一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用与流程

一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及mda-mb-231单细胞克隆的制备技术。


背景技术：

2.mda-mb-231细胞是分离自一名51岁的女性乳腺癌患者的胸水的人乳腺癌细胞。mda-mb-231是具有高度侵入性和分化程度低的三阴性乳腺癌 (tnbc)细胞系，三阴性指缺乏雌激素受体(er)和雌激素受体(pr)表达，以及her2(人类表皮生长因子受体2)过表达。与其他侵入性癌细胞系类似， mda-mb-231细胞的侵入性通过细胞外基质的蛋白质降解进行调解。
3.mda-mb-231被广泛用于三阴性乳腺癌的相关研究。通过zfn、talen、 crispr/cas9技术进行基因编辑，从而建立基因敲除、敲入、点突变等细胞株是常用的研究手段。然而，mda-mb-231细胞在进行基因编辑的必经环节—单细胞克隆培养实验时，单细胞克隆形成率以及单细胞克隆培养状态都是不太理想，需要铺大量的板，才能筛到足够的克隆数进行鉴定。依照atcc等权威细胞库的培养条件，mda-mb-231细胞在含10％胎牛血清(fbs)的leibovitz’s l-15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，这一环境区别于绝大多数细胞的环境条件(37℃、5％co2),需要配备专用培养箱单独进行培养，在成本及管理操作上都没有优势，更重要的是，这个培养条件虽然可以对mda-mb-231细胞系进行常规培养，如复苏、传代、冻存等，但是对于mda-mb-231极限稀释或分选后获得的单细胞克隆培养，单细胞克隆形成效率较低，制约基因编辑细胞株的制备效率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用，以解决现有技术中mda-mb-231细胞培养成本高，以及因单细胞克隆形成效率低而制约基因编辑细胞株的制备问题。
5.为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
6.一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；
7.所述基础培养基是由leibovitz’s l-15培养基和dmem培养基混合所得，或是由leibovitz’s l-15培养基和rpmi-1640培养基混合所得。
8.进一步地，所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。
9.进一步地，所述基础培养基是由leibovitz’s l-15培养基和dmem培养基按体积比1：1混合所得，或是由leibovitz’s l-15培养基和rpmi-1640培养基按体积比1：1混合所得。
10.进一步地，所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。
11.进一步地，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均
为100μm。
12.进一步地，所述氢化可的松的浓度范围为0.5～1μg/ml，抗坏血酸的浓度范围为30～50μg/ml。
13.一种应用所述单克隆增强培养基的mda-mb-231单细胞克隆培养方法，步骤包括：将mda-mb-231细胞加入到培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的leibovitz’s l-15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％co2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
14.更优地，步骤包括：将mda-mb-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μl的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μl每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的leibovitz
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s l-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％co2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
15.本发明还提供一种所述培养方法得到的mda-mb-231单细胞克隆在研究三阴性乳腺癌或基因编辑中的应用。
16.本发明还提供一种所述培养方法得到的mda-mb-231单细胞克隆在筛选抗肿瘤药物中的应用。
17.本发明的优点包括：
18.1.本发明的培养基适用5％co2的常规培养环境，不需要配备专用培养箱，在成本和管理操作上具有优势，在管理及操作上大大提升效率；
19.2.本发明的mda-mb-231单细胞克隆形成效率高，单细胞克隆生长状态好，容易获得足够的单细胞克隆进行基因型鉴定，大大提高基因编辑细胞株的制备效率。
附图说明
20.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
21.图1a是实施例一对照组采用atcc培养方法培养7d的mda-mb-231细胞的单细胞克隆形态实验图；b是实施例二采用单克隆增强培养基b4培养7d的单细胞克隆形态实验图。
具体实施方式
22.下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
23.实施例一
24.非必需氨基酸购自mem non-essentialaminoacids solution(100x)(厂家：thermofisher货号：11140050)，其包括的氨基酸具体有：甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸。
25.选择4种常用培养基：dmem、f12k、rpmi-1640、mem，分别与leibovitz’sl-15培养基(简称l15)按体积比1：1混合后作为基础培养基；再按照基础培养基：胎牛血清＝90：10的
体积比，分别往各基础培养基中添加胎牛血清(fbs)，然后按非必需氨基酸：添加有胎牛血清的基础培养基＝1：99的体积比，分别往各添加有胎牛血清的基础培养基中添加非必需氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μm，得到4个不同的单克隆增强培养基a1-a4，如表1所示。
26.将上述得到的4个培养基分别按37℃、5％co2常规环境进行mda-mb-231 细胞的培养测试，与atcc培养方法不同的是在细胞培养过程的24h至48h间分别采用单克隆增强培养基a1-a4按37℃、5％co2常规环境培养mda-mb-231 细胞，对应组别序号为组a1-a4。组a1采用单克隆增强培养基a1的培养测试过程如下：
27.将mda-mb-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μl的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μl 每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清(fbs)的leibovitz’s l-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基 a1，在37℃和5％co2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基a1，直至形成可传代的单细胞克隆。
28.采用单克隆增强培养基a2-4的培养测试过程参照采用单克隆增强培养基 a1的培养测试过程。
29.同时设置对照组，对照组采用atcc培养方法来培养mda-mb-231细胞。各组单细胞克隆培养24h-48h阶段的具体培养条件、情况记录如表1所示：
30.表1
31.[0032][0033]
除特别说明外，表1中的比例指的是体积比，百分数指的是体积百分数。
[0034]
测试组a1和组a3培养体系与对照组的体系相比，mda-mb-231单细胞克隆形成及单细胞克隆生长状态存在差异。结果显示组a1单细胞克隆形成率18％，组a3单细胞克隆形成率16.5％，相比对照组单细胞克隆形成率13％，都有一定的提升，组a1的效果比组a3的稍高。如图1a所示是对照组采用atcc培养方法培养7d的mda-mb-231细胞的单细胞克隆形态实验图。
[0035]
实施例2
[0036]
本实施例期望通过在单克隆增强培养基a1的基础上添加特殊添加剂，进一步提高单细胞克隆形成率。特殊添加剂是氢化可的松和/或抗坏血酸(l-ascorbicacid)，得到3个不同的单克隆增强培养基b2-b4。
[0037]
分别采用单克隆增强培养基b2-b4进行培养测试的过程参照实施例1中采用单克隆增强培养基a1的培养测试过程，对应组别序号为组b2-b4，各组单细胞克隆培养24h-48h阶段的具体培养条件、情况如表2所示：
[0038]
表2
[0039][0040]
除特别说明外，表2中的比例指的是体积比，百分数指的是体积百分数。
[0041]
测试结果显示两者同时添加，效果更佳。单克隆增强培养基b4选为最佳 mda-mb-231单克隆增强培养基，其中氢化可的松的最佳浓度范围为 0.5～1μg/ml，抗坏血酸的最佳浓度范围为30～50μg/ml。如图1b所示是组b4培养7d 的单细胞克隆形态实验图，培养15d后形成可传代的单细胞克隆。可见采用单克隆增强培养基b4来培养的单细胞克隆形成率大大高于atcc培养方法的单细胞克隆形成率。
[0042]
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

技术特征：
1.一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；所述基础培养基是由leibovitz’s l-15培养基和dmem培养基混合所得，或是由leibovitz’s l-15培养基和rpmi-1640培养基混合所得。2.根据权利要求1所述的一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。3.根据权利要求1或2所述的一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述基础培养基是由leibovitz’s l-15培养基和dmem培养基按体积比1：1混合所得，或是由leibovitz’s l-15培养基和rpmi-1640培养基按体积比1：1混合所得。4.根据权利要求1或2所述的一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。5.根据权利要求1或2所述的一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μm。6.根据权利要求2所述的一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述氢化可的松的浓度范围为0.5～1μg/ml，抗坏血酸的浓度范围为30～50μg/ml。7.一种应用如权利要求1-6任一所述单克隆增强培养基的mda-mb-231单细胞克隆培养方法，其特征在于：步骤包括：将mda-mb-231细胞加入到培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的leibovitz’s l-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％co2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。8.一种如权利要求7所述mda-mb-231单细胞克隆培养方法，其特征在于：步骤包括：将mda-mb-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μl的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μl每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的leibovitz’s l-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％co2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。9.一种如权利要求7或8所述培养方法得到的mda-mb-231单细胞克隆在研究三阴性乳腺癌或基因编辑中的应用。10.一种如权利要求7或8所述培养方法得到的mda-mb-231单细胞克隆在筛选抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用，成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸，还可以包括氢化可的松和/或抗坏血酸；采用所述的单克隆增强培养基，MDA-MB-231细胞可以在37℃和5％CO2的常规环境下进行正常培养，更主要的是显著提高了MDA-MB-231细胞的单细胞克隆形成效率，由此得到的MDA-MB-231单细胞克隆可在三阴性乳腺癌的研究、基因编辑、筛选抗肿瘤药物中得到广泛应用。本发明优点包括：本发明培养基适用5％CO2的常规培养环境，在成本和管理操作上具有优势；本发明方法实现单细胞克隆形成率高、生长状态好从而提高基因编辑细胞株的制备效率。编辑细胞株的制备效率。编辑细胞株的制备效率。


技术研发人员：郑虹 李淼兰 何英幸
受保护的技术使用者：广州源井生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2022/5/25