C型凝集素样受体-1作为真菌性角膜炎的治疗标志物的应用

c型凝集素样受体-1作为真菌性角膜炎的治疗标志物的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及c型凝集素样受体-1(c-type lectin-like receptor-1，clec-1)作为真菌性角膜炎的治疗标志物的应用。


背景技术：

2.真菌性角膜炎(fungal keratitis,fk)在全球范围内是一种严重的感染性眼部疾病，目前由于在临床上缺乏有效的治疗手段，往往可引发眼部严重并发症，严重者最终可导致永久性视力丧失。我国是以农业为主的发展中国家，而且是真菌性角膜炎的高发区，特别是农作时植物性角膜外伤成为该病的发生的主要原因。虽然近年来许多真菌性角膜炎药物已应用于临床，但这些药物的疗效较差，而且真菌逐渐出现了耐药性，尤其是对唑类药物的耐药性。由于缺乏有效的治疗手段，很多患者需要进行角膜移植甚至是眼球摘除。
3.真菌感染角膜后，角膜中的模式识别受体与真菌表面的病原体相关分子模式的相互识别，启动角膜的固有免疫应答清除真菌病原体。但糖皮质激素可以抑制巨噬细胞膜对抗原的吞噬和处理以及细胞免疫过程。而真菌各种致病因子能协助真菌黏附于宿主细胞，分解细胞膜中的磷脂，从而破坏细胞膜，使菌丝更有效地穿透宿主细胞，减少中性粒细胞的趋化性及巨噬细胞的吞噬功能。盲目应用糖皮质激素类药物可导致疾病进展，严重使可导致角膜穿孔。
4.角膜固有免疫应答启动后，大量的中性粒细胞及趋化因子聚集，导致角膜水肿和炎症浸润，甚至造成角膜溃疡甚至穿孔。因此，过强的免疫反应在控制外来感染的同时对角膜组织造成损伤，使角膜难以恢复透明，对患者视力造成严重的损伤。最近的研究证明，在疾病的后期使用糖皮质激素类药物可以减轻角膜混浊，帮助角膜维持良好的透明性。因此，把握使用糖皮质激素类药物使用的时间点至关重要。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种真菌性角膜炎的治疗标志物及其应用。
6.c型凝集素样受体家族编码于人类12号染色体自然杀伤(nk)基因复合体的着丝粒部分，可识别多种配体，执行多种功能。然而，未有文献公开或指示c型凝集素样受体家族与真菌性角膜炎之间的关联性。
7.本发明的申请人通过体内实验、体外实验，充分证明c型凝集素样受体-1(clec-1)作为c型凝集素样受体家族一员，在真菌性角膜炎急性炎症期表达降低，恢复期表达升高。使用那他霉素治疗真菌性角膜炎后，clec-1的表达下降。上调clec-1表达后，髓过氧化物酶(mpo)水平降低，中性粒细胞募集减少，il-1β表达降低，真菌负荷增加。
8.本发明采用定量聚合酶链反应(qrt-pcr)和免疫荧光法检测了真菌性角膜炎患者角膜中clec-1的表达。然后分别在thp-1巨噬细胞和c57bl/6小鼠模型上进行体内外实验，qrt-pcr、westernblot和免疫荧光法检测clec-1的表达。结果表明，clec-1在真菌性角膜炎
急性炎症期表达降低，恢复期表达升高。使用那他霉素治疗真菌性角膜炎后，clec-1的表达下降。利用病毒载体使小鼠角膜及thp-1巨噬细胞过表达clec-1，通过裂隙灯摄影、临床评分、菌落形成单位(cfu)、生物发光成像系统图像采集、mpo检测、免疫荧光染色、qrt-pcr和westernblot等实验证实上调clec-1表达后，mpo水平降低，中性粒细胞募集减少，il-1β表达降低，真菌负荷增加。
9.基于上述研究结果，本发明的第一方面提供了c型凝集素样受体-1作为真菌性角膜炎的治疗标志物的应用。
10.在本发明的第一方面所提供的应用中，所述真菌性角膜炎为烟曲霉菌性角膜炎。
11.在本发明的第一方面所提供的应用中，所述治疗标志物用于指示使用糖皮质激素类药物的用药时机。
12.进一步地，在本发明的第一方面所提供的应用中，当c型凝集素样受体-1在体内的表达增加，指示使用糖皮质激素类药物的用药时机。
13.本发明的第二方面提供一种用于在治疗真菌性角膜炎的过程中评估使用糖皮质激素类药物的用药时机的试剂盒，该试剂盒包括检测角膜中c型凝集素样受体-1水平的试剂。
14.在本发明的第二方面提供的试剂盒中，所述真菌性角膜炎为烟曲霉菌性角膜炎。
15.进一步地，本发明的第二方面提供的试剂盒中，所述试剂基于定量聚合酶链反应或免疫印迹技术实现对c型凝集素样受体-1水平的检测。
附图说明
16.图1是实施例1采用qrt-pcr法检测的正常角膜以及感染烟曲霉菌性角膜炎的人角膜中clec-1mrna表达的结果图；
17.图2是实施例1采用免疫荧光染色法检测的正常角膜以及感染烟曲霉菌性角膜炎的人角膜中clec-1蛋白表达的结果图；
18.图3是实施例2烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后裂隙灯显微镜下的照片；
19.图4是实施例2烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后，采用qrt-pcr法检测的小鼠角膜中clec-1mrna表达的结果图；
20.图5是实施例2烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后，采用western blot法检测的小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图；
21.图6是实施例2烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立5天后，采用免疫荧光染色法检测的小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图；
22.图7是实施例2小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组1、3、5天裂隙灯显微镜下的照片；
23.图8是实施例2小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组3天及5天的角膜临床评分；
24.图9是实施例2采用qrt-pcr检测小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组clec-1mrna表达的结果图；
25.图10是实施例2采用western blot检测小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合
那他霉素治疗组clec-1蛋白表达的结果图；
26.图11是实施例3用荧光显微镜拍摄的egfp在小鼠角膜中的表达的照片；
27.图12是实施例3采用qrt-pcr法检测clec-1mrna过表达的结果图；
28.图13是实施例3采用western blot检测clec-1蛋白过表达的结果图；
29.图14是实施例3感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜照片；
30.图15是实施例3感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜临床评分；
31.图16是实施例3感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜cfu结果图；
32.图17是实施例3感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜平均生物发光显示照片；
33.图18是实施例3感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜mpo结果图；
34.图19是实施例3采用免疫荧光法检测感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜中中性粒细胞分布结果图；
35.图20是实施例3采用qrt-pcr法检测正常小鼠、感染烟曲霉菌性角膜炎小鼠、clec-1过表达小鼠以及clec-1过表达联合烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中clec-1mrna表达的结果图；
36.图21是实施例3采用western blot法检测正常小鼠、感染烟曲霉菌性角膜炎小鼠、clec-1过表达小鼠以及clec-1过表达联合烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图；
37.图22是实施例3采用qrt-pcr法检测正常thp-1巨噬细胞、烟曲霉处理的thp-1巨噬细胞、clec-1过表达thp-1巨噬细胞以及clec-1过表达联合曲霉处理的thp-1巨噬细胞中clec-1mrna表达的结果图；
38.图23是实施例3采用western blot法检测正常thp-1巨噬细胞、烟曲霉处理的thp-1巨噬细胞、clec-1过表达thp-1巨噬细胞以及clec-1过表达联合曲霉处理的thp-1巨噬细胞中clec-1蛋白表达的结果图；
39.图24是实施例4小鼠角膜被烟曲霉菌感染后，clec-1升高前用激素组和clec-1升高后用激素组在用药2天后的角膜穿孔率；
40.图25是实施例4小鼠角膜被烟曲霉菌感染后，不用激素组和clec-1升高后用激素组在用药2天后的角膜临床评分。
具体实施方式
41.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本技术而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本技术各权利要求所要求保护的技术方案。
42.本发明提出以真菌性角膜炎患者c型凝集素样受体-1作为使用糖皮质激素类药物
的标志物，基于角膜中c型凝集素样受体-1水平评估使用糖皮质激素类药物的用药时机，以指导临床治疗。
43.本发明的实施方式所制定的实验方案和结果如下：收集6例烟曲霉菌性角膜炎患者和6例健康患者的角膜进行免疫荧光和qrt-pcr检测，标本经真菌培养和形态学证实。向患者详细说明了研究的目的和方法，在获得知情同意后采集样本。结果显示，与正常角膜相比，感染角膜中clec-1的表达显著增加。患者病程小于1个月时，clec-1mrna的表达无明显变化，但病程大于1个月时，clec-1mrna的表达明显升高。
44.在体内实验中，使用基质内注射法建立真菌性角膜炎小鼠模型，每天用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜并拍摄照片。感染后1/2、1、2、3、5、7、10、14天取角膜进行western blot和qrt-pcr检测，5天后取眼球进行免疫荧光染色。观察角膜感染程度，记录临床评分，第3天和第5天用qrt-pcr和western blot检测clec-1的表达。采用基质内注射clec-1腺相关病毒(aav)载体使clec-1在小鼠角膜中过度表达。从每只小鼠中随机选择一只眼睛接受结膜下注射5μl 1011vg载体。两周后，用荧光立体显微镜检测增强型绿色荧光蛋白，以确定病毒在角膜基质中的均匀分布。采用qrt-pcr和westernblot检测clec-1的过度表达。感染后1天取角膜进行mpo检测、免疫荧光染色、western blot和qrt-pcr。结果显示，clec-1在真菌性角膜炎急性炎症期表达降低，恢复期表达升高。使用那他霉素治疗真菌性角膜炎后，clec-1的表达下降。上调clec-1表达后，mpo水平降低，中性粒细胞募集减少，il-1β表达降低，真菌负荷增加。
45.在体外实验中，慢病毒载体clec-1在thp-1巨噬细胞中预处理，预处理24小时后，用烟曲霉分生孢子感染thp-1巨噬细胞16小时，收集thp-1巨噬细胞进行westernblot和qrt-pcr检测。结果与小鼠角膜炎模型结果一致，上调clec-1表达后，mpo水平降低，中性粒细胞募集减少，il-1β表达降低，真菌负荷增加。注：所有图中*表示p《0.05,**表示p《0.01。
46.基于本领域的分子生物学检测技术，本领域技术人员可通过聚合酶链反应或抗原-抗体免疫反应实现对clec-1的mrna或蛋白的检测。例如，通过抗clec-1蛋白的抗体来实现对clec-1蛋白的检测。
47.clec-1蛋白的氨基酸序列为如下seq id no.1所示：
48.mqakysstrdmldddgdttmslhsqgsattrhpeprrtehrapsstwrpvaltlltlclvlliglaalgllffqyyqlsntgqdtisqmeerlgntsqelqslqvqniklagslqhvaeklcrelynkaggytrnmvpasasseslrqlphmgesaaahrcspcteqwkwhgdncyqfykdskswedckyfclsenstmlkinkqedlefaasqsyseffysywtgllrpdsgkawlwmdgtpftselfhiiidvtsprsrdcvailngmifskdckelkrcvcerragmvkpeslhvppetlgegd。
49.westernblot检测方法：收集小鼠角膜，置于蛋白裂解液(含200μl ripa裂解液+2μl pmsf+2μl磷酸酶抑制剂)中裂解2小时，期间每15分钟摇匀一次。细胞裂解液在4℃下以12000rpm离心5分钟，获得上清液。用蛋白质测定试剂(bca，solarbio)测量蛋白质浓度。蛋白样本经10％或12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离后转移至聚偏二氟乙烯(pvdf，millipore)膜。将pvdf膜在室温下用蛋白质封闭缓冲液(beyotime)封闭2-3小时，加入一抗稀释液浸泡，4℃下过夜。取出膜后用pbst(1ml tween-20在1l pbs中)摇洗3次，将膜与二抗稀释液一起孵育1-2小时。本研究中使用的一抗是抗clec-1抗体(1:1000，nbp2-27096；novus biologicals)。与一抗相对应的抗兔抗体用作二抗。反应结束后用显影
剂(ecl试剂，thermo fisher scientifc)进行条带显影。
50.pcr检测方法：用rnaiso plus试剂(takara)分离组织，通过酶标仪(eppendorf)快速测量组织中rna的含量和纯度。逆转录步骤根据primescript rt reagent kit(takara)的推荐程序进行。用20μl反应体系(2μl cdna用depc 1:12.5稀释)进行定量rt-pcr。扩增条件如下：95℃30秒，5℃40秒，然后60℃30秒的95个循环。β-actin用作内参。其中，pcr反应体系中的引物如下表1所示：
51.表1引物序列表
[0052][0053]
实施例1 clec-1在烟曲霉性角膜炎患者角膜中表达增加
[0054]
1.实验材料
[0055]
1.1人角膜标本的收集
[0056]
收集6例烟曲霉菌性角膜炎患者和6例健康患者的角膜，标本经真菌培养和形态学证实。向患者详细说明了研究的目的和方法，在获得知情同意后，采集样本。任何形式的免疫抑制或局部类固醇治疗或急性或慢性全身性疾病的患者被排除在外。
[0057]
1.2实验真菌
[0058]
烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0059]
2.实验方法
[0060]
收集6例烟曲霉菌性角膜炎患者和6例健康患者的角膜进行免疫荧光和qrt-pcr检测。
[0061]
3.实验结果
[0062]
图1是采用qrt-pcr法检测的正常角膜以及感染烟曲霉菌性角膜炎的人角膜中clec-1mrna表达的结果图。图2是采用免疫荧光染色法检测的正常角膜以及感染烟曲霉菌性角膜炎的人角膜中clec-1蛋白表达的结果图。
[0063]
图1、图2表明，与健康角膜相比，感染烟曲霉菌性角膜炎的人角膜中clec-1mrna和蛋白的表达显著增加。且病程大于1个月时，clec-1mrna的表达明显升高。
[0064]
实施例2 clec-1在烟曲霉性角膜炎急性炎症期表达降低，恢复期表达升高
[0065]
1.实验材料
[0066]
1.1实验动物
[0067]
c57bl/6小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)
[0068]
1.2实验真菌
[0069]
烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0070]
2.实验方法
[0071]
2.1真菌制备
[0072]
将烟曲霉菌菌株接种于沙氏培养基上，37℃恒温培养箱培养2-3天。刮取菌丝及分生孢子取放入5ml无菌pbs中形成混合液，无菌纱布过滤除菌丝。4℃4500rpm离心10分钟，弃
上清，向沉淀中加入5ml菌pbs重悬，形成分生孢子悬浮液。用无菌pbs将分生孢子的浓度调至5
×
106cfu/ml。
[0073]
2.2模型小鼠
[0074]
选择8周龄健康清洁级c57bl/6雌性小鼠作为研究对象。实验前用裂隙灯检查排除眼部疾患，选择右眼为实验眼。实验小鼠的所有操作均符合中国科学技术部关于实验动物人性化治疗准则(vgkfcz-2006
–
398)的规定，并符合美国眼科和视觉研究协会(the association for research in vision and ophthalmology，arvo)关于在眼科和视觉研究中动物使用的原则和标准。
[0075]
2.3 clec-1在小鼠角膜中的表达
[0076]
2.3.1 clec-1在烟曲霉菌性角膜炎小鼠自然病程中表达的变化
[0077]
c57bl/6小鼠随机分为对照组和烟曲霉菌性角膜炎组。腹腔内注射8％水合氯醛对小鼠进行麻醉后，用微型注射器将2.5μl浓度为2.5
×
106cfu/ml的分生孢子悬浮液注入烟曲霉菌性角膜炎组小鼠角膜基质中。建模后每天用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜并拍照，感染后1/2、1、2、3、5、7、10、14天取角膜，用western blot和qrt-pcr检测clec-1的表达，5天取眼球进行免疫荧光染色。
[0078]
2.3.2 clec-1在烟曲霉菌性角膜炎小鼠治疗干预时表达的变化
[0079]
c57bl/6小鼠随机分为两组，均建立烟曲霉菌性角膜炎模型，一组在角膜感染烟曲霉后不治疗，另一组在角膜感染烟曲霉后用纳他霉素治疗。建模后每天用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜并拍照，记录临床评分，第3天和第5天取小鼠角膜用qrt-pcr和western blot检测clec-1的表达。
[0080]
3.实验结果
[0081]
3.1 clec-1在烟曲霉菌性角膜炎小鼠自然病程中表达的变化
[0082]
图3是烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后裂隙灯显微镜下的照片；图4是烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后，采用qrt-pcr法检测的小鼠角膜中clec-1mrna表达的结果图；图5是烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立1/2、1、2、3、5、7、10、14天后，采用western blot法检测的小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图；图6是烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型建立5天后，采用免疫荧光染色法检测的小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图。
[0083]
如图3～图6所示，c57bl/6小鼠在感染烟曲霉菌性角膜炎1天后观察到明显的角膜混浊，并持续到感染后14天。随着新生血管的增多，角膜炎逐渐好转。与对照组相比，感染组小鼠角膜clec-1蛋白水平在感染后12h下降，并持续到感染后3d，从第5天开始，clec-1的表达显著增加，并持续到感染后14天。clec-1在小鼠烟曲霉性角膜炎急性炎症期表达降低，在恢复期表达升高。
[0084]
3.2 clec-1在烟曲霉菌性角膜炎小鼠治疗干预时表达的变化
[0085]
图7是小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组1、3、5天裂隙灯显微镜下的照片；图8是小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组3天及5天的角膜临床评分；图9是采用qrt-pcr检测小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组clec-1mrna表达的结果图；图10是采用western blot检测小鼠烟曲霉菌感染组与烟曲霉菌感染联合那他霉素治疗组clec-1蛋白表达的结果图。
[0086]
如图7～图10所示，那他霉素治疗烟曲霉菌性角膜炎小鼠后，临床评分下降，clec-1的表达上调。
[0087]
实施例3 clec-1过表达减轻炎症反应
[0088]
1.实验材料
[0089]
1.1实验用品
[0090]
clec-1腺病毒(aav)载体(genechem公司)
[0091]
clec-1慢病毒载体(genechem公司)
[0092]
1.2实验细胞
[0093]
thp-1巨噬细胞(中国武汉)
[0094]
1.3实验真菌
[0095]
烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0096]
2.实验方法
[0097]
2.1体内实验
[0098]
从每只小鼠中随机选择一只眼睛结膜下注射(5μl)1011vg aav载体。两周后，用荧光立体显微镜检测增强型绿色荧光蛋白(egfp)，以确定病毒在角膜基质中的均匀分布。采用qrt-pcr和westernblot检测clec-1的过表达。感染后1天取角膜进行mpo检测、免疫荧光染色、westernblot和qrt-pcr。
[0099]
2.2体外实验
[0100]
将人角膜上皮细胞置于37℃，5％co2的培养箱中，培养至细胞密度达到80％。将clec-1慢病毒载体加入thp-1巨噬细胞中预处理24小时。用烟曲霉分生孢子感染thp-1巨噬细胞，感染倍数(moi)为1，处理24h后收集thp-1巨噬细胞进行western blot和qrt-pcr检测。
[0101]
3.实验结果
[0102]
3.1体内实验
[0103]
图11是用荧光显微镜拍摄的egfp在小鼠角膜中的表达的照片；图12是采用qrt-pcr法检测clec-1mrna过表达的结果图；图13是采用western blot检测clec-1蛋白过表达的结果图；图14是感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜照片；图15是感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜临床评分；图16是感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜cfu结果图；图17是感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜平均生物发光显示照片；图18是感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜mpo结果图；图19是采用免疫荧光法检测感染烟曲霉菌性角膜炎1天后对照组小鼠与clec-1过表达组小鼠角膜中中性粒细胞分布结果图；图20是采用qrt-pcr法检测正常小鼠、感染烟曲霉菌性角膜炎小鼠、clec-1过表达小鼠以及clec-1过表达联合烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中clec-1mrna表达的结果图；图21是采用western blot法检测正常小鼠、感染烟曲霉菌性角膜炎小鼠、clec-1过表达小鼠以及clec-1过表达联合烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中clec-1蛋白表达的结果图。
[0104]
如图11～图13所示，clec-1的过表达有效。如图14～图21所示，上调clec-1表达后，角膜中mpo、cfu水平降低，中性粒细胞募集减少，il-1β表达降低，真菌负荷增加，炎症反
应减轻。
[0105]
3.2体外实验
[0106]
图22是采用qrt-pcr法检测正常thp-1巨噬细胞、烟曲霉处理的thp-1巨噬细胞、clec-1过表达thp-1巨噬细胞以及clec-1过表达联合曲霉处理的thp-1巨噬细胞中clec-1mrna表达的结果图；图23是采用western blot法检测正常thp-1巨噬细胞、烟曲霉处理的thp-1巨噬细胞、clec-1过表达thp-1巨噬细胞以及clec-1过表达联合曲霉处理的thp-1巨噬细胞中clec-1蛋白表达的结果图。
[0107]
如图22、23所示，在thp-1巨噬细胞中，烟曲霉菌处理后il-1βmrna和蛋白质的表达下调。
[0108]
实施例4 clec-1用于评估真菌性角膜炎糖皮质激素类药物用药时机1.实验材料
[0109]
1.1实验动物
[0110]
c57bl/6小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)
[0111]
1.2实验真菌
[0112]
烟曲霉菌3.0772株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)
[0113]
2.实验方法
[0114]
为进一步证实clec-1在用于评估小鼠真菌性角膜炎糖皮质激素类药物用药时机时的有效性，本发明绘制了角膜穿孔率和临床评分图。具体步骤如下：采用相同方法建立40只真菌性角膜炎小鼠模型，其中20只为clec-1升高前用激素组(10只为2天时用药，10只为3天时用药)，20只为clec-1升高后用激素组(10只为5天时用药，10只为7天时用药)，用激素2天后，进行角膜穿孔率数据分析。
[0115]
采用相同方法建立20只真菌性角膜炎小鼠模型，其中10只为不用激素组，10只为clec-1升高后用激素组(5天)，用激素2天后，进行角膜临床评分数据分析。
[0116]
如图24所示，clec-1升高后使用糖皮质激素，角膜穿孔率明显下降。
[0117]
如图25所示，clec-1升高后使用糖皮质激素，角膜临床评分明显降低。
[0118]
实施例5试剂盒
[0119]
本发明的实施方式还提供一种试剂盒，该试剂盒用于在治疗烟曲霉菌性角膜炎的过程中评估使用糖皮质激素类药物的用药时机。具体地，该试剂盒中包含检测角膜中clec-1水平的试剂。
[0120]
具体地，该试剂盒基于定量聚合酶链反应或免疫印迹技术实现clec-1含量的检测。试剂盒的使用方法简述如下：刮取真菌性角膜炎患者角膜上皮，采用定量聚合酶链反应或免疫印迹技术检测角膜上皮中clec-1受体mrna或蛋白的表达量。使用两独立样本t检验的方法分析所得的结果，当clec-1的表达量较前出现有意义的升高(p＜0.05)时，即为可应用糖皮质激素类药物的时机(可参照本技术前面部分的图4或图5)。
[0121]
来源于不同的个体以及不同的物种，clec-1蛋白具有一定的序列差异性，但其本质上都属于同源蛋白，都可以作为真菌性角膜炎时使用糖皮质激素类药物的标志物，因此，本发明的clec-1可以是seq id no.1所示的蛋白，也可以是与seq id no.1具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同源性的蛋白；通过检测clec-1同源性蛋白，也可以明确真菌性角膜炎时糖皮质激素类药物的用药时机。
[0122]
在待检测的clec-1蛋白序列已知的基础上，本领域技术人员容易获得抗clec-1蛋
白的抗体，任何抗clec-1蛋白的抗体都可以实现对clec-1蛋白的检测。基于此，无论具有何种结构或序列的抗clec-1蛋白的抗体，只要将其用于检测clec-1蛋白，制备成具有指导真菌性角膜炎时应用糖皮质激素类药物应用的试剂盒，即属于本发明的保护范围。
[0123]
通过抗原-抗体免疫实现clec-1蛋白检测的技术包括但不仅限于免疫印迹技术，采用其他类似的实现对clec-1蛋白的检测也是属于本发明的保护范围。
[0124]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

技术特征：
1.c型凝集素样受体-1作为真菌性角膜炎的治疗标志物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌性角膜炎为烟曲霉菌性角膜炎。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗标志物用于指示使用糖皮质激素类药物的用药时机。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当c型凝集素样受体-1在体内的表达增加，指示使用糖皮质激素类药物的用药时机。5.一种用于在治疗真菌性角膜炎的过程中评估使用糖皮质激素类药物的用药时机的试剂盒，其特征在于，包含用于检测角膜中c型凝集素样受体-1水平的试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述真菌性角膜炎为烟曲霉菌性角膜炎。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂基于定量聚合酶链反应或免疫印迹技术实现对c型凝集素样受体-1水平的检测。

技术总结
本发明公开了C型凝集素样受体-1作为真菌性角膜炎中治疗标志物的应用，并提供一种用于在治疗真菌性角膜炎的过程中评估使用糖皮质激素类药物的用药时机的试剂盒。C型凝集素样受体-1可作为一种生物标志物简便而安全的判断真菌性角膜炎时糖皮质激素类药物的使用时机，在指导临床决策方面具有重要的意义。在指导临床决策方面具有重要的意义。在指导临床决策方面具有重要的意义。


技术研发人员：车成业 张倩 吕乐雨
受保护的技术使用者：青岛大学附属医院
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2022/5/25