一种使用裂殖壶菌发酵生产DHA的方法与流程

一种使用裂殖壶菌发酵生产dha的方法
技术领域
1.本发明涉及微生物发酵领域，更具体地，涉及一种使用裂殖壶菌发酵生产dha的方法。


背景技术：

2.裂殖壶菌(schizochytrium)又称裂壶藻，属于网粘菌门(labyrinthulomycota)、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。二十二碳六烯酸(trans-4,7,10,15,16,19-docosahexaenoic acid，简称dha)，是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸，是人体必须不饱和脂肪酸，具有健脑保健、促进视力发育、抗炎免疫、降血脂、辅助治疗心血管疾病和癌症等生理功能。人体自身难以合成dha，必须从体外摄入。深海鱼油是dha的传统来源，但鱼油的品质与产量难以满足商业化发展需求，开发dha新来源已成为必然的发展趋势，其中，利用裂殖壶菌发酵生产dha并通过对发酵过程的控制获得较高产量是目前的研究热点。
3.此前，对于裂殖壶的发酵技术都是基于裂殖壶菌源于海水，所以需要高盐的培养条件来制定发酵策略，例如在《裂殖壶菌高产dha的发酵技术研究》这篇论文中提到在其研究中得到效果较优的培养基条件为初始葡萄糖浓度92.07g/l，初始酵母粉浓度15g/l，nano3浓度为3.31g/l，kh2po4浓度1.5g/l，mgso4·
7h2o浓度0.3g/l，海水晶浓度20g/l，发酵初始ph5.84，摇瓶装液量50ml/250ml，种龄48h，其中海水晶既为氯化钠，为裂殖壶菌提供了一个较高的盐水环境。
4.目前，有些研究者已经有一些开始注意到了高盐环境的缺陷，尤其是以氯离子为主的对于设备的腐蚀问题，以及增加了废水处理的难度，开始将盐分进行降低，比如以下的报道：
5.(1)au2004229116提供了一种在低氯化物培养基中培养藻类微生物的方法，该方法包括：
6.在每升所述培养基的氯化物浓度小于3克氯化物的培养基中培养胆碱微生物，并且钠的非氯化物源范围为约2.4g/l至约30g/l，并且其中微生物产生至少约10％的总脂肪酸(％dwt)。
7.(2)cn200480035832.1中给出了一种培养裂壶菌(schizochytrium的微生物的方法，其中将微生物培养在na
+
和cl-离子的重量分数之和少于1.75g/l并且总盐含量少于3.5g/l的培养基中，其中的微生物每干生物质产生多于10％的dha，所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/l，酵母提取物的浓度为12.5g/l[difco]，ph值调整到6.0。
[0008]
以上现有技术中，虽然其方法中的盐浓度较低，但是从其发酵结果来看，生物量和dha的产量都非常低，远达不到产业化的需求。


技术实现要素：

[0009]
本发明的第一目的在于提供一种使用裂殖壶菌发酵生产dha的方法。该方法包括
如下步骤：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵；所述发酵体系中，包括碳源、氮源和无机盐；所述无机盐由磷酸盐和镁盐组成。
[0010]
该方法使用了特定的不额外补充钠/氯离子的发酵培养基进行发酵培养，菌体生长代谢未受到影响，得到的总油得到了明显的提高。
[0011]
在本发明一个优选实施方式中，所述氮源为0～2g/l的天然氮源和不低于30g/l的有机氮源；优选的是，所述氮源为0.01～1g/l的天然氮源和不低于30g/l的有机氮源。其中，本发明中有机氮源为本领域中常见的有机氮源，可以为谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸中的一种或多种，优选为谷氨酸。本发明中的天然氮源可以选用本领域中常用的天然氮源，包括但不限于酵母浸膏、玉米浆干粉、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白、黄豆饼粉中的一种或多种，进一步优选为酵母浸膏。
[0012]
酵母浸膏是常用的氮源，但是由于酵母浸膏属于天然酵母制品，成分复杂，不同来源的酵母浸膏对发酵的结果影响较大，由于酵母浸膏产品各批次的性质不稳定，会给dha的产量造成较大的差异，使得以酵母浸膏作为氮源的发酵培养基发酵生产dha的方法的产业化受到限制。在本发明中优选的天然氮源为酵母浸膏，本发明提供的发酵培养基可以将酵母浸膏的含量降低到非常低的程度，减少了其对发酵结果的影响。
[0013]
在本发明中，碳源可以为本领域中常用的碳源，包括但不限于，葡萄糖、甘油、糖蜜中的一种或多种。
[0014]
在本发明中，磷酸盐可以为本领域中常用的磷酸盐，包括但不限于，磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢钾中的一种或多种，优选为磷酸二氢钾。在本发明中，镁盐可以为硫酸镁。在本发明中，氮源还包括无机氮源，无机氮源为硫酸铵、氨水、硝酸钾中的一种或多种，优选为硫酸铵。
[0015]
在本发明一个优选实施方式中，在所述发酵体系中，通常将各物质的浓度控制在如下范围：碳源20～80g/l、磷酸盐0.8～5g/l、硫酸镁3～12g/l。若是加入无机氮源，无机氮源的浓度控制为1～6g/l。
[0016]
在本发明一个优选实施方式中，所述发酵体系中，还包括维生素液，维生素液在发酵体系中的浓度为0.3～3g/l。所述维生素液优选为包括硫胺素和泛酸钙的水溶液。其中，硫胺素和泛酸钙的质量比进一步优选为(0.6～20):1。维生素液中硫胺素的浓度为3～20g/l。其中，在维生素液中，还可以包括生物素，生物素与泛酸钙的质量比为(0.002～0.02):1。即维生素液优选为包括硫胺素、泛酸钙和生物素的水溶液，进一步优选为硫胺素、泛酸钙和生物素组成的水溶液。其中硫胺素、泛酸钙和生物素的质量比为(0.6～20):1:(0.002～0.02)。
[0017]
在本发明一个优选实施方式中，所述发酵体系中，还包括金属离子液。在发酵体系中，金属离子液的浓度可以为0.01～3g/l。所述金属离子液包括七水硫酸亚铁水溶液。其中，所述七水硫酸亚铁的浓度优选为3～20g/l。即在该发酵体系中，该金属离子液可以仅由浓度为3～20g/l的七水硫酸亚铁组成。
[0018]
在本发明的发酵体系中，优选的是，包括碳源、氮源、无机盐、维生素液和金属离子液。也可以由这五类物质组成，五类物质的具体组成参见上述内容。其中，氮源优选为有机氮源、天然氮源和无机氮源，进一步优选为谷氨酸、酵母浸膏和硫酸铵，无机盐优选为磷酸二氢钾和硫酸镁。碳源可以为甘油。
[0019]
在本发明一个优选实施方式中，发酵体系中，发酵参数为：发酵体系中ph为3～9，发酵温度为20～32℃，发酵初始通气量为0.5～3.0vvm，发酵转速0pm～500rpm，发酵时间为72～144h。
[0020]
在本发明中，可以直接将裂殖壶菌直接接入发酵培养基中发酵生产dha，优选的是可以将裂殖壶菌种子液接入发酵培养基中发酵，即还包括将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵前，先将裂殖壶菌在活化培养基中，培养后接入种子培养基中培养。上述整个培养步骤为：活化-种子培养-发酵。种子培养基可以使用种子罐实现。在整个培养中，可以根据实际发酵规模和需要设置来设置多个种子罐。每级放大的接种量为5-20％。
[0021]
在整个培养过程中，只要将最终发酵体系中物质维持在本发明中所强调的种类以及浓度即可以有本发明的效果。其中，活化培养基和种子培养基中物质的种类可以和发酵体系中的物质种类相同。为了进一步提高生产效果，在本发明一个优选实施方式中，活化培养基中天然氮源的浓度优选为0g/l，所述种子培养基中天然氮源的浓度优选为0g/l。在另一个优选实施方式中，所述活化培养基中天然氮源的浓度至少为4g/l；所述种子培养基中天然氮源的浓度至少为0.2g/l；所述发酵体系中，所述天然氮源的浓度至少为0.01g/l。
[0022]
其中，活化培养基优选为：碳源10～60g/l、酵母浸膏0～12g/l、谷氨酸10～80g/l、磷酸盐2～12g/l、硫酸盐3～20g/l、金属离子液0～3g/l、维生素液0.3～3g/l、氯化钠0～45g/l和氯化钙0～0.8g/l。更优选的是，活化培养基中氯化钠和氯化钙为0g/l。其中，活化培养的参数优选为：活化温度为20～35℃，转速100pm～500rpm，培养时间为12～36h。
[0023]
其中，种子培养基优选为：碳源20～80g/l、酵母浸膏0～18g/l、谷氨酸10～80g/l、磷酸盐0.8～5g/l、硫酸盐3～12g/l、金属离子液0～3g/、维生素液0.3～3g/l、氯化钠0～5g/l和氯化钙0～0.5g/l。更优选的是，种子培养基中氯化钠和氯化钙为0g/l。其中，种子培养的参数优选为：温度为20～35℃，转速60pm～300rpm，培养时间为12～36h，通气量为0.5～2vvm。
[0024]
在本发明中，可以使用保藏号为cctccm2019990的裂殖壶菌突变株(schizochytrium sp.)cabio-a-2
‑ⅱ
，该菌株已在专利申请cn201911399018.2中公开。该菌株的保藏信息如下：保藏编号为cctccm2019990；分类命名为：schizochytrium sp；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072；保藏日期为2019年12月2日。
[0025]
本发明使用特定的不额外补充钠/氯离子的发酵培养基对裂殖壶菌进行发酵培养，菌体生长代谢未受到影响，得到的总油得到了明显的提高，同时也有效的减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。更进一步的，选用酵母浸膏作为天然氮源，在保证效果的前提下，可以将酵母浸膏的含量降低到非常低的程度，使该方法具有更产业化性。
附图说明
[0026]
图1为实施例2和对比例1第一批次(对比例1-1)中菌体的生长曲线图。
具体实施方式
[0027]
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例，用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。
[0028]
本发明实施例和对比例中使用的菌株是保藏号为cctccm2019990的裂殖壶菌突变株(schizochytrium sp.)cabio-a-2
‑ⅱ
。
[0029]
其中，本发明实施例中，金属离子液为浓度为3g/l七水硫酸亚铁的水溶液。维生素液为硫胺素3g/l、泛酸钙为1g/l和生物素为0.01g/l的水溶液。
[0030]
实施例1
[0031]
1、配置活化培养基：在500ml三角瓶中加入100ml活化培养液基，该活化培养液基的成分为：甘油40g/l、谷氨酸30g/l、酵母浸膏6g/l、磷酸二氢钾6g/l、硫酸镁6g/l、金属离子液1g/l、维生素液1g/l。121℃灭菌30min，冷却备用。
[0032]
2、配置种子瓶培养基：在1000ml三角瓶中加入200ml种子培养液基，该种子培养液基的成分为：甘油50g/l、谷氨酸30g/l、酵母浸膏9g/l、磷酸二氢钾2.1g/l、硫酸镁5g/l、磷酸氢二铵1g/l、金属离子液1g/l、维生素液1g/l。121℃灭菌30min，冷却备用。
[0033]
3、取上述活化培养液再次接种至新鲜的液体种子培养基中，接种量5％，28℃，150～220rpm，培养24h，得到种子液。
[0034]
4、配置发酵培养基：250ml三角瓶中加入40ml发酵培养基，该发酵培养基的成分为：甘油50g/l、谷氨酸30g/l、酵母浸膏9g/l、磷酸二氢钾2.1g/l、硫酸镁5g/l、磷酸氢二铵1g/l、金属离子液1g/l、维生素液1g/l，121℃灭菌30min，冷却备用。
[0035]
5、取冻存的裂殖壶菌，解冻后，按接种量5％将培养好的一级种子瓶种子液接入含有上述100ml活化培养基的500ml一级种子瓶内，在28℃摇床中以220rpm的转速培养24h，得到活化培养液。
[0036]
6、按接种量5％将培养好的活化培养液接入含有上述200ml种子培养基的1000ml种子瓶内，在28℃摇床中以220rpm的转速培养24h，得到种子液。
[0037]
7、按接种量5％将培养好的种子瓶种子液接入发酵培养基中，在培养温度28℃，摇床转速300rpm，培养96h(根据残糖的情况分四次补加50％的葡萄糖)，控制ph6.8。
[0038]
平行实验两组，取平均值，此时菌体干重为76g/l，总油量为44g/l，油含量为57.9％，dha产量23g/l。
[0039]
实施例2
[0040]
本发明实施例提供的方法与实施例1相同，不同之处在于：1)发酵体系中：
[0041]
原料名称发酵培养基(g/l)甘油50谷氨酸45酵母浸膏4磷酸二氢钾4.2硫酸镁10氯化钠0氯化钙0硫酸钠0碳酸氢钠0硫酸铵2氯化钾0
金属离子液2维生素液2
[0042]
2)本实施例中的步骤7和实施例1中步骤7不同：
[0043]
7、按接种量0.2
‰
将培养好的种子瓶种子液接入含有上述1000l种子罐培养基的1700l种子罐中，在培养温度28℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm、ph自然培养24h，得到种子罐。(种瓶培养基与种罐培养基相同)
[0044]
8、按接种量6％将培养好的种子罐种子液接入含有上述5m3发酵罐培养基的12m3发酵罐中，维持温度28℃，通气量1vvm，搅拌转速220rpm在发酵至24h左右，补加15g/l硫酸铵，过程补加65％葡萄糖溶液，直至培养120h结束发酵。
[0045]
进行三组发酵实验得到结果为：
[0046]
批次dcw(g/l)tl(g/l)油含量dha(g/l)110460.558.1％29.329654.056.0％25.039654.356.8％27.2
[0047]
实施例3
[0048]
本发明实施例提供的方法与实施例1相同，不同之处在于：发酵体系中：
[0049][0050][0051]
平行实验两组，摇瓶发酵：取样检测，两批平均值为菌体干重为70g/l，总油41g/l，
油含量为58.5％，dha产量21g/l。
[0052]
实施例4
[0053]
本发明实施例提供的方法与实施例1相同，不同之处在于：发酵体系中：
[0054]
原料名称发酵培养基(g/l)甘油50谷氨酸38酵母浸膏0.3磷酸二氢钾2.4硫酸镁5氯化钠0氯化钙0硫酸钠0碳酸氢钠0硫酸铵1氯化钾0金属离子液1维生素液1
[0055]
实验1使用摇瓶发酵，发酵步骤同实施例1。
[0056]
取样检测，菌体干重为79g/l，总油46g/l,油含量为58.2％，dha产量23g/l。
[0057]
实验2使用发酵罐发酵，发酵罐发酵的步骤同实施例2。
[0058]
3次发酵实验的取样检测
[0059]
批次dcw(g/l)tl(g/l)油含量dha(g/l)19957.257.8％28.6210057.057.0％28.339553.356.1％26.8
[0060]
其中，实施例4的工艺稳定性明显高于实施例2。
[0061]
实施例5
[0062]
本发明实施例提供的方法与实施例1相同，不同之处在于：发酵体系中：
[0063]
原料名称发酵培养基(g/l)甘油50谷氨酸38酵母浸膏0.015磷酸二氢钾2.4硫酸镁5氯化钠0氯化钙0硫酸钠0碳酸氢钠0
硫酸铵1氯化钾0金属离子液1维生素液1
[0064]
本实施例中，活化培养基同实施例1，种子培养基为：甘油50g/l、谷氨酸38g/l、磷酸二氢钾2.1g/l、硫酸镁5g/l、磷酸氢二铵1g/l、金属离子液1g/l、维生素液1g/l。最终的发酵体系中，酵母浸膏成分由活化培养基带入。
[0065]
本实施例中使用与实施例1相同的摇瓶发酵，平行实验两组，取样检测，两批平均值为菌体干重为78g/l，总油44g/l，油含量为56.4％，dha产量22g/l。
[0066]
实施例6
[0067]
本发明实施例提供的方法与实施例5相同，不同之处在于：发酵体系中不含酵母浸膏，同时活化和种子培养基中均不加入酵母浸膏，其中活化培养基为甘油40g/l、谷氨酸36g/l、磷酸二氢钾6g/l、硫酸镁6g/l、金属离子液1g/l、维生素液1g/l。
[0068]
本实施例使用摇瓶发酵。
[0069]
取样检测，两批平均值为菌体干重为63g/l，总油34g/l，油含量为54.0％，dha产量17g/l。
[0070]
对比例1
[0071]
本对比例提供的方法与实施例2的发酵罐发酵方法相同，与实施例2提供的方法的不同之处在于：活化培养基、种瓶培养基以及发酵罐中各原料的浓度分别为：
[0072]
[0073][0074]
并且发酵过程中补料为40g/l的谷氨酸钠。
[0075]
本对比例的三次发酵结果为：
[0076]
批次dcw(g/l)tl(g/kg)油含量dha(g/l)11015150.5％27.521045250.0％28.33954749.6％23.3
[0077]
对比例2
[0078]
本对比例提供的方法与实施例2的发酵罐发酵方法相同，与实施例2提供的方法的不同之处在于：
[0079]
活化培养基为：葡萄糖10g/l，谷氨酸钠25g/l，酵母浸膏10g/l，氯化钠20g/l，硫酸镁0.5g/l，ph自然。
[0080]
种子培养基为：葡萄糖40g/l，谷氨酸钠25g/l，酵母浸膏10g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁5g/l，磷酸二氢钾1g/l，氯化钙0.5g/l，ph自然。
[0081]
发酵体系中：葡萄糖40g/l，酵母浸膏4g/l，谷氨酸钠30g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁5g/l，氯化钙0.5g/l，碳酸氢钠0.5g/l，硫酸钠8g/l，硫酸铵6g/l，氯化钾0.5g/l，ph自然。
[0082]
取样检测，此时菌体干重为99g/l，总油量为50.6g/l，油含量为50.6％，dha产量26.4g/l。
[0083]
结果分析：
[0084]
图1为实施例2和对比例1中第一批次(对比例1-1)的菌体生长曲线图。由附图1可以看到反应了减少了盐，并不会影响总体的生物量，并且生长期的生物量增加速度非常快。
[0085]
对比例1整体与实施例2对比以及对比例2跟实施例2对比，能够看到去除盐分以后，能够提高总油含量，虽然dha含量稍微有所降低，但是由于总含油量高，dha产量依然有所提高。
[0086]
实施例4-5跟实施例1-3能够看到，无论是摇瓶发酵或是发酵罐发酵，酵母浸膏的减少虽然对含油量稍微有影响，但从dha的产量来看，对整体发酵影响不大，并且批次间的结果较为稳定。
[0087]
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种使用裂殖壶菌发酵生产dha的方法，其特征在于，包括如下步骤：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵；所述发酵体系中，包括碳源、氮源和无机盐；所述无机盐由磷酸盐和镁盐组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮源为0～2g/l的天然氮源和不低于30g/l的有机氮源；优选的是，所述氮源为0.01～1g/l的天然氮源和不低于30g/l的有机氮源。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述天然氮源为酵母浸膏、玉米浆干粉、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白、黄豆饼粉中的一种或多种，优选为酵母浸膏；和/或，所述有机氮源为谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸中的一种或多种，优选为谷氨酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、甘油、糖蜜中的一种或多种；和/或，所述磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢钾中的一种或多种，优选为磷酸二氢钾；和/或，所述镁盐为硫酸镁。和/或，所述氮源还包括无机氮源，无机氮源为硫酸铵、氨水、硝酸钾中的一种或多种，优选为硫酸铵。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中，碳源20～80g/l、磷酸盐0.8～5g/l、硫酸镁3～12g/l、无机氮源1～6g/l。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中，还包括维生素液；所述维生素液包括硫胺素、泛酸钙和生物素；所述硫胺素、泛酸钙和生物素的质量比为(0.6～20):1:(0.002～0.02)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中，还包括金属离子液；所述金属离子液包括七水硫酸亚铁；所述七水硫酸亚铁的浓度优选为3～20g/l。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵参数为：发酵体系中ph为3～9，发酵温度为20～32℃，发酵初始通气量为0.5～3.0vvm，发酵转速0pm～500rpm，发酵时间为72～144h。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，还包括：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵前，先将裂殖壶菌在活化培养基中，培养后接入种子培养基中培养。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活化培养基中天然氮源的浓度为0g/l，所述种子培养基中天然氮源的浓度为0g/l；和/或，所述活化培养基中天然氮源的浓度至少为4g/l；所述种子培养基中天然氮源的浓度至少为0.2g/l；所述发酵体系中，所述天然氮源的浓度至少为0.01g/l。

技术总结
本发明提供了一种使用裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。该方法包括如下步骤：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵；所述发酵体系中，包括碳源、氮源和无机盐；所述无机盐由磷酸盐和镁盐组成。本发明使用了特定的不额外补充钠/氯离子的发酵培养基进行发酵培养，菌体生长代谢未受到影响，总油得到了明显的提高，同时也有效的减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。的减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。的减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。


技术研发人员：李翔宇 汪志明 江旭 赵洒 刘洋 唐孝鹏 陆姝欢
受保护的技术使用者：嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司
技术研发日：2020.11.06
技术公布日：2022/5/25