抗真菌脂肽及链霉菌在抗真菌脂肽制备中的应用

1.本发明涉及生物技术领域领域，尤其涉及抗真菌脂肽及链霉菌在抗真菌脂 肽制备中的应用。


背景技术：

2.脂肽类物质是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性剂，是由多个氨 基酸构成的多肽环和一条疏水脂肪酸侧链组成的两亲性分子。脂肽类物质包括 表面活性素、丰原素、伊枯草菌素、罗克霉素和脂肽a等。已经报道发现脂 肽类物质具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤和抗病毒等多种生物学活性。脂肽类物 质的合成是由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases)和聚酮合 酶(polyketide synthases)共同编码合成，这些基因一般是成簇存在的，所以 这一类物质大多是以同系物的形式同时存在，分离纯化这些结构类似物非常困 难，因此当前的研究大多是脂肽复合物的抑制活性，但这些物质结构上的轻微 变化，可能引起活性上的巨大差异，因此开发一种制备脂肽单体的方法尤为重 要。
3.发明人在实验室中分离出一株链霉菌(streptomyces sp.xy006)，经研 究，该链霉菌的主要次级代谢产物是脂肽a(lipopeptin a)和与脂肽a相差 一个亚甲基的脂肽b(lipopeptin b)(暂定名称)，前期试验发现，脂肽a和 b结构上虽仅相差一个亚甲基，但其活性差异显著。且经过试验论证，脂肽a 和脂肽b的混合初提物对多种重要的农业病原真菌均有明显的抑制作用，而 相应的研究报道目前暂未见有披露。在此基础上，申请人为进一步研究其拮抗 机制，通过一系列的分离纯化方法制备得到脂肽a和b的活性单体。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、制备过程高效、便利和 可控的抗真菌脂肽及链霉菌在抗真菌脂肽制备中的应用。
5.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
6.一种抗真菌脂肽，其化学式为c
53h82n10o19
，其结构式如下：
7.。
8.基于上述，本发明还提供链霉菌在抗真菌脂肽制备中的应用，其包括将链 霉菌及其培养基进行冷冻处理后，再对其进行解冻和加压过滤处理以获得菌 液，所得菌液经浓缩和醇提取后，获得粗提物，该粗提物经复溶、正丁醇等体 积萃取多次后，收集有机相进行浓缩，再将浓缩物调整至预设浓度后，通过固 相萃取柱，然后经多级梯度洗脱处理，再收集洗脱物，对其进行分离纯化后， 制得抗真菌脂肽，所述抗真菌脂肽包括脂肽a和脂肽b，其中，所述脂肽a 的化学式为c
54h84n10o19
，其结构式为：
[0009][0010]
所述脂肽b的化学式为c
53h82n10o19
，其结构式为：
[0011]
。
[0012]
作为一种可能的实施方式，进一步，所述链霉菌为链霉菌xy006，其被 命名为链霉菌streptomyces sp.，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏编号为cgmcc no.24090。
[0013]
作为一种较优的实施选择，优选的，所述应用具体包括如下步骤：
[0014]
(1)将链霉菌xy006在ms培养基上划板活化后，于30℃环境下培养 3天；然后挑取单菌落于myg培养基，并在28℃和200rpm的条件下培养2 天，然后按1.0％量转接到myg培养基进行培养，使其在28℃、200rpm条 件下摇床培养6天，然后6000g离心处理，舍弃部分上清液后，将菌液用于 ms固体培养基涂板；每皿100μl，涂布均匀，于30℃培养七天；
[0015]
(2)将培养好的链霉菌xy006转入-80℃低温冷冻24h，然后室温完全 解冻，通过多层纱布包裹再施压挤出菌液，余下培养基残渣于甲醇中浸泡4 h，再经多层纱布包裹施压过滤，最后合并两次的滤出液，将其置于旋转蒸发 仪浓缩到预设体积；继而12000g离心10min，取上清，加入终浓度为70％的 甲醇于4℃静置提取，再12000g离心10min保留上清，继而通过旋转蒸发 仪浓缩到预设体积，再置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，制得粗提物，将其保存于
ꢀ‑
20℃环境下；
[0016]
(3)将粗提物用纯水完全复溶后，用正丁醇进行等体积液液萃取，萃取三 次，合并三次的有机相，静置过夜，再收集有机相，对其进行浓缩处理至干， 再用纯水复溶后，对其进行冷冻干燥，制得产物a，且将其保存于-20℃；
[0017]
(4)将产物a调整至上样浓度为500mg/ml，以3～5ml的上样体积将 其通过固相萃取柱进行萃取处理，再经多级梯度洗脱处理，再收集洗脱物；
[0018]
(5)对洗脱物进行复溶，然后离心去除沉淀后，进行液相色谱分离纯化 处理，制得抗真菌脂肽。
[0019]
作为一种较优的实施选择，优选的，步骤(4)中，多级梯度洗脱处理的 洗脱液依序为100％h2o、20％meoh、40％meoh、60％meoh、80％ meoh、100％meoh，其中，meoh质量浓度为非100％的溶液中，其余部分 为水。
[0020]
作为一种较优的实施选择，优选的，步骤(5)中，对洗脱物进行复溶， 然后离心去除沉淀后，将溶液依序通过甲醇和水为流动相、乙腈和水为流动相 的液相色谱进行分离纯
化处理，制得抗真菌脂肽。
[0021]
作为一种较优的实施选择，优选的，步骤(5)中，甲醇和水为流动相的液 相色谱进行分离纯化处理的条件为：色谱柱为xbridge prep obd
tm c18，其规 格为5μm，19
×
150mm，进样浓度200mg/ml，进样体积200μl；流动相 的流速5ml/min，吸收波长200～300nm，在预设hplc洗脱梯度条件下，每分 钟收集一管，根据吸收峰的位置合并同一吸收峰的洗脱液，然后通过旋转蒸发 仪浓缩干，再保存于-20℃环境下。
[0022]
作为一种较优的实施选择，优选的，步骤(5)中，乙腈和水为流动相的 液相色谱进行分离纯化处理的条件为：色谱柱为xbridge prep obd
tm c18，其 规格为5μm，19
×
150mm，进样浓度200mg/ml，进样体积200μl；流动相 流速5ml/min，吸收波长为200～300nm，在预设hplc洗脱梯度条件下，根 据吸收峰的位置收集洗脱液，然后通过旋转蒸发仪浓缩干，称重，保存于
‑ꢀ
20℃环境下。
[0023]
基于上述，本发明还提供一种农业病原真菌抑制药物，其包括抗真菌脂 肽，所述抗真菌脂肽包括脂肽a和脂肽b，其中，所述脂肽a的化学式为 c
54h84n10o19
，其结构式为：
[0024][0025]
所述脂肽b的化学式为c
53h82n10o19
，其结构式为：
[0026]
。
[0027]
作为一种较优的实施选择，优选的，所述农业病原真菌包括稻瘟病、香蕉 枯萎病、黄瓜枯萎病、炭疽病病原真菌；
[0028]
作为一种较优的实施选择，优选的，所述抗真菌脂肽的制备方法包括：
[0029]
(1)将链霉菌xy006在ms培养基上划板活化后，于30℃环境下培养 3天；然后挑取单菌落于myg培养基，并在28℃和200rpm的条件下培养2 天，然后按1.0％量转接到myg培养基进行培养，使其在28℃、200rpm条 件下摇床培养6天，然后6000g离心处理，舍弃部分上清液后，将菌液用于 ms固体培养基涂板；每皿100μl，涂布均匀，于30℃培养七天；
[0030]
(2)将培养好的链霉菌xy006转入-80℃低温冷冻24h，然后室温完全 解冻，通过多层纱布包裹再施压挤出菌液，余下培养基残渣于甲醇中浸泡4 h，再经多层纱布包裹施压过滤，最后合并两次的滤出液，将其置于旋转蒸发 仪浓缩到预设体积；继而12000g离心10min，取上清，加入终浓度为70％的 甲醇于4℃静置提取，再12000g离心10min保留上清，继而通过旋转蒸发 仪浓缩到预设体积，再置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，制得抗真菌脂肽。
[0031]
本方案中，脂肽a的研究最早出现于20世纪80年代，也是目前为止唯 一的研究报道，目前已公开的文献中，还未见有脂肽b的相关研究，且几乎 没有关于脂肽a和b拮抗农业重要病原真菌的研究。
[0032]
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有有益效果为：本方 案巧妙性通过链霉菌的代谢物进行提取脂肽a和脂肽b，且结合本方案的制 备方法，可制得纯度高于95％的脂肽a和脂肽b的单体，这对于后续解析其 拮抗病原真菌的机制及植株生防效果的试验都有重要的帮助；同时，脂肽a 和脂肽b拮抗机制的差异，也能为后续脂肽a和脂肽b的生物合成研究指出 方向。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还
可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]
图1是正丁醇萃取粗提物后活性层的总离子流色谱图；
[0035]
图2是经poly-sery hlb固相萃取小柱分离后六个活性层的总离子流色谱 图；
[0036]
图3是脂肽a和b的总离子流色谱图；
[0037]
图4是脂肽a(m/z 1177.6021)与脂肽b(m/z 1163.5846)的二级质谱图；
[0038]
图5为脂肽a和b的初提物对主要农业病原真菌的抑制作用的对比表征 图。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是， 以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下 实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有 作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0040]
本方案公开了链霉菌在抗真菌脂肽制备中的应用，其包括如下步骤：
[0041]
1链霉菌xy006的扩大培养
[0042]
链霉菌xy006(下称xy006)分离自福建农林大学茶园一株铁观音茶树的 叶片，其经过菌种鉴定，被命名为链霉菌streptomyces sp.，已于2021年12 月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24090。
[0043]
扩大培养：将xy006于ms培养基上划板活化，30℃培养三天，挑取单菌 落于myg(3ml)培养基，28℃，200rpm摇床培养两天，按1％的接菌量转 接于myg(250ml)培养基，28℃，200rpm摇床培养六天，6000g离心弃部 分上清，菌液用于ms固体培养基涂板；每皿100μl，涂布均匀，于30℃培 养七天。
[0044]
2粗提物的制备
[0045]
上述培养好的xy006转入-80℃冰箱低温冷冻24h，室温完全解冻，四层 纱布挤出菌液，培养基残渣于甲醇(meoh)中浸泡4h，四层纱布过滤，合并两 次的滤出液，旋转蒸发仪浓缩到小体积(约10倍浓缩倍数)。12000g离心10 min，取上清，加入终浓度为70％的甲醇于4℃静置提取，12000g离心10min 保留上清，旋转蒸发仪浓缩到小体积，冷冻干燥仪冷冻干燥，称重，保存于-20℃ 冰箱。
[0046]
3抗菌活性物质的分离纯化
[0047]
3.1液液萃取
[0048]
粗提物用纯水完全复溶后，用正丁醇进行等体积液液萃取。萃取三次，合并 三次的有机相，静置过夜，收集有机相，浓缩至干，用纯水复溶后，冷冻干燥， 保存于-20℃冰箱。
[0049]
waters uplc-synapt g2-si hdms qtof-ms(uplc-qtof/ms)检测活性层纯 度，如图1所示。从图中可以看出，脂肽a在3.09min出峰，脂肽b在2.67 min出峰，两个物质出峰时间接近。在脂肽a和b出峰位置的前后有很多杂峰， 说明经过液液萃取的活性层纯度还较低，仍需进一步纯化。
[0050]
3.2 poly-sery hlb固相萃取小柱分离纯化
[0051]
3.2.1活化柱子：依次加2ml的甲醇，2ml的纯水。
[0052]
3.2.2上样：上样浓度为500mg/ml，上样体积3～5ml，待样品完全过柱， 开始洗脱。
[0053]
3.2.3洗脱：按下表梯度洗脱。
[0054]
表1 cnw poly-sery hlb固相萃取小柱洗脱梯度
[0055][0056]
3.2.4收集洗脱层：将上述六层洗脱层浓缩至小体积，冷冻干燥，称重。
[0057]
3.2.5 75％色谱纯甲醇溶解活性层，10000g离心去除沉淀，稀释到0.1mg/ml， 待uplc-qtof/ms检测，筛选活性层，结果如图2所示。
[0058]
从图中可以看出，100％水和100％甲醇两个洗脱层均未检测到脂肽a和b， 其余四个洗脱层均检测到脂肽a和b，且两个物质在每个洗脱层的比例略有差 别，在60％甲醇和80％甲醇洗脱层中以脂肽a为主，在20％甲醇和40％甲醇 洗脱层中，两者所占比例相对一致。通过峰面积积分，计算脂肽a和b的纯度， 这四个活性层中脂肽a和b的纯度相比液液萃取获得的活性层的纯度有较大的 提高。
[0059]
3.3制备液相色谱甲醇分离纯化
[0060]
对3.2分离纯化得到的活性层分别进行复溶，10000g离心去除沉淀，进行 液相色谱分离纯化，以甲醇和水为流动相。
[0061]
分离纯化条件：色谱柱xbridge prep obd
tm c18(5μm，19
×
150mm)， 进样浓度200mg/ml，进样体积200μl。流动相为甲醇和水，流速5ml/min， 吸收波长200～300nm，hplc洗脱梯度如下表所示，每分钟收集一管，根据吸收 峰的位置合并同一吸收峰的洗脱液，旋转蒸发仪浓缩干，称重，保存于-20℃ 冰箱。
[0062]
表2 hplc分离纯化洗脱梯度
[0063][0064]
75％色谱纯甲醇溶解各洗脱层，10000g离心去除沉淀，稀释到0.01mg/ml， 待uplc-qtof/ms检测筛选活性层。
[0065]
3.4制备液相色谱乙腈分离纯化
[0066]
对3.3中筛选得到的活性层分别进行复溶，10000g离心去除沉淀，分别进 行液相色谱分离纯化，以乙腈(acn)和水为流动相。
[0067]
分离纯化条件：色谱柱xbridge prep obd
tm c18(5μm，19
×
150mm)，进 样浓度200mg/ml，进样体积200μl。流动相为乙腈和水，流速5ml/min， 吸收波长200～300nm，hplc洗脱梯度如下表所示，根据吸收峰的位置收集洗脱 液，旋转蒸发仪浓缩干，称重，保存于-20℃冰箱。
[0068]
表3 hplc分离纯化洗脱梯度
[0069][0070]
各活性层用75％色谱纯甲醇复溶，10000g离心去除沉淀，稀释到0.01 mg/ml，待uplc-qtof/ms检测筛选活性层，结果如表4所示，共获得九个纯度 90％以上的活性层，其中两个为脂肽a和脂肽b的活性单体，其总离子流色谱图 如图3所示，70％甲醇为溶剂空白，ms blank为培养基空白，经峰面积积分计 算，脂肽a和b的纯度均在95％以上。
[0071]
表4经多次分离纯化最终得到的高纯度活性层
[0072][0073][0074]
3.5脂肽a和b结构鉴定
[0075]
对脂肽a的母离子[m h]

(m/z 1177.6021)进行ms/ms分析，离子碎片信息 如图4
所示。将其二级质谱信息上传至gnps(global natural products social) 数据库，离子碎片匹配到lipopeptin a。文献检索发现其与nishii等研究中 的lipopeptin a(c
54h84n10o19
)一致，m/z 1199([m na]

)，推测其可能的断裂 方式如下，碎片离子162.0910对应脂肽a中的甲基苯丙氨酸(mephe)，离子 1177.6021与1049.5417相差128，对应脂肽a中的甲基天冬氨酸(measn)，离 子306.1458与162.0910相差144，对应脂肽a中的羟基谷氨酰胺(hygln)， 离子435.1892与306.1376相差129，对应脂肽a中的谷氨酸(glu)，离子 760.4507与435.1892相差325，对应脂肽a中的脂肪酸与苏氨酸(c15 fa thr)， 脂肽a的化学结构如式一所示,脂肽a的化学式chemical formula为c
54h84n10o19
。
[0076]
对脂肽b的母离子[m h]

(m/z 1163.5846)进行ms/ms分析，离子碎片信息 如图4所示。其母离子与脂肽a母离子相差14，两者结构上可能相差一个-ch
2-， 主要碎片离子有162.0916、306.1454、435.1884、746.4335、861.4587、948.4932 和1035.5247，并且碎片离子746.4335、861.4587、948.4932和1035.5247与 脂肽a的碎片离子760.4507、875.4780、962.5101和1049.5417均相差14。 将其二级质谱信息上传gnps数据库，匹配到的物质为lipopeptin b，其结构 与脂肽a在脂肪酸链上相差一个亚甲基-ch
2-。脂肽b的化学结构式如式二所示, 脂肽b的化学式chemical formula为:c
53h82n10o19
；当前文献检索并未发现记载 脂肽b。
[0077][0078]
4脂肽a和b初提物对农业重要病原真菌的抑制作用
[0079]
将步骤2中制得的脂肽a和脂肽b的初提物(纯度对照图1)应用于拮抗主 要农业病原真菌，其试验结果如图5所示，阳性对照(pc)为制霉菌素，阴性 对照(nc)为培养基空白，处理(t)为脂肽a和b的初提物。该结果说明以脂 肽a和b为主要成份的初提物对包括稻瘟病、香蕉枯萎病、黄瓜枯萎病、炭疽 病等病原真菌有明显的拮抗作用。
[0080]
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡 是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间 接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。