-02*inhibin a-4.995190e-01*pdgf-aa-1.438236e-01*cd51+5.787222e+00*bcl-w+2.836709e+00*sost-7.533289e-01*mpif-1+1.635532e-03*gcp-2+3.031094e-02*tim-1+2.675134e+00*trailr4。
[0014]
在一些方式中，恶性胸腔积液患者预后评估的装置中，所述检测单元通过酶联免疫吸附法测定细胞因子浓度；
[0015]
在一些方式中，恶性胸腔积液患者预后评估的装置中，所述检测单元通过多通道luminex液相芯片定量检测。
[0016]
恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型或恶性胸腔积液患者预后的装置在
制备恶性胸腔积液预后诊断试剂或诊断设备中的应用。
[0017]
本发明的有益效果是：
[0018]
以细胞因子相对表达量作为输入变量构建预测模型，可以准确预测恶性胸腔积液患者预后的良恶性。有助于个体化预测mpe患者的预后情况，对临床医生进行mpe患者管理具有指导作用。
附图说明
[0019]
图1为细胞因子标准品梯度稀释；
[0020]
图2为受试工作者曲线roc curve；
[0021]
图3为两群mpe患者的生存曲线图；
[0022]
图4为mpe患者分为high-risk/low-risk两群绘制生存曲线。
具体实施方式
[0023]
本部分第一方面介绍mpe患者预后评测模型：
[0024]
恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型，
[0025]
细胞因子预后指数crpi＝n1*x1+n2*x2...n32*x32；其中，n1～n32分别依次为下表中所示系数，x1～x32分别依次为下表中细胞因子相对表达量，且一一匹配
[0026]
[0027][0028]
本部分第二方面介绍mpe患者预后评估的装置：
[0029]
其一，mpe患者预后预后评估的装置包括检测单元和分析单元；
[0030]
所述检测单元检测样本中细胞因子的相对表达量；
[0031]
所述分析单元将细胞因子的相对表达量作为输入变量，输入预测模型，分析恶性胸腔积液患者预后状态；
[0032]
所述预测模型的方程式为：
[0033]
crpi＝-3.115330e-0*i-tac+1.429897e-01*mcp-3+4.677601e+00*il-22-1.052234e+00*psma1+9.575812e-01*cd172g+2.759669e+00*baff-1.049788e+00*langerin-2.477888e-01*cyr61+4.526791e+01*nesfatin-1-2.021309e-03*leptin-1.850907e-02*micb+3.083276e+00*igf-i sr-9.469615e+00*par1+1.963119e+00*pdgf-bb-2.563176e-01*grk5-1.756475e+00*nrf2+9.113579e+03*rcor1+9.154689e-03*galnt3-6.545235e-01*ve-cadherin-3.508497e-01*hao-1+1.127533e+00*trance-6.364047e-02*gpr111+4.366576e-02*ca5b+9.202173e-02*inhibin a-4.995190e-01*pdgf-aa-1.438236e-01*cd51+5.787222e+00*bcl-w+2.836709e+00*sost-7.533289e-01*mpif-1+1.635532e-03*gcp-2+3.031094e-02*tim-1+2.675134e+00*trailr4。
[0034]
细胞因子的相对表达量即为相应细胞因子的检测浓度，根据不同的检测方式可采用不同的表示方式，但均应统一。其中除了本部分所述的方式，还可采用其他检测方式。
[0035]
其二，恶性胸腔积液患者预后评估的装置中，所述检测单元通过酶联免疫吸附测定细胞因子浓度；当然在实际操作中，采用其他能够检定的方法也等同在本发明范围内；
[0036]
更进一步，所述检测单元通过多通道luminex液相芯片定量检测，或采用其他等同的方式，能够实现一次多因子浓度检测。
[0037]
本部分第三方面介绍mpe患者预后评估模型和装置的设计：
[0038]
恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型或恶性胸腔积液患者预后的装置在制备恶性胸腔积液预后诊断试剂或诊断设备中的应用。
[0039]
本部分第四方面结合具体的研究项目介绍mpe患者预后预后评估模型和装置的应用：
[0040]
1.数据收集与研究设计：纳入mpe患者，通过胸腔穿刺引流收集患者的胸腔积液，同时检索武汉协和医院电子病历系统，查询并收集对应患者的临床信息，以及影像学检查和实验室检查结果。分析mpe患者的细胞因子检查结果。以40例mpe患者为训练集，24例mpe患者为验证集，在训练集中通过机器学习算法建立细胞因子预后信号，并在验证集中进行验证。本研究已通过华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会审批，编号为uhct-iec-sop-016-03-01，所有患者均已签署知情同意书。
[0041]
2.细胞因子测定：收集mpe患者的胸腔积液，通过离心获取上清，将收集的上清冻存于-80℃冰箱。通过多通道luminex液相芯片检测系统(novogene，china)检测40例mpe上清的细胞因子。通过细胞因子试剂盒检测24例mpe的特定细胞因子。
[0042]
3.机器学习模型构建：使用随机森林模型分析不同预后组的mpe患者的基线细胞因子信号的相关性。随机森林模型是一种基于决策树的集成算法，广泛应用于机器学习。在本发明专利中，40例luminex测序mpe细胞因子数据被用作训练集数据进行模型开发，boruta算法用于筛选特征细胞因子。boruta算法遵循着一种选择所有相关变量的方法，捕获所有与不良预后mpe具有强相关性或弱相关性的细胞因子信号。该特征选择方法减少在机器学习模型开发过程中纳入的变量，避免模型出现过度拟合，并提高模型的泛化性。最终的机器学习模型只包括特征变量筛选出的细胞因子。在本专利中，预后较差的mpe组被视为阳性。假阳性是指那些预后较好的mpe患者被错误的归类为预后较差组，假阴性是指预后较差的mpe患者被归类为预后较好组。roc曲线和样本外预测用于评价模型性能。通过机器学习模型得到的细胞因子信号用于预测mpe患者的预后，评估复合细胞因子的预后评价能力。使用kaplan-meier分析mpe患者不同组别复合细胞因子信号与患者总生存(overall survival，os)的预测值和实际值之间的相关性，使用log-rank检验评估统计差异。
[0043]
本部分第五方面验证预后模型：
[0044]
一、细胞因子测定(qah-cust芯片操作流程)
[0045]
1.实验材料及试剂
[0046]
1.1 qah-cust试剂盒，试剂盒包含内容：
[0047]
试剂盒存放在-20℃，开始使用后，玻片芯片、细胞因子标准混合粉末、检测抗体混合物、cy3-链霉亲和素应该存放在-20℃，其他试剂存放在4℃，避免反复冻融。
[0048]
盒子成分
[0049][0050]
1.2所需除试剂盒以外的材料及仪器：
[0051]
·
塑料离心管(2-5ml，50ml)
[0052]
·
摇床
[0053]
·
塑料保鲜膜
[0054]
·
铝箔纸
[0055]
·
双蒸馏水
[0056]
·
innoscan 300 microarray scanner荧光扫描仪
[0057]
·
thermo scientific wellwash versa芯片洗板机
[0058]
1.3样品：
[0059]
100个胸水
[0060]
2、实验步骤
[0061]
2.2玻片芯片的完全干燥
[0062]
将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
[0063]
2.3标准品的配置
[0064]
2.3.1细胞因子标准品梯度稀释如图1示。
[0065]
2.3.2添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为std 1。
[0066]
2.3.3分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。
[0067]
2.3.4抽取100μl的std 1加入到std2中轻轻混合，然后从std 2中抽取100μl加入到std 3中，如此梯度稀释至std7。
[0068]
2.3.5抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。
[0069]
注：因为每种细胞因子的起始浓度是不同的，所以std1到std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。
[0070]
2.4芯片操作流程
[0071]
2.4.1每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片。
[0072]
2.4.2抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品(样品原液上样)到孔中，4℃过夜孵育。
relatedprognostic index,crpi)：
[0103]
crpi＝-3.115330e-0*i-tac+1.429897e-01*mcp-3+4.677601e+00*il-22-1.052234e+00*psma1+9.575812e-01*cd172g+2.759669e+00*baff-1.049788e+00*langerin-2.477888e-01*cyr61+4.526791e+01*nesfatin-1-2.021309e-03*leptin-1.850907e-02*micb+3.083276e+00*igf-i sr-9.469615e+00*par1+1.963119e+00*pdgf-bb-2.563176e-01*grk5-1.756475e+00*nrf2+9.113579e+03*rcor1+9.154689e-03*galnt3-6.545235e-01*ve-cadherin-3.508497e-01*hao-1+1.127533e+00*trance-6.364047e-02*gpr111+4.366576e-02*ca5b+9.202173e-02*inhibina-4.995190e-01*pdgf-aa-1.438236e-01*cd51+5.787222e+00*bcl-w+2.836709e+00*sost-7.533289e-01*mpif-1+1.635532e-03*gcp-2+3.031094e-02*tim-1+2.675134e+00*trailr4。
[0104]
根据公式，计算训练集中每一个mpe患者的crpi。
[0105]
绘制受试工作者曲线roc curve(如图2中所示)，计算曲线下面积auc，计算cutoff值，cutoff＝8.601755e+12；
[0106]
根据cutoff值将crpi分为两群(high risk/low risk)，绘制high risk/low risk两群mpe患者的生存曲线图((如图3中所示)km曲线)，使用log-rank检测计算p值；
[0107]
结论：crpi可将训练集中的mpe患者分为高风险和低风险两群，具有较高的预后诊断价值。
[0108]
通过elisa测定24个mpe的细胞因子作为测试集，通过同样的公式计算crpi，以分析该模型预后诊断价值；
[0109]
检测24个新的mpe患者的32个细胞因子，通过与训练集相同的公式计算crpi，以训练集得到的cutoff值，将24个mpe患者分为high-risk/low-risk两群，绘制生存曲线(如图4中所示)，并计算p值；
[0110]
crpi可以较好地区分测试集mpe患者的预后，是一个具有较高预后诊断价值的指标。
[0111]
表1训练集细胞因子预后指数crpi
[0112][0113]
表2训练集和测试集mpe患者细胞因子以及临床数据
[0114][0115]
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

技术特征：
1.恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型，其特征在于，其细胞因子预后指数crpi＝n1*x1+n2*x2...n32*x32；其中，n1～n32分别依次为下表中所示系数，x1～x32分别依次为下表中细胞因子相对表达量序号细胞因子系数1i-tac-3.115330e-02mcp-31.429897e-013il-224.677601e+004psma1-1.052234e+005cd172g9.575812e-016baff2.759669e+007langerin-1.049788e+008cyr61-2.477888e-019nesfatin-14.526791e+0110leptin-2.021309e-0311micb-1.850907e-0212igf-isr3.083276e+0013par1-9.469615e+0014pdgf-bb1.963119e+0015grk5-2.563176e-0116nrf2-1.756475e+0017rcor19.113579e+018galnt39.154689e-0319ve-cadherin-6.545235e-0120hao-1-3.508497e-0121trance1.127533e+0022gpr111-6.364047e-0223ca5b4.366576e-0224inhibina9.202173e-0225pdgf-aa-4.995190e-0126cd51-1.438236e-0127bcl-w5.787222e+0028sost2.836709e+0029mpif-1-7.533289e-0130gcp-21.635532e-0331tim-13.031094e-0232trailr42.675134e+00。2.恶性胸腔积液患者预后评估的装置，其特征在于，包括检测单元和分析单元；所述检测单元检测样本中细胞因子的相对表达量；
所述分析单元将细胞因子的相对表达量作为输入变量，输入预测模型，分析恶性胸腔积液患者预后状态；所述预测模型的方程式为：crpi＝-3.115330e-0*i-tac+1.429897e-01*mcp-3+4.677601e+00*il-22-1.052234e+00*psma1+9.575812e-01*cd172g+2.759669e+00*baff-1.049788e+00*langerin-2.477888e-01*cyr61+4.526791e+01*nesfatin-1-2.021309e-03*leptin-1.850907e-02*micb+3.083276e+00*igf-i sr-9.469615e+00*par1+1.963119e+00*pdgf-bb-2.563176e-01*grk5-1.756475e+00*nrf2+9.113579e+03*rcor1+9.154689e-03*galnt3-6.545235e-01*ve-cadherin-3.508497e-01*hao-1+1.127533e+00*trance-6.364047e-02*gpr111+4.366576e-02*ca5b+9.202173e-02*inhibin a-4.995190e-01*pdgf-aa-1.438236e-01*cd51+5.787222e+00*bcl-w+2.836709e+00*sost-7.533289e-01*mpif-1+1.635532e-03*gcp-2+3.031094e-02*tim-1+2.675134e+00*trailr4。3.根据权利要求2所述恶性胸腔积液患者预后评估的装置，其特征在于，所述检测单元通过酶联免疫吸附定量检测。4.根据权利要求2所述恶性胸腔积液患者预后评估的装置，其特征在于，所述检测单元通过多通道luminex液相芯片定量检测。5.权利要求1所述的恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型或权利要求2所述的恶性胸腔积液患者预后评估的装置在制备恶性胸腔积液预后诊断试剂或诊断设备中的应用。

技术总结
本发明属于恶性胸腔积液相关病症诊疗领域，恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型及应用。细胞因子模型，细胞因子评分CRPI＝n1*x1+n2*x2...n32*x32；其中，n1～n32分别依次为表1中所示系数，x1～x32分别依次为表1中细胞因子相对表达量。预后评估的装置，包括检测单元和分析单元；所述检测单元检测样本中细胞因子的相对表达量；所述分析单元将细胞因子的相对表达量作为输入变量，输入预测模型，分析恶性胸腔积液患者预后状态；预测模型的方程式为前述公式。恶性胸腔积液患者预后评估的细胞因子模型或预后评估装置在制备恶性胸腔积液预后诊断试剂中的应用。本发明以细胞因子相对表达量作为输入变量构建预测模型，可以准确预测恶性胸腔积液患者预后的良恶性。恶性胸腔积液患者预后的良恶性。恶性胸腔积液患者预后的良恶性。


技术研发人员：周琼 王子豪 韦晓山 叶琳琳 牛怡然 彭文贝 张佩
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2022/5/25