一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法与流程

1.本发明属于蛋白酶的生产领域，具体涉及一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法。


背景技术：

2.角蛋白是一种普遍存在于自然界中有很强抗性的硬性蛋白，它是构成动物毛发、蹄角和羽毛等的主要蛋白质，能抵抗多种常用蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的降解。
3.角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，相比于其他蛋白酶可以更温和、更高效地处理含有角蛋白的原料，同时可改善处理后的角蛋白的营养价值。目前角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面有重要的应用价值，随着食品、饲料等行业的不断发展，角蛋白酶的需求量也不断上升。目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，主要为细菌和真菌。发现的角蛋白酶多来源于细菌，其中芽孢杆菌占主导地位，其所产的角蛋白酶大多为中性或碱性角蛋白酶，其最适ph多数大于7.5，甚至高达10。由于角蛋白酶酶活力低下，耐酸性差，影响了角蛋白酶在动物体内的高效发挥，严重阻碍了角蛋白酶的工业化应用。
4.中国专利cn110747188a公开了“一种生产角蛋白酶的方法”，该专利中将地衣芽孢杆菌进行ntg诱变后，使其所产角蛋白酶具有耐热、酶活力高、ph作用范围广泛等特点，但发酵时间长达96h以上，耗时长，操作繁琐，不利于工业化生产。
5.芽孢杆菌产角蛋白酶能力的研究大部分集中于菌株的诱变育种方面，诱变育种能够在较短的时间内获得更多的优良变异类型，但是诱变育种盲目性大，诱发的方向难以掌握，有利变异少，突变体难以集中多个理想性状，工作量大，而且其中的一些化学诱变剂存在一定的生物安全性，在工业化生产中受到一定限制。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，采用液态发酵的方法提高芽孢杆菌的产角蛋白酶能力，提高角蛋白酶酶活，获得的角蛋白酶酶活为9100-15020u/g，蛋白酶酶活增加了189-288％，并使获得的角蛋白酶稳定性及抗逆性有所提高，适用的ph范围广，ph在2.5-5.5时，酶活保存率高达83-94.7％，温度70-90℃时，酶活保存率高达90-97.5％。该方法简单易操作，安全可靠，发酵时间短，可用于大规模生产。
7.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
8.一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
9.1)斜面培养
10.将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基上，30～40℃下恒温培养24-48h；
11.2)摇瓶培养
12.取步骤1)中培养后的芽孢杆菌菌株，接种到种子培养基中，置于温度30～40℃，
160-200r/min条件下培养24-48h，获得种子液；
13.3)种子罐培养
14.将步骤2)中获得的种子液，按照接种量2-5％的比例接入种子罐培养基中，于30～40℃、转速160-200rpm条件下培养48-96h，获得种子液；
15.4)发酵培养
16.经过步骤3)扩大培养的种子液，按照接种量2-5％的比例接种至发酵培养基，进行好氧发酵，获得角蛋白酶；所述发酵培养基组分按质量百分数包括：玉米粉2-6％、豆粕粉1-5％、羽毛粉2-4％、kh2po
4 0.3-1％、氯化钙0.05-0.2％、甜菜碱0.05-1％，水分80-95％，ph 5-8；
17.其中，好氧发酵条件为：温度30-40℃，通风量为0.05-0.45vvm，转速160-250r/min，发酵时间48-72h。
18.本发明获得的角蛋白酶酶活为9100-12710u/ml。
19.本发明获得的角蛋白酶在ph＝2.5-5.5时，酶活保存率为83-94.7％.
20.本发明获得的角蛋白酶在温度为70-90℃时，酶活保存率为90-97.5％。
21.优选的，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌。
22.优选的，步骤1)中的固体培养基的组分按重量份包括：蛋白胨50-100份、羽毛粉20-50份、琼脂40-100份、磷酸氢二钾1.5-3.8份、硫酸镁1.4-4.5份、氯化钙1.5-3.8份、硫酸铁0.2-1.6份，水1000-1500份，ph 5-8。
23.优选的，步骤2)中种子培养基的组分按重量份包括：蛋白胨20-50份，牛肉膏18-30份，玉米粉20-35份，水1000-1500份，ph 5-8。
24.优选的，步骤3)中所述种子罐培养基的组分按重量份包括：豆粕粉40-100份、玉米粉50-100份、羽毛粉20-50份、kh2po40.5-1.0份、硫酸铁0.5-1.0份、水1000-1500份、ph 5-8。
25.本发明在发酵培养基中添加了甜菜碱作为芽孢杆菌产角蛋白酶的生长因子，甜菜碱广泛分布于动物、植物、微生物中，化学名称为三甲铵乙内脂或三甲基甘氨酸，与甲硫氨酸、胆碱化学结构相似，具有良好的理化性质和较好的稳定性及抗氧化能力，耐高温耐酸碱，同时参与生物体的新陈代谢活动，甜菜碱通过控制并调节芽孢杆菌产角蛋白酶的代谢过程，提高芽孢杆菌的产角蛋白酶能力，增加角蛋白酶的活性及抗逆性，在培养基中加入甜菜碱0.05-1％后，获得角蛋白酶酶活可以较原来提高189-288％，ph在2.5-5.5时，酶活保存率高达83-94.7％，温度70-90℃时，酶活保存率仍高达90-97.5％。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果：
27.1)本发明在芽孢杆菌发酵培养基中添加了甜菜碱作为生长因子源，帮助芽孢杆菌抵抗外界环境的胁迫，提高其生命活力，使其快速生长繁殖，提高其产角蛋白酶的能力。获得的角蛋白酶酶活由原来的3150-3900u/ml增加到9100-12710u/ml，酶活增加189-288％。
28.2)本发明获得的角蛋白酶稳定性及抗逆性有所提高，ph在2.5-5.5时，酶活保存率高达83-94.7％；温度70-90℃时，酶活保存率高达90-97.5％。
29.3)本发明通过增加生长因子的方式提高芽孢杆菌的产角蛋白酶能力，与现有的通过诱变育种方式相比，本发明所述方法简单易操作，安全可靠，发酵时间短，可用于大规模生产。
具体实施方式
30.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
31.实施例1一种提高黑曲霉产蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
32.1)斜面培养
33.将地衣芽孢杆菌株接种于固体斜面培养基上，37℃下恒温培养24h；
34.其中，固体斜面培养基的组成(按重量份)及配制包括：蛋白胨50份、羽毛粉20份、琼脂40份、磷酸氢二钾1.5份、硫酸镁1.4份、氯化钙2份、硫酸铁0.5份，水1000-1500份，ph 4.5，121℃灭菌30min。
35.2)摇瓶培养
36.将步骤1)中获得的地衣芽孢杆菌菌株，接种到种子培养基中，置于温度37℃，200r/min条件下摇瓶培养36h。
37.种子培养基的组成(按重量份)及配制包括：蛋白胨50份，牛肉膏30份，玉米粉35份，水1200份，ph 4.5，121℃灭菌30min。
38.3)种子罐培养
39.取步骤2)中获得的种子液，种子液按照接种量的2％接种到种子罐培养基中，于37℃、转速200r/min条件下培养48h，获得种子液。
40.其中，种子罐培养基的组成(按重量份)及配制包括：豆粕粉80份、玉米粉50份、羽毛粉30份、kh2po
4 0.8份、硫酸铁0.5份、水1500份、ph4.5，121℃灭菌30min；
41.4)发酵培养
42.取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量2％的比例接入发酵培养基中，于37℃、通风量0.20vvm，转速为200r/min的条件下，好氧发酵，发酵时间60h。
43.其中，发酵罐培养基的组成及配制包括：玉米粉6％、豆粕粉3％、羽毛粉4％、kh2po
4 0.8％、氯化钙0.1％、甜菜碱0.1％，水分86％，ph4.5；
44.以不加甜菜碱的发酵培养基作为空白对照组，发酵培养基中加入0.1％甜菜碱后，对4个生产批次所获得的角蛋白酶酶活进行测定，并在ph为2.5及温度为70℃时分别测定酶活保存率，结果参见表1：
45.表1
[0046][0047][0048]
由表1可知，地衣芽孢杆菌发酵液中加入0.1％的甜菜碱后，连续4批角蛋白酶酶活
相比对照组提高180％以上。在ph＝2.5的酸性环境中，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率均保持在80％以上，而对照组角蛋白酶的酶活保存率只有20％左右。在温度为70℃时，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率高达90％以上，而对照组只有80％左右。
[0049]
角蛋白酶酶活的测定：
[0050]
将本实施例发酵获得的酶液用ph8.0的tris-hcl缓冲液稀释至合适的倍数，取1ml稀释好的酶液，于37℃中孵育5min，加入羽毛粉，充分混匀，在40℃条件下精确反应60min，加入三氯乙酸终止液，混匀，将反应液4000rpm离心10min，于280nm条件下测定吸光度。对照组实验条件相同，先加入等量的终止液，再加入酶液。
[0051]
角蛋白酶活性(u/ml)＝4n
×
a280/(0.01
×
t)，其中n为稀释倍数，4为终止反应体积(ml)，t为反应时间(min)。
[0052]
角蛋白酶耐酸性测定：
[0053]
取本实施例制备的部分酶液用0.1m的hcl将其酶液的ph调整为2.5，于37℃水浴条件下静置2.5h后，测定角蛋白酶酶活，计算酶活保存率。
[0054]
角蛋白酶酶活耐温性测定：
[0055]
取本实施例制备的部分酶液，将该酶液置于70℃条件下保温处理2.5h，测定角蛋白酶酶活，计算酶活保存率。
[0056]
实施例2一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
[0057]
1)斜面培养
[0058]
将地衣芽孢杆菌株接种于固体培养基上，37℃下恒温培养36h；
[0059]
其中，固体培养基的组成及配制包括：按重量份，蛋白胨60份、羽毛粉30份、琼脂50份、磷酸氢二钾1.5份、硫酸镁2份、氯化钙2.5份、硫酸铁0.5份，水1000-1500份，ph 5.5，121℃灭菌30min。
[0060]
2)摇瓶培养
[0061]
将步骤1)中获得的地衣芽孢杆菌菌株接种到种子培养基中，置于温度37℃、200r/min条件下发酵36h。
[0062]
其中，种子培养基的组成及配制包括：按重量份，蛋白胨30份，牛肉膏20份，玉米粉30份，水1200份，ph 5.5，121℃灭菌30min；
[0063]
3)种子罐培养
[0064]
取步骤2)中获得的种子液按照接种量的2％接种至种子罐培养基中，于37℃、转速200r/min条件下培养48h。
[0065]
其中，种子罐培养基的组成及配制包括：按重量份，豆粕粉50份、玉米粉60份、羽毛粉40份、kh2po
4 0.8份、硫酸铁0.5份、水1500份、ph 5.5，121℃灭菌30min；
[0066]
4)发酵培养
[0067]
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量的2％的比例接入发酵培养基，于37℃、通风量0.20vvm，转速为200r/min的条件下，好氧发酵，发酵时间60h。
[0068]
发酵罐培养基的组成及配制包括：按质量百分数，玉米粉4％、豆粕粉4％、羽毛粉3％、kh2po
4 0.8％、氯化钙0.1％、甜菜碱0.5％，水分87.3％，ph5.5；
[0069]
以不加甜菜碱作为空白对照组，在发酵培养基中加入0.5％甜菜碱后，对4个生产批次所获得的蛋白酶酶活进行测定，并在ph为3.5及温度为80℃时分别测定酶活保存率(角
蛋白酶酶活测定方法及耐酸性耐温性测定方法同实施例1)。结果参见表2：
[0070]
表2
[0071][0072]
由表2可知，地衣芽孢杆菌发酵液中加入0.5％的甜菜碱后，连续4批角蛋白酶酶活相比对照组提高210％以上。在ph＝3.5的酸性环境中，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率均保持在85％以上，而对照组中角蛋白酶的酶活保存率不超过30％。在温度为80℃时，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率高达90％以上，而对照组中角蛋白酶的酶活保存率只有80％左右。
[0073]
实施例3一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
[0074]
1)斜面培养
[0075]
将地衣芽孢杆菌接种于固体培养基上，37℃下恒温培养36h；
[0076]
其中，斜面培养基的组成及配制包括：按重量份，蛋白胨70份、羽毛粉30份、琼脂50份、磷酸氢二钾1.5份、硫酸镁2份、氯化钙2.5份、硫酸铁0.5份，水1000-1500份，ph7.5，121℃灭菌30min。
[0077]
2)摇瓶培养
[0078]
将步骤1)中获得的地衣芽孢杆菌菌株接种到种子培养基中，置于温度37℃、200r/min条件下发酵36h。
[0079]
其中，种子培养基的组成及配制包括：按重量份，蛋白胨40份，牛肉膏25份，玉米粉25份，水1200份，ph 7.5，121℃灭菌30min。
[0080]
3)种子罐培养
[0081]
取步骤2)中摇瓶培养后的种子液按照接种量的2％接入种子罐培养基中，于37℃、转速200r/min条件下培养48h。
[0082]
其中，种子罐培养基的组成及配制包括：按重量份，豆粕粉80份、玉米粉70份、羽毛粉45份、kh2po
4 0.8份、硫酸铁0.5份、水1500份、ph7.5，121℃灭菌30min。
[0083]
4)发酵培养
[0084]
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量的2％的比例接入发酵培养基，于37℃、通风量0.20vvm，转速为200r/min的条件下，好氧发酵，发酵时间60h。
[0085]
发酵罐培养基的组成及配制包括：按质量百分数，玉米粉5.8％、豆粕粉3％、羽毛粉4％、kh2po
4 0.8％、氯化钙0.1％、甜菜碱0.8％，水分85.5％，ph7.5。
[0086]
以不加甜菜碱的培养基作为空白对照组，发酵培养基中加入0.8％甜菜碱后，对4个生产批次所获得的角蛋白酶酶活进行测定，并在ph为5.5及温度为90℃时分别测定酶活保存率(角蛋白酶酶活测定方法及耐酸性耐温性测定方法同实施例1)。结果参见表3：
[0087]
表3
[0088][0089]
由表3可知，地衣芽孢杆菌发酵液中加入0.8％的甜菜碱后，连续4批角蛋白酶酶活相比对照组提高240％以上。在ph＝5.5的酸性环境中，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率均保持在90％以上，而对照组中角蛋白酶的酶活保存率最高只有70％。在温度为90℃时，本发明获得的角蛋白酶的酶活保存率高达90％以上，而对照组的角蛋白酶的酶活保存率只有60％多。
[0090]
实施例4
[0091]
一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：
[0092]
1)斜面培养
[0093]
将地衣芽孢杆菌接种于固体培养基上，37℃下恒温培养36h；
[0094]
其中，固体培养基的组成按重量份包括：蛋白胨80份、羽毛粉30份、琼脂40份、磷酸氢二钾1.5份、硫酸镁2份、氯化钙2.5份、硫酸铁0.5份，水1000-1500份，ph7.5，121℃灭菌30min。
[0095]
2)摇瓶培养
[0096]
将步骤1)中获得的地衣芽孢杆菌菌株接种到种子培养基中，置于温度37℃、200r/min条件下发酵36h。
[0097]
其中，种子培养基的组成按重量份包括：蛋白胨45份，牛肉膏25份，玉米粉30份，水1200份，ph 7.5，121℃灭菌30min。
[0098]
3)种子罐培养
[0099]
取步骤2)中摇瓶培养后的种子液按照接种量的2％接入种子罐培养基中，于37℃、转速200r/min条件下培养48h。
[0100]
其中，种子罐培养基的组成按重量份包括：豆粕粉80份、玉米粉70份、羽毛粉45份、kh2po
4 0.8份、硫酸铁0.5份、水1500份、ph7.5，121℃灭菌30min。
[0101]
4)发酵培养
[0102]
取步骤3)中种子罐培养后的种子液按接种量的2％的比例接入发酵培养基，于37
℃、通风量0.20vvm，转速为200r/min的条件下，好氧发酵，发酵时间72h。
[0103]
发酵罐培养基的组成按质量百分数及配制包括：玉米粉6％、豆粕粉3％、羽毛粉4％、kh2po
4 0.8％、氯化钙0.2％、甜菜碱1.0％，水分85％，ph7.5。
[0104]
对所获得的角蛋白酶酶活进行测定，并用不同ph及温度处理后分别测定酶活及保存率(角蛋白酶酶活测定方法及耐酸性耐温性测定方法同实施例1)，以市售的08620#角蛋白酶产品作为对照组，用本发明提供的方法测定其酶活及抗逆性。结果见表4。
[0105]
表4
[0106][0107]
由表4可知，本发明获得的角蛋白酶经ph≤5.5的酸性环境处理后，酶活保存率依旧高达83-89％，而市售的角蛋白酶在同样条件下处理后酶活保存率仅为38-69％。在温度为70-90℃处理后，本发明获得的角蛋白酶酶活保存率高达90-91.7％，而对照组酶活保存率仅为63.9-86.4％。

技术特征：
1.一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，包括以下步骤：1)斜面培养将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基上，30～40℃下恒温培养24-48h；2)摇瓶培养取步骤1)中培养后的芽孢杆菌菌株，接种到种子培养基中，置于温度30～40℃，160-200r/min条件下培养24-48h，获得种子液；3)种子罐培养取步骤2)中获得的种子液，按照接种量2-5％的比例接入种子罐培养基中，于30～40℃、转速160-200rpm条件下培养48-96h；4)发酵培养经过步骤3)扩大培养的种子液，按照接种量2-5％的比例接种至发酵培养基，进行好氧发酵，获得角蛋白酶；所述发酵培养基组分按质量百分数包括：玉米粉2-6％、豆粕粉1-5％、羽毛粉2-4％、kh2po40.3-1％、氯化钙0.05-0.2％、甜菜碱0.05-1％，水分80-95％，ph 5-8；其中，好氧发酵条件为：温度30-40℃，通风量为0.05-0.45vvm，转速160-250r/min，发酵时间48-72h。2.根据权利要求1所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，获得的角蛋白酶酶活为9100-12710u/ml。3.根据权利要求1或2所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，获得的角蛋白酶在ph＝2.5-5.5时，酶活保存率为83-94.7％。4.根据权利要求1或2或3所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，获得的角蛋白酶在温度为70-90℃时，酶活保存率为90-97.5％。5.根据权利要求1所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌。6.根据权利要求1所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤1)中的固体培养基的组分按重量份包括：蛋白胨50-100份、羽毛粉20-50份、琼脂40-100份、磷酸氢二钾1.5-3.8份、硫酸镁1.4-4.5份、氯化钙1.5-3.8份、硫酸铁0.2-1.6份，水1000-1500份，ph5-8。7.根据权利要求1所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤2)中种子培养基的组分按重量份包括：蛋白胨20-50份，牛肉膏18-30份，玉米粉20-35份，水1000-1500份，ph 5-8。8.根据权利要求1所述的提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，其特征在于，步骤3)中所述种子罐培养基的组分按重量份包括：豆粕粉40-100份、玉米粉50-100份、羽毛粉20-50份、kh2po
4 0.5-1.0份、硫酸铁0.5-1.0份、水1000-1500份、ph 5-8。

技术总结
一种提高芽孢杆菌产角蛋白酶能力的方法，采用液态发酵的方法，利用甜菜碱提高芽孢杆菌的产角蛋白酶能力，提高角蛋白酶的酶活，获得的角蛋白酶酶活为9100-15020U/g，蛋白酶酶活增加了189-288％，并使获得的角蛋白酶稳定性及抗逆性有所提高，适用的pH范围广，PH在2.5-5.5时，酶活保存率高达83-94.7％，温度70-90℃时，酶活保存率高达90-97.5％。该方法简单易操作，安全可靠，发酵时间短，可用于大规模生产。可用于大规模生产。


技术研发人员：米雁 赵洪涛
受保护的技术使用者：安徽爱不停蛋白质饲料有限公司
技术研发日：2022.03.08
技术公布日：2022/5/25