牛尾蒿内酯A-T及其药物组合物和其制备方法与应用

牛尾蒿内酯a-t及其药物组合物和其制备方法与应用
技术领域：
1.本发明属于药物技术领域。具体地涉及化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20),及其制备方法和应用，含其的药物组合物及其应用。


背景技术：

2.肝癌是全球居第七的常见恶性肿瘤，大多数肝癌即肝细胞癌(hcc)，hcc是一个全球性健康问题，其发病隐匿、进展快、预后差，从而导致死亡率高居全球所有癌症死亡率第三位。2018年全球肝癌新发人数超过84万，因肝癌导致的死亡人数约为78万。其中，约一半的肝癌新发病例发生在我国，四分之三的hcc归因于慢性hbv和hcv感染。目前，临床上用于治疗肝癌患者的药物有七个：索拉非尼(sorafenib)、瑞格菲尼(regorafenib)、乐伐替尼(lenvatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、纳武单抗(nivolumab)、帕姆单抗(pembrolizumab)、雷莫卢单抗(ramucirumab)，但易产生耐药性和毒副作用。因此，迫切需要开发新型有效抗肝癌药物。
3.蒿属(artemisia l.)隶属于菊科(asteraceae)春黄菊族(anthemideae l.)，是菊科中分布最广、种类最多的一个属。蒿属为一、二年生或多年生草本植物，半灌木或小灌木，全世界共380余种，广布于非洲地区和北半球，我国有186种(其中82个特有种)，44变种，遍布于全国各地，在温热带地区分布最多。该属植物多具有清热解毒、抗菌消炎、祛风除湿、通经活络、活血和止血等功效，如青蒿、茵陈蒿、艾、牡蒿、奇蒿等，为常用药材。
4.牛尾蒿(artemisia dubia)为菊科蒿属多年生草本植物，为中国特有种。生于低海拔至3500米地区的山坡、草原、疏林及林缘等地。分布于内蒙古、甘肃、四川、云南、西藏等地。味苦、微辛,性凉。清热,凉血,解毒,杀虫。主治急性热病,肺热咳嗽,咽喉肿痛,鼻蛆,血风疮,烧虫病。
5.在本发明的前期工作中，发现牛尾蒿干燥地上部分的乙醇提取物对三株肝癌细胞(hepg 2,huh7,sk-hep-1)具有较强的细胞毒活性，进一步从中分离得到20个对三株肝癌细胞株具有细胞毒活性的倍半萜二聚体类化合物，牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)。迄今，现有技术中无牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有其药物组合物在制备或治疗肝癌药物中的应用报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的式(i)所示的牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)，及其制备方法和应用，含牛尾蒿内酯a-t的药物组合物及其应用，该类化合物对肝癌细胞株具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝癌药物。
7.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
8.本发明提供了一系列倍半萜二聚体类化合物，牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)，具有如下式(i)所示结构：
[0009][0010]
本发明提供了上述化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)的制备方法，取牛尾蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，随后用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚以v/v计，2:98,5:95,10:90,20:80,30:70,50:50进行梯度洗脱得到7个流分fr.ad-1～fr.ad-7；fr.ad-4经经中压mci chp 20p柱层析，用水-甲醇70:30,50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到4个组分fr.ad-4-1-fr.ad-4-4.fr.ad-4-3经硅胶柱层析，乙酸乙酯-氯仿5:95至25:75梯度洗脱得到3个流分fr.ad-4-3-1～fr.ad-4-3-3；fr.ad-4-3-1经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物1和2；fr.ad-4-3-2经sephadex lh-20和半制备hplc，得到化合物3和6；fr.ad-4-3-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物4,5,7和8；
[0011]
fr.ad-5经经中压c18柱层析，用水-甲醇50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到3个组分fr.ad-5-1-fr.ad-5-3.fr.ad-5-1经硅胶柱层析，丙酮-石油醚10:90至30:70洗脱得到4个流分fr.ad-5-1-1～fr.ad-5-1-4；fr.ad-5-1-1经硅胶柱层析得到化合物9和11；fr.ad-5-1-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物10,12,和14；fr.ad-5-1-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物13,15,和18；fr.ad-5-1-4经硅胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物16和17；fr.ad-5-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物19和20。
[0012]
本发明提供了上述化合物1-20在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0013]
本发明同时还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的式(i)化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。并提供了该药物组合物的制备方法。该方法按上述制备牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)的方法，先制得化合物1-20，再加入可药用载体或赋形剂。
[0014]
并此，还提供了所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
[0015]
当所述化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)中的至少一种用于制备抗肝癌药物时，本发明优选将所述化合物1-20直接使用，或以药物组合物的形式使用。
[0016]
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
[0017]
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
[0018]
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0019]
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
[0020]
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
[0021]
1.本发明提供了一系列新的倍半萜二聚体类化合物，牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)。填补了现有技术的空白。
[0022]
2.本发明提供了制备新化合物1-20的新的方法，该方法原料易得，工艺简单，易于操作。
[0023]
3.本发明提供了新化合物1-20作为有效成分的药物组合物，为新的抗肝癌药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
[0024]
4.本发明的新化合物1-20对三株肝癌细胞(hepg2,sk-hep-1和huh7)的细胞毒活性均具有较强活性，对于hepg2细胞,化合物2,4,5,13,16和17具有较强的细胞毒活性其ic
50
值分别为5.4,5.7,14.5,14.5,9.7和13.7μm,较阳性药物索拉非尼更优；化合物3和6-8亦表现出一定的细胞毒活性，其ic
50
值分别为14.9,14.8,19.4和14.9μm，与阳性药物索拉非尼相当。对于huh7细胞,化合物2,4,11和13具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为8.2,4.3,13.1和12.2μm,与阳性药物索拉非尼相当。对于sk-hep-1细胞,化合物2,3,4,和5具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为13.4,17.2,8.4,和13.6μm,优于阳性药物索拉非尼。
[0025]
5.牛尾蒿中分离得到的新化合物倍半萜二聚体牛尾蒿内酯a-t(化合物1-20)可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
附图说明：
[0026]
图1为本发明化合物牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)的结构式示意图；
[0027]
图2为本发明化合物1的x-单晶衍射结构示意图；
[0028]
图3化合物2的x-单晶衍射结构示意图；
[0029]
图4化合物4的x-单晶衍射结构示意图；
[0030]
图5化合物6的x-单晶衍射结构示意图；
[0031]
图6化合物11的x-单晶衍射结构示意图；
[0032]
图7化合物15的x-单晶衍射结构示意图；
[0033]
图8化合物18的x-单晶衍射结构示意图。
具体实施方式：
[0034]
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜二聚体类化合物，牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t,1-20)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
[0035]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
实施例1：
[0037]
牛尾蒿内酯a-t(artemidubolides a-t)即化合物1-20的制备：
[0038]
取牛尾蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(2:98,5:95,10:90,20:80,30:70,50:50v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到7个流分fr.ad-1～fr.ad-7；fr.ad-4经经中压mci chp 20p柱层析，用水-甲醇(70:30,50:50,30:70,10:90)梯度洗脱，得到4个组分fr.ad-4-1-fr.ad-4-4.fr.ad-4-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-氯仿,5:95至25:75)得到3个流分fr.ad-4-3-1～fr.ad-4-3-3；fr.ad-4-3-1经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)和半制备hplc(水-乙腈,55:45)纯化，得到化合物1和2；fr.ad-4-3-2经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)和半制备hplc(水-乙腈,35:65)纯化，得到化合物3和6；fr.ad-4-3-3经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)和半制备hplc纯化，得到化合物4,5,7和8。
[0039]
fr.ad-5经经中压c18柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90)梯度洗脱，得到3个组分fr.ad-5-1-fr.ad-5-3.fr.ad-5-1经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,10:90至30:70)得到4个流分fr.ad-5-1-1～fr.ad-5-1-4；fr.ad-5-1-1经硅胶柱层析(乙酸乙酯-氯仿,10:90至20:80)得到化合物9和11。fr.ad-5-1-2经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)
和半制备hplc纯化，得到化合物10,12,和14。fr.ad-5-1-3经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)和半制备hplc(水-甲醇,40:60)纯化，得到化合物13,15,和18。fr.ad-5-1-4经硅胶柱层析(乙酸乙酯-氯仿,25:75)和半制备hplc(水-甲醇,45:55)纯化，得到化合物16和17。fr.ad-5-2经sephadex lh-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)和半制备hplc(水-乙腈,50:50)纯化，得到化合物19和20。
[0040]
化合物1-20的结构数据：
[0041]
核磁共振图谱使用avance iii 600(bruker,switzerland)或avance iii hd 400(bruker,bremerhaven,germany)超导核磁共振仪测定，tms(四甲基硅烷)作为内标。高分辨质谱分析采用岛津lc-ms-it-tof(shimadzu,kyoto,japan)测定。红外光谱(ir)经kbr压片方法，通过nicolet is10型红外光谱仪(thermo fisher scientific,madison,usa)测定。ecd谱采用chirascan型仪器(applied photophysics,surrey,uk)测定。旋光经autopol vi旋光仪(rudolph research analytical,hackettstown,usa)测定。熔点用x-4b显微熔点仪来测定，该熔点仪购自上海精密科学仪器有限公司。薄层层析硅胶板hsgf254是烟台江友硅胶开发有限公司产品；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶lh-20购自ge healthcare bio-sciences ab公司。高效液相色谱仪为岛津公司生产，控制器型号是cbm-20a，泵型号是lc-20ar，检测器型号为spd-m20a，柱温箱型号为at-350，使用的色谱柱型号为agilent-eclipse xdb-c20(5μm,9.4
×
250mm)。色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过mingchetm-d 24uv merk millipore系统纯化而得。中压液相(dr flash
‑ⅱ
)为上海利穗公司产品，mci柱日本三菱公司，型号为chp-20p(75～150μm)。分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂。显色剂为10％h2so
4-etoh溶液。
[0042][0043]
牛尾蒿内酯a(artemidubolide a，1)
[0044]
分子式：c
30h36
o6[0045]
分子量：492.23
[0046]
性状：斜方晶体
[0047]
熔点：239～240℃
[0048]
旋光：(c 0.104,甲醇)
[0049]
hresims(+)m/z:实验值515.2396[m+na]
+
,计算值515.2404[m+na]
+
。
[0050]
ir(kbr)ν
max
:3498,1762,1723,1666,1376,1254,1222,1074cm-1
。
[0051]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):200(
–
9.80),218(+10.91)nm。
[0052]
晶体数据：c
30h36
o6,m＝492.59,
[0068]
分子量：492.38
[0069]
性状：白色无定型粉末
[0070]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0071]
hresims(+)m/z:实验值493.2591[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0072]
ir(kbr)ν
max
:3450,1765,1632,1448,1382,1229,1150,1059cm-1。
[0073]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):212(+11.83)nm。
[0074]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表1和4。
[0075][0076]
牛尾蒿内酯d(artemidubolide d,4)
[0077]
分子式：c
30h36
o6[0078]
分子量：492.35
[0079]
性状：斜方晶体
[0080]
旋光：(c 0.11,甲醇)
[0081]
hresims(+)m/z:实验值493.2566[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0082]
ir(kbr)ν
max
:3448,1770,1732,1660,1448,1380,1256,1115,1007cm-1。
[0083]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):217(18.27)nm。
[0084]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表1和4。
[0085]
晶体数据：c
30h36
o6,m＝492.59,α＝90
°
,β＝90
°
,γ＝90
°
,t＝100.(2)k,晶体尺寸p212121,z＝4,μ(cu kα)＝0.733mm-1
,晶体数据采用d8 quest型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为57961，观测到4897次(r
int
＝0.0514),i》2σ(i),wr(f2)＝0.0272(i》2σ(i)),r1＝0.0274,wr(f2)＝0.0707,f2＝1.098.flack parameter＝0.07(3).化合物4的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号:ccdc 2142231.晶体结构示意图见图4.
[0086][0087]
牛尾蒿内酯e(artemidubolide e,5)
[0088]
分子式：c
30h36
o6[0089]
分子量：492.87
[0090]
性状：白色无定型粉末
[0091]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0092]
hresims(+)m/z:实验值493.2581[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0093]
irν
max
:3448,1770,1732,1660,1448,1380,1256,1115,1007cm-1。
[0094]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):217(18.27)nm。
[0095]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表1和4。
[0096][0097]
牛尾蒿内酯f(artemidubolide f,6)
[0098]
分子式：c
30h38
o6[0099]
分子量：494.26
[0100]
性状：斜方晶体
[0101]
旋光：(c 0.12,甲醇)
[0102]
hresims(+)m/z:实验值495.2751[m+h]+,计算值495.2741[m+h]+。
[0103]
irν
max
:3469,1780,1732,1635,1448,1305,1292,1200,1078cm-1。
[0104]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):217(+11.85)nm。
[0105]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表1和4。
[0106]
晶体数据：c
30h38
o6·
h2o,m＝512.62,α＝90
°
,β＝90
°
,γ＝90
°
,t＝100.(2)k,晶体尺寸p212121,z＝4,μ(cu kα)＝0.745mm-1
,晶体数据采用d8 quest型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为46609，观测到4962次(r
int
＝0.0582),i》2σ(i),wr(f2)＝0.0495(i》2σ(i)),r1＝0.0509,wr(f2)＝0.1386,f2＝1.061.flack parameter＝0.00(5).化合物6的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号:ccdc 2142234.化合物6的x-单晶衍射结构见图5.
[0107][0108]
牛尾蒿内酯g(artemidubolide g,7)
[0109]
分子式：c
30h36
o6[0110]
分子量：492.17
[0111]
性状：白色无定型粉末
[0112]
旋光：(c 0.08,甲醇)
[0113]
hresims(+)m/z:实验值493.2568[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0114]
ir(kbr)ν
max
:3486,1755,1638,1451,1384,1223,1078cm-1。
[0115]
ecd(甲醇)λ
max
(δε)201(
–
7.92),216(+12.25)nm。
[0116]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表1和4。
[0117][0118]
牛尾蒿内酯h(artemidubolideh,8)
[0119]
分子式：c
30h38
o7[0120]
分子量：510.19
[0121]
性状：白色无定型粉末
[0122]
旋光：(c 0.09,甲醇)
[0123]
hresims(
–
)m/z:实验值555.2599[m+hcoo]
–
,计算值555.2600[m+hcoo]
–
。
[0124]
irν
max
:3542,1762,1665,1389,1313,1141,1109cm-1。
[0125]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):204(+12.46),222(+16.49)nm。
[0126]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和4。
[0127][0128]
牛尾蒿内酯i(artemidubolide i,9)
[0129]
分子式：c
30h38
o7[0130]
分子量：510.76
[0131]
性状：白色无定型粉末
[0132]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0133]
hresims(
–
)m/z:实验值555.2548[m+hcoo]
–
,计算值555.2600[m+hcoo]
–
。
[0134]
irν
max
:3433,1757,1635,1444,1384,1256,1152cm-1。
[0135]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):216(+14.37)nm。
[0136]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和4。
[0137][0138]
牛尾蒿内酯j(artemidubolide j,10)
[0139]
分子式：c
31h36
o6[0140]
分子量：504.62
[0141]
性状：白色无定型粉末
[0142]
旋光：(c 0.11,甲醇)
[0143]
hresims(+)m/z:实验值505.2573[m+h]+,计算值505.2585[m+h]+。
[0144]
irν
max
:1770,1687,1618,1444,1259,1146,1013cm-1。
[0145]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):197(+7.78),263(
–
18.27)nm。
[0146]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和4。
[0147][0148]
牛尾蒿内酯k(artemidubolide k,11)
[0149]
分子式：c
30h36
o6[0150]
分子量：492.45
[0151]
性状：斜方晶体
[0152]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0153]
hresims(+)m/z:实验值493.2571[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0154]
ir(kbr)ν
max
:3459,1766,1744,1626,1458,1257,1132,1019cm-1。
[0155]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):198(+9.89)nm。
[0156]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和5。
[0157]
晶体数据：c
30h36
o6·
ch4o,m＝524.63,α＝90
°
,β＝112.6240(10)
°
,γ＝90
°
,t＝100.(2)k,晶体尺寸p212121,z＝4,μ(cu kα)＝0.752mm-1
,晶体数据采用d8 quest型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为32139，观测到4927次(r
int
＝0.0323),i》2σ(i),wr(f2)＝0.0649(i》2σ(i)),r1＝0.0263,wr(f2)＝0.0649,f2＝1.061.flack parameter＝0.00(5).化合物11的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号:ccdc 2142234.化合物11的x-单晶衍射结构见图6.
[0158][0159]
牛尾蒿内酯l(artemidubolide l,12)
[0160]
分子式：c
30h36
o6[0161]
分子量：492.34
[0162]
性状：白色无定型粉末
[0163]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0164]
hresims(
–
)m/z:实验值537.2475[m+hcoo]
–
,计算值537.2494[m+hcoo]
–
。
[0165]
ir(kbr)ν
max
:3501,1766,1638,1321,1264,1232,1152cm-1。
[0166]
ecd(甲醇)λ
max 226(
–
3.78)nm。
[0167]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和5。
[0168][0169]
牛尾蒿内酯m(artemidubolide m,13)
[0170]
分子式：c
30h36
o6[0171]
分子量：492.76
[0172]
性状：白色无定型粉末
[0173]
旋光：(c 0.09,甲醇)
[0174]
hresims(+)m/z:实验值493.2591[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0175]
ir(kbr)ν
max
:3459,1759,1665,1320,1266,1246,1196cm-1。
[0176]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):212(
–
13.09)nm。
[0177]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和5。
[0178][0179]
牛尾蒿内酯n(artemidubolide n,14)
[0180]
分子式：c
30h38
o7[0181]
分子量：510.31
[0182]
性状：白色无定型粉末
[0183]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0184]
hresims(+)m/z:实验值493.2591[m+h]+,计算值493.2585[m+h]+。
[0185]
ir(kbr)ν
max
:3459,1759,1665,1320,1266,1246,1196cm-1。
[0186]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):212(
–
13.09)nm。
[0187]
1h nmr和13c nmr(dept)数据见表2和5。
[0188][0189]
牛尾蒿内酯o(artemidubolide o,15)
[0190]
分子式：c
30h34
o6[0191]
分子量：490.23
[0192]
性状：斜方晶体
[0193]
熔点：195～196℃
[0194]
旋光：(c 0.11,甲醇)
[0195]
hresims(+)m/z:实验值491.2436[m+h]+,计算值491.2428[m+h]+。
[0196]
ir(kbr)ν
max
:3487,1774,1683,1320,1264,1238,1200cm-1。
[0197]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):217(
–
5.92),243(+2.43),272(
–
2.06)nm。
[0198]
晶体数据：3(c
30h34
o6)
·
ch4o,m＝1503.75,o,m＝1503.75,α＝90
°
,β＝90
°
,γ＝90
°
,t＝100.(2)k,晶体尺寸p212121,z＝4,μ(cu kα)＝0.752mm-1
,晶体数据采用d8 quest型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为92865，观测到15494次(r
int
＝0.0511),i》2σ(i),wr(f2)＝0.0830(i》2σ(i)),r1＝0.0325,wr(f2)＝0.0830,f2＝1.011.flack parameter＝0.00(3).化合物15的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号:ccdc 2142236.化合物15的x-单晶衍射结构示意图见图7.
[0199]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0200][0201]
牛尾蒿内酯p(artemidubolide p,16)
[0202]
分子式：c
30h34
o6[0203]
分子量：490.34
[0204]
性状：白色无定型粉末
[0205]
旋光：(c 0.12,甲醇)
[0206]
hresims(+)m/z:实验值491.2410[m+h]+,计算值491.2428[m+h]+。
[0207]
ir(kbr)ν
max
:3477,1762,1634,1405,1232,1068cm-1。
[0208]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):212(
–
15.89)nm。
[0209]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0210][0211]
牛尾蒿内酯q(artemidubolide q,17)
[0212]
分子式：c
30h34
o6[0213]
分子量：490.22
[0214]
性状：白色无定型粉末
[0215]
旋光：(c 0.10,甲醇)
[0216]
hresims(+)m/z:实验值491.2410[m+h]
+
,计算值491.2428[m+h]
+
。
[0217]
ir(kbr)ν
max
:33477,1762,1634,1405,1232,1068cm-1
。
[0218]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):212(
–
15.89)nm。
[0219]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0220][0221]
牛尾蒿内酯r(artemidubolide r 18)
[0222]
分子式：c
30h44
o8[0223]
分子量：532.67
[0224]
性状：斜方晶体
[0225]
熔点：195～196℃
[0226]
旋光：(c 0.11,甲醇)
[0227]
hresims(
–
)m/z:实验值577.3024[m+hcoo]
–
,计算值577.3018[m+hcoo]
–
。
[0228]
ir(kbr)ν
max
:3461,1760,1702,1631,1223,1153cm-1。
[0229]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):210(
–
32.78)nm。
[0230]
晶体数据：2(c
30h44
o8)
·
h2o,m＝1083.31,o,m＝1083.31,α＝90
°
,β＝114.315(2)
°
,γ＝90
°
,t＝100.(2)k,晶体尺寸p212121,z＝4,μ(cu kα)＝0.752mm-1
,晶体数据采用d8 quest型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为25339，观测到5513次(r
int
＝0.0667),i》2σ(i),wr(f2)＝0.0979(i》2σ(i)),r1＝0.0388,wr(f2)＝0.1043,f2＝1.075.flack parameter＝0.03(8).化合物18的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号:ccdc 2142233.化合物18的x-单晶衍射结构示意图见图8.
[0231]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0232][0233]
牛尾蒿内酯s(artemidubolide s,19)
[0234]
分子式：c
30h40
o8[0235]
分子量：528.21
[0236]
性状：白色无定型粉末
[0237]
旋光：(c 0.12,甲醇)
[0238]
hresims(+)m/z:实验值551.2624[m+na]+,计算值551.2615[m+na]+。
[0239]
ir(kbr)ν
max
:3427,1757,1711,1669,1625,1382,1258,1156cm-1。
[0240]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):205(
–
5.51)nm。
[0241]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0242][0243]
牛尾蒿内酯t(artemidubolide t,20)
[0244]
分子式：c
30h40
o8[0245]
分子量：528.10
[0246]
性状：白色无定型粉末
[0247]
旋光：(c 0.12,甲醇)
[0248]
hresims(+)m/z:实验值551.2616[m+na]+,计算值551.2615[m+na]+。
[0249]
ir(kbr)ν
max
:3429,1760,1710,1639,1378,1262,1041cm-1。
[0250]
ecd(甲醇)λ
max
(δε):209(
–
12.12)nm。
[0251]1h nmr和
13
c nmr(dept)数据见表3和5。
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256][0257]
实施例2：
[0258]
化合物1-20对三株肝癌细胞株的细胞毒活性。
[0259]
1.材料和方法
[0260]
1.1材料
[0261]
hepg2细胞株由中国科学院昆明植物研究所活性筛选中心赠予，sk-hep-1和huh7细胞株购自上海纪宁生物科技有限公司；培养基(dulbecco's modified eagle medium,dmem)购自thermo fisher scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,fbs)购自life technologies(ny,usa)；rpmi-1640购自thermofisher biochemical products(北京，中国)。
[0262]
1.2仪器
[0263]
flex station 3台式多功能酶标仪(bio-rad 680,美国)；分析天平(ag135,metler toledo，中国)；恒温箱(dhp-9082,上海)。
[0264]
1.3实验过程
[0265]
1).取对数期生长的肝癌细胞，弃去旧培养基，用pbs清洗两遍，弃去pbs；
[0266]
2).用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
[0267]
3)用含10％fbs的dmem完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μl细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1
×
104/ml，接种在96孔板上，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
[0268]
4).吸去培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μl，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育48h；
[0269]
5).吸去培养基，加入配好的mtt溶液(1mg/ml)，每孔加入100μl，培养箱中孵育4h；
[0270]
6).吸去mtt溶液，加入dmso，每孔加入100μl，培养箱中孵育10min；
[0271]
7).使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝(阴性－实验组)/(阴性－空白组)
×
100％计算细胞抑制率，并用统计软件graphpad prism 5计算ic
50
，实验重复3次。
[0272]
2.结果
[0273]
化合物1-20对三株肝癌细胞(hepg2,sk-hep-1和huh7)的细胞毒活性如表6所示，对于hepg2细胞,化合物2,4,5,13,16和17具有较强的细胞毒活性其ic
50
值分别为5.4,5.7,14.5,14.5,9.7和13.7μm,较阳性药物索拉非尼更优；化合物3和6-8亦表现出一定的细胞毒活性，其ic
50
值分别为14.9,14.8,19.4和14.9μm，与阳性药物索拉非尼相当。
[0274]
对于huh7细胞,化合物2,4,11和13具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为8.2,4.3,13.1和12.2μm,与阳性药物索拉非尼相当。
[0275]
对于sk-hep-1细胞,化合物2,3,4,和5具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为13.4,17.2,8.4,和13.6μm,优于阳性药物索拉非尼。
[0276]
表6.化合物1-20对三株肝癌细胞的细胞毒活性结果
[0277][0278]a数值表示为ic
50
±
sd
[0279]
3.结论
[0280]
实验结果显示，化合物1-20对三株肝癌细胞(hepg2,sk-hep-1和huh7)的细胞毒活性如表6所示，对于hepg2细胞,化合物2,4,5,13,16和17具有较强的细胞毒活性其ic
50
值分别为5.4,5.7,14.5,14.5,9.7和13.7μm,较阳性药物索拉非尼更优；化合物3和6-8亦表现出一定的细胞毒活性，其ic
50
值分别为14.9,14.8,19.4和14.9μm，与阳性药物索拉非尼相当。对于huh7细胞,化合物2,4,11和13具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为8.2,4.3,13.1和12.2μm,与阳性药物索拉非尼相当。对于sk-hep-1细胞,化合物2,3,4,和5具有较强的细胞毒活性，其ic
50
值分别为13.4,17.2,8.4,和13.6μm,优于阳性药物索拉非尼。以上结果表明牛尾蒿中分离得到的化合物1-20可作为药物用于肝癌相关的疾病。
[0281]
制剂实施例：
[0282]
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本制剂实施例仅体现本发明所述化合物1-20中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
[0283]
1.将本发明化合物1-20中的至少一种，用dmso溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/ml。
[0284]
2.将本发明化合物1-20中的至少一种，用dmso溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
[0285]
3.将本发明化合物1-20中的至少一种，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
[0286]
4.将本发明化合物1-20中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0287]
5.将本发明化合物1-20中的至少一种，按常规口服液制备方法制成口服液。
[0288]
6.将本发明化合物1-20中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
[0289]
7.将本发明化合物1-20中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋
形剂，制成颗粒剂。
[0290]
由以上实施例可知，本发明提供了一种牛尾蒿中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的牛尾蒿内酯，主要包括20种新颖结构的化合物，这些化合物对肝癌细胞具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。
[0291]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.结构式(i)所示的化合物牛尾蒿内酯a-t(1-20)，2.权利要求1所述的式(i)化合物牛尾蒿内酯a-t(1-20)的制备方法，该方法包括以下步骤：取牛尾蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，随后用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚以v/v计，2:98,5:95,10:90,20:80,30:70,50:50进行梯度洗脱得到7个流分fr.ad-1～fr.ad-7；fr.ad-4经经中压mci chp 20p柱层析，用水-甲醇70:30,50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到4个组分fr.ad-4-1-fr.ad-4-4.fr.ad-4-3经硅胶柱层析，乙酸乙酯-氯仿5:95至25:75梯度洗脱得到3个流分fr.ad-4-3-1～fr.ad-4-3-3；fr.ad-4-3-1经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物1和2；fr.ad-4-3-2经sephadex lh-20和半制备hplc，得到化合物3和6；fr.ad-4-3-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物4,5,7和8；fr.ad-5经经中压c18柱层析，用水-甲醇50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到3个组分fr.ad-5-1-fr.ad-5-3.fr.ad-5-1经硅胶柱层析，丙酮-石油醚10:90至30:70洗脱得到4个流分fr.ad-5-1-1～fr.ad-5-1-4；fr.ad-5-1-1经硅胶柱层析得到化合物9和11；fr.ad-5-1-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物10,12,和14；fr.ad-5-1-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物13,15,和18；fr.ad-5-1-4经硅
胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物16和17；fr.ad-5-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物19和20。3.权利要求1所述的式(i)化合物牛尾蒿内酯a-t(1-20)在制备抗肝癌药物中的应用。4.包括权利要求1所述的式(i)化合物牛尾蒿内酯a-t(1-20)的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂的药物组合物。5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：先制备式(i)化合物牛尾蒿内酯a-t(1-20)：取牛尾蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，随后用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚以v/v计，2:98,5:95,10:90,20:80,30:70,50:50进行梯度洗脱得到7个流分fr.ad-1～fr.ad-7；fr.ad-4经经中压mci chp 20p柱层析，用水-甲醇70:30,50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到4个组分fr.ad-4-1-fr.ad-4-4.fr.ad-4-3经硅胶柱层析，乙酸乙酯-氯仿5:95至25:75梯度洗脱得到3个流分fr.ad-4-3-1～fr.ad-4-3-3；fr.ad-4-3-1经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物1和2；fr.ad-4-3-2经sephadex lh-20和半制备hplc，得到化合物3和6；fr.ad-4-3-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物4,5,7和8；fr.ad-5经经中压c18柱层析，用水-甲醇50:50,30:70,10:90梯度洗脱，得到3个组分fr.ad-5-1-fr.ad-5-3.fr.ad-5-1经硅胶柱层析，丙酮-石油醚10:90至30:70洗脱得到4个流分fr.ad-5-1-1～fr.ad-5-1-4；fr.ad-5-1-1经硅胶柱层析得到化合物9和11；fr.ad-5-1-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物10,12,和14；fr.ad-5-1-3经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc，得到化合物13,15,和18；fr.ad-5-1-4经硅胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物16和17；fr.ad-5-2经sephadex lh-20凝胶柱层析和半制备hplc纯化，得到化合物19和20；然后，将上述化合物1-20至少一种，加入药学上可接受的载体或赋型剂。

技术总结
本发明提供结构式(I)所示20个倍半萜二聚体类化合物，牛尾蒿内酯A


技术研发人员：陈纪军 高振 李天泽 马云保 马文静 耿长安 何小凤 黄晓燕 胡敬 张雪梅
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2022/5/25