一种高效生产墨兰组培苗的方法

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1.本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种高效生产墨兰组培苗的方法。


背景技术：

2.墨兰(cymbidium sinense)又称报岁兰，兰科(orchidaceae)兰属(cymbidium)植物，原产于我国、越南和缅甸，因其花期在春节，深受国人喜爱，具有较高的经济价值、观赏价值和药用价值。墨兰常见的有分株繁殖和组织培养繁殖方法。传统的繁殖方式主要是分株繁殖，但面临繁殖率较低、周期长、传染病虫害、易感病毒病导致种性退化等问题，无法实现大量生产和满足市场的需求。随着组培技术的发展，国内外学者开展了墨兰组培繁殖研究，但目前墨兰组培仍然存在根状茎增殖率低、分化成芽困难等问题阻碍墨兰组培苗的生产应用推广。
3.墨兰组培技术经过近30年的研究，基本技术体系早已建立，但目前墨兰组培苗商业化生产极少看到报道。在墨兰组织培养研究中，仍存在繁殖系数偏低、芽分化系数低和繁殖周期长等问题，并且制约了种苗规模化生产(谢娟等，2020)。在专利文献方面，林辉锋等(2019)申报的“一种墨兰组织培养方法”的发明包括侧芽的获得、消毒、诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗移栽这些步骤。方中明等(2018)申请了“一种墨兰组织培养快速繁殖方法”发明专利，使用墨兰根状茎为直径约为2mm，长度1cm左右，在增殖培养基中添加的一定浓度的精氨酸可以促进根状茎细胞的分裂，从而达到快速增殖；同时在分化培养基中添加tdz、柠檬酸钠和山梨酸钾复合使用能促进根状茎快速分化成芽，并防止根状茎和培养基褐化。曾瑞珍等(2019)申请了“一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法”发明专利，将企剑白墨墨兰根状茎接种于芽分化培养基中进行培养，所述芽分化培养基中含有细胞分裂素6-ba和催化生长素生物合成的类黄素单加氧酶专一性抑制剂yucasin，促进了激素相关基因的表达并引起内源激素微环境的改变，从而促进企剑白墨墨兰根状茎芽分化，可直接用于企剑白墨墨兰种苗的工厂化生产，推动墨兰产业发展。朱建军等(2016)申请了“一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方”，以墨兰与虎头兰的杂交兰无菌苗基部组织为材料，在含有多种植物生长调节剂和附加物的诱导培养基中进行诱导培养获得原球茎，将获得的原球茎进行增殖与分化培养，再进行壮苗、生根，移栽。伍建榕等(2011)申报的“一种墨兰种苗繁殖方法”，其种苗获得主要包括种子萌发、原球茎继代增殖和生根培养过程，其特征在于该繁殖方法在种苗获得后还进行生根苗的炼苗及与菌根真菌的菌根化过程，克服纯组培苗生长缓慢，周期长，甚至不开花的缺点。


技术实现要素：

4.为解决目前墨兰组培苗生产效率不高的问题，本发明提出一种双培养基双培养方式的创新方式，可以保障墨兰组培苗再生过程各个阶段繁殖材料对不同激素和营养以及培养条件的要求，且利用固液两层培养方式不但避免单一培养方式的不足，同时又将两种培养方式的优点充分利用，在满足繁殖材料对氧气的需求基础上以固体、液体两种培养基丰
富的营养成分和生长调节剂的有效快速的吸收利用来达到各个阶段的培养目标，生产效率高于文献的报道，利于墨兰组培苗的推广种植，具有低成本高效益的特点，是促进墨兰组培苗的生产应用提供一条有效的途径。
5.本发明的目的是提供一种高效墨兰组培苗生产的方法，包括以下步骤：
6.(1)根状茎的诱导：取墨兰蒴果进行消毒接种，切开蒴果，将种子散播到m1培养基上进行根状茎诱导培养，形成大量根状茎；所述的m1培养基的成分为：花宝1号1.5-2.0g/l、花宝2号1.5-2.0g/l、香蕉50-80g/l、苹果10-20g/l、0.5-1.0mg/l 6-ba、0.5-1.0mg/lnaa、15-20g/l蔗糖、活性炭0.5-2.0g/l、5.0g/l琼脂，ph为5.2-5.4；
7.(2)根状茎增殖：将诱导得到的墨兰根状茎无菌条件下分切切段接种到培养瓶中的m2培养基中，接着往培养瓶中注入m3培养基，盖上带有透气膜的瓶盖后进行根状茎增殖培养；所述m2培养基的成分为：花宝1号1.0-1.5g/l、花宝2号1.0-1.5g/l、香蕉50-80g/l、苹果10-20g/l、0.25-0.5mg/l 6-ba、1.0-2.0mg/lnaa、15-20g/l蔗糖、活性炭1.0-2.0g/l、5.0g/l琼脂，ph 5.2-5.4；所述m3培养基的成分为：1/2-1ms、0.25-0.5mg/l6-ba、1.0-2.0mg/lnaa、15-20g/l蔗糖，ph 5.2-5.4；
8.(3)根状茎分化出苗：将增殖培养获得的根状茎无菌条件下分切切段接种至培养瓶中的m4培养基中，接着往培养瓶中注入m5培养基，盖上带有透气膜的瓶盖后进行根状茎分化培养；所述的m4培养基的成分为：花宝1号1.0-1.5g/l、花宝2号1.0-1.5g/l、香蕉50-80g/l、苹果10-20g/l、0.5-1.0mg/l tdz、0.2-0.5mg/lnaa、15-20g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph 5.4-5.6；所述的m5培养基的成分为：1/2-1ms、0.5-1.0mg/l tdz、0.2-0.5mg/lnaa、15-20g/l蔗糖，ph 5.4-5.6；
9.(4)壮苗生根：将根状茎分化出来的高于2.0厘米的芽无菌条件下插植至培养瓶中的m6培养基中，接着往培养瓶中注入m7培养基，盖上带有透气膜的瓶盖后进行生根壮苗培养；所述m6培养基的成分为：花宝1号1.0-1.5g/l、花宝2号1.0-1.5g/l、香蕉50-80g/l、苹果10-20g/l、0.2-0.5mg/lnaa、20-30g/l蔗糖、活性炭1.0-2.0g/l、5.0g/l琼脂，ph 5.4-5.6；所述m7培养基的成分为：1/2-1ms、椰子水50-100ml/l、0.2-0.5mg/lnaa、20-30g/l蔗糖，ph 5.4-5.6；
10.(5)组培苗炼苗及移栽：将生根壮苗培养得到的墨兰组培苗瓶苗移到散射光充足的地方，炼苗7-15天后移栽。
11.优选地，在步骤(1)中，所述根状茎诱导的培养条件为：温度为25
±
2℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
12.优选地，在步骤(2)中，所述的切段为0.5-1.0厘米长，所述m2培养基与m3培养基的体积比为100：20～30。
13.优选地，在步骤(2)中，所述根状茎增殖的培养条件为：温度为25
±
2℃，光照度1500～2000lx，光照12h/d。
14.优选地，在步骤(3)中，所述的切段为0.5-1.0厘米长，所述m4培养基与m5培养基的体积比为100：20～30。
15.优选地，在步骤(3)中，所述根状茎分化的培养条件为：温度为26
±
2℃，光照度2000～3000lx，光照12h/d。
16.优选地，在步骤(4)中，所述m6培养基与m7培养基的体积比为100：20～30。
17.优选地，在步骤(4)中，所述生根壮苗的培养条件为：温度为26
±
2℃，光照度2000～3000lx，光照12h/d。
18.优选地，在步骤(5)中，所述的移栽，是先从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用0.1-0.2％(质量分数)高锰酸钾与0.3-0.6％(质量分数)氯化钠的混合液作为提根活力剂浸泡10-30min后，置于阴凉通风处晾干至组培苗根系颜色变白；再将组培苗插植到分层填充基质种植杯上，并将基质压实，基质上平面应低于盆沿1-2.0cm。
19.更优选地，所述的分层填充基质种植杯，中下层为塘泥花生壳混合基质，上层为树皮和兰石混合基质。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明同时将两种培养方式的优点充分利用，避免了单一培养方式的不足，在满足繁殖材料对氧气的需求基础上以固体、液体两种培养基丰富的营养成分和生长调节剂的有效快速的吸收利用来达到各个阶段的培养目标，可使墨兰根状茎增殖倍数达9-10倍，平均每根状茎切段可分化出4.6个芽，小芽经过生根壮苗生根率在95％以上，平均根数3-4条，根长2-3cm，根系粗壮，达到95％以上的移栽成活率，生产优势明显，生产效率高于文献的报道，可实现墨兰组培苗商品化高效生产；本发明利于墨兰组培苗的推广种植，具有低成本高效益的特点。
具体实施方式：
21.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体试验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
22.本发明中所采用的培养基配方：
23.1.m1培养基：花宝1号1.5-2.0g/l 花宝2号1.5-2.0g/l 香蕉50-80g/l 苹果10-20g/l 0.5-1.0mg/l 6-ba 0.5-1.0mg/lnaa 15-20g/l蔗糖 活性炭0.5-2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.2-5.4，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
24.2.m2培养基：花宝1号1.0-1.5g/l 花宝2号1.0-1.5g/l 香蕉50-80g/l 苹果10-20g/l 0.25-0.5mg/l 6-ba 1.0-2.0mg/lnaa 15-20g/l蔗糖 活性炭1.0-2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.2-5.4，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
25.3.m3培养基：1/2-1ms(仅大量元素改变为原来的1/2-1倍) 0.25-0.5mg/l6-ba 1.0-2.0mg/lnaa 15-20g/l蔗糖，ph 5.2-5.4，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
26.4.m4培养基：花宝1号1.0-1.5g/l 花宝2号1.0-1.5g/l 香蕉50-80g/l 苹果10-20g/l 0.5-1.0mg/l tdz 0.2-0.5mg/lnaa 15-20g/l蔗糖 5.0g/l琼脂，ph 5.4-5.6，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
27.5.m5培养基：1/2-1ms(仅大量元素改变为原来的1/2-1倍) 0.5-1.0mg/l tdz 0.2-0.5mg/lnaa 15-20g/l蔗糖，ph 5.4-5.6，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
28.6.m6培养基：花宝1号1.0-1.5g/l 花宝2号1.0-1.5g/l 香蕉50-80g/l 苹果10-20g/l 0.2-0.5mg/lnaa 20-30g/l蔗糖 活性炭1.0-2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.4-5.6，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph，灭菌备用。
5.4。壮苗生根培养周期一般为60d～90d。生根率在95％以上，平均根数3-4条，根长2-3cm，根系粗壮。
38.7.组培苗炼苗及移栽：将生根壮苗培养60-90天的墨兰组培苗瓶苗移到散射光充足的地方，让种苗充分接受光线，必要时也可打开瓶盖，让小苗与外界环境条件充分接触，更有利于种苗进行光合作用，以达到富含叶绿素和纤维化以及气孔能自主调节开闭，使种苗更加健壮，炼苗7-15天。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用提根活力剂(含质量分数0.1％高锰酸钾和0.3％氯化钠的水溶液)浸泡10min后置于阴凉通风处晾干至组培苗根系颜色变白，以期经过盐和干旱胁迫来锻炼提高墨兰组培苗根系活力更有利于移栽定植成活和快速生长。移栽时将以上组培苗插植到分层填充基质种植杯上，并将基质压实，基质上平面应低于盆沿1-2.0cm。移栽当天浇透水直至从花盆底部流出清水为止，并喷施广谱性杀菌剂，注意保持适宜湿度和温度以及通风光照条件，并用水溶性肥(n-p-k＝20-20-20)3000倍液每隔7-15天喷施1次。移栽30天组培苗成活率高于95％。
39.实施例2
40.本实施例与实施例1基本相同，只是有如下区别：实验材料为白墨组培苗，提根活力剂(含质量分数0.2％高锰酸钾和0.6％氯化钠的水溶液)浸泡时间是20min；本实施例中m1成分：花宝1号2.0g/l 花宝2号2.0g/l 香蕉80g/l 苹果20g/l 1.0mg/l 6-ba 1.0mg/lnaa 20g/l蔗糖 活性炭2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.4；m2成分：花宝1号1.5g/l 花宝2号1.5g/l 香蕉80g/l 苹果20g/l 0.5mg/l 6-ba 2.0mg/lnaa 20g/l蔗糖 活性炭2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.4；m3成分：ms 0.5mg/l6-ba 2.0mg/lnaa 20g/l蔗糖，ph 5.4；m4成分：花宝1号1.5g/l 花宝2号1.5g/l 香蕉80g/l 苹果20g/l 1.0mg/ltdz 0.5mg/l naa 20g/l蔗糖 5.0g/l琼脂，ph 5.6；m5成分：ms 1.0mg/l tdz 0.5mg/lnaa 20g/l蔗糖，ph 5.6；m6成分：花宝1号1.5g/l 花宝2号1.5g/l 香蕉80g/l 苹果20g/l 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 活性炭2.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.6；m7成分：ms 椰子水100ml/l 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖，ph 5.6。
41.实施例3
42.本实施例与实施例1基本相同，只是有如下区别：实验材料为徽州墨兰组培苗，提根活力剂(含质量分数0.15％高锰酸钾和0.4％氯化钠的水溶液)浸泡时间是30min；本实施例中m1成分：花宝1号1.5g/l 花宝2号1.5g/l 香蕉50g/l 苹果10g/l 0.5mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 15g/l蔗糖 活性炭0.5g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.2。本实施例中m2成分：花宝1号1.0g/l 花宝2号1.0g/l 香蕉50g/l 苹果10g/l 0.25mg/l 6-ba 1.0mg/lnaa 15g/l蔗糖 活性炭1.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.2；m3成分：1/2ms 0.25mg/l 6-ba 1.0mg/lnaa 15g/l蔗糖，ph 5.2。本实施例中m4成分：花宝1号1.0g/l 花宝2号1.0g/l 香蕉50g/l 苹果10g/l 0.5mg/ltdz 0.2mg/lnaa 15g/l蔗糖 5.0g/l琼脂，ph 5.4；m5成分：1/2ms 0.5mg/l tdz 0.2mg/lnaa 15g/l蔗糖，ph 5.4。本实施例中m6成分：花宝1号1.0g/l 花宝2号1.0g/l 香蕉50g/l 苹果10g/l 0.2mg/lnaa 20g/l蔗糖 活性炭1.0g/l 5.0g/l琼脂，ph 5.4；m7成分：1/2ms 椰子水50ml/l 0.2mg/lnaa 20g/l蔗糖，ph 5.4。
43.施福军等(2008)、左利娟等(2017)、丁雪珍等(2009)文献报道根状茎的增殖系数为3.96-8.1之间，本方法可使墨兰根状茎增殖系数达9-10；谢娟等(2020)报道每根状茎切断最高的分化不定芽数为1.73，本方法可使每根状茎切断分化不定芽数可达4.6。
44.在同一条件下，固体培养基培养的结果与文献报道的相近，根状茎增殖系数为7.1，每根状茎切断分化不定芽数约为2.6，说明本发明采用的双培养基双培养方式可以显著加快墨兰的生产速率。