构建严格厌氧沙门氏菌的方法，所构建的严格厌氧沙门氏菌及其应用

hypoxia targeting with tumor suppression by creating an“obligate”anaerobic salmonella typhimurium strain研究论文，论文中表述的构建严格厌氧沙门氏菌菌株方案。该现有技术构建鼠伤寒沙门氏菌sl7207敲除关键基因asd菌株:asd基因缺失会影响细菌细胞壁生成，在lb培养基中加入asd基因下游中间代谢产物dap(二氨基庚二酸)可以使细菌正常合成细胞壁。并在此基础上构建厌氧菌株yb1:在sl7207敲除asd菌株的基因组上插入cm-pept-asd-soda受厌氧调控的基因回路(基因回路插入到原asd基因位置)。fnr是受到氧气调控的转录调控因子。在厌氧条件下，fnr处于激活状态可以调控正向启动子pept使asd基因发生转录，使细菌可以产生完整细胞壁。反向启动子psoda可以阻断正向启动子在有氧条件下产生asd基因产物的泄漏。该设计可以使yb1菌株只能在厌氧条件下生长，而有氧条件下必须在培养基中加入dap才可以生长。
6.bin yu等对其yb1菌株在不同氧气条件下生存能力表征：有氧条件下，yb1在lb(dap-)培养基中无法生长，lb(dap+)培养基中可以生长；厌氧条件下，yb1在lb(dap+)、lb(dap-)培养基中均可以生长。yb1菌株在荷瘤小鼠体内分布与治疗肿瘤效果表征：荷瘤小鼠尾静脉注射yb1菌株后26天，该菌株在正常组织器官均被清除，肿瘤组织还有细菌存在(由于肿瘤组织氧气浓度很低和处于免疫抑制环境)。与pbs组比较，yb1菌株具有抑制肿瘤生长能力。
7.但bin yu等的yb1菌株在正常组织器官内完全清除需要多达26天，耗时长、安全性低；与pbs组比较，给荷瘤小鼠尾静脉注射yb1后，小鼠体重有显著性降低(大于5％)。作为小鼠健康与否重要评价指标，体重明显降低表明该菌对小鼠有较强的毒性作用。
8.本领域还需要一种构建方法，该方法能够产生在更短时间内能够容易被正常组织器官清除的菌株，减弱因细菌在体内长期存留而对荷瘤小鼠产生的毒副作用，使改造菌株更加安全可靠，且不影响细菌治疗肿瘤效果。


技术实现要素：

9.为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供构建严格厌氧沙门氏菌的方法，利用该方法构建的严格厌氧沙门氏菌及其在肿瘤治疗中的应用。
10.在本发明的一个方面，一种通过低氧或者严格厌氧诱导表达必需基因的回路使兼性厌氧细菌变成严格厌氧菌的方法，并且所述的严格厌氧菌应用于肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
11.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述兼性厌氧细菌菌属包括：肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌。
12.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述兼性厌氧细菌是沙门氏菌属物种(salmonella)。
13.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述兼性厌氧沙门氏菌菌株包括来源于人、鸡、狗、牛等。
14.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述严格厌养菌，体外有氧条件下培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸(别名：2，6-二氨基蒲桃酸；2，6-diaminopimelic acid)及其类似物。
15.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述必需基因是dapa或dape但不局限于该基因，还包括选自dapb、dapd、argd、dapf、mure、murf或lysa的一种或多种。
16.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述严格厌氧调控基因回路由厌氧激活的启动子和必需基因组成。
17.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述低氧或者严格厌氧诱导表达调节的必需基因的基因回路存在于染色体或者其他质粒载体。
18.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述厌氧激活的启动子选自pept、fnr-sp、hip1、i141018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1和ysgap。
19.在本发明的一个方面，在上述方法中，调控启动子的转录调控因子是fnr或arca。其中fnr-sp启动子受转录调控因子fnr调控，ptet-arca启动子受转录调控因子arca调控
20.在本发明的一个方面，在上述方法中，所述肿瘤癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。
21.在本发明的一个方面，提供了使用厌氧回路调控的细菌治疗癌症的方法，所述细菌包含严格低氧调控必需基因表达。
22.在本发明的一个方面，所述治疗方法还包括：与其他治疗癌症疗法联合应用。
23.在本发明的一个方面，所述治疗方法中，所述细菌是伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。
24.在本发明的一个方面，所述治疗方法中，所述兼性厌氧细菌是鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)。
25.在本发明的一个方面，所述治疗方法中，所述兼性厌氧沙门氏菌菌株包括来源于人、鸡、狗、牛等。
26.在本发明的一个方面，所述治疗方法中，所述兼性厌氧细菌菌属包括：肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌等。
27.在本发明的一个方面，所述治疗方法中，所述其他癌症治疗方法联合应用包括：(a)厌氧菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)厌氧菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)厌氧菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼等；(d)厌氧菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)厌氧菌株的细菌疗法联合中医中药治疗。
28.在本发明的一个方面，提供了一种载体，其是包含以下元件的原核细胞：(a)低氧或者严格厌氧激活启动子；和(b)受到(a)中启动子调控的必需基因；其中，(a)中的启动子
存在与厌氧激活的转录调控因子结合位点。
29.在本发明的一个方面，在载体中，所述厌氧激活启动子选自pept、fnr-sp、hip1、i141018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1和ysgap。
30.在本发明的一个方面，在载体中，所述必需基因是dapa或dape；和/或，其中所述转录调控因子是fnr、arca。其中，fnr-sp启动子受转录调控因子fnr调控；ptet-arca启动子受转录调控因子arca调控
31.在本发明的一个方面，在载体中，体外有氧条件下培养需要在培养基中添加2,6-二氨基庚二酸。
32.在本发明的一个方面，提供了一种严格厌氧沙门氏菌表达药物或者作为载体携载药物中的应用，所述药物用于治疗癌症。
33.在本发明的一个方面，在所述应用中，所述药物包括：(a)表达具有癌症治疗效果的蛋白物质或者多肽物质；(b)表达具有癌症治疗效果的rna；(c)作为载体携载经修饰的rna药物。
附图说明
34.图1是r1074菌株构建线路图。
35.图2a-图2g是9株菌株(sl7207(δdapa)-启动子-bba_b0033-dapa)的构建电泳图。
36.图3a、图3b和图3c是9株菌株体外实验，图3a分别是9种菌株(如照片左侧菌株缩写所示)在有氧条件培养24-144h的照片，图3b分别是9种菌株(如照片左侧菌株缩写所示)在厌氧条件培养24h的照片，图3c分别是9种菌株(如纵坐标菌株缩写所示)在厌氧条件下培养24h，检测od600的数值。
37.图4a-图4e是所构建的9株菌株的体内实验结果。
38.图5中(a)-(e)是5株菌株(sl7207(δdape)-启动子(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape)构建电泳图。
39.图6a、图6b和图6c是5株菌株体外实验，图6a分别是5种菌株(如照片左侧菌株缩写所示)在有氧条件培养24-72h的照片，图6b分别是5种菌株(如照片左侧菌株缩写所示)在厌氧培养24h的图片，图6c分别是5种菌株(如照片左侧菌株缩写所示)在厌氧条件下培养24h，检测od600的数值。
40.图7是sl7207(δdape)-r1074-bba_b0033-dape(简称：r1074-1)菌株体内实验。
具体实施方式
41.尽管可以对本发明进行各种修改并且本发明可以具有各种形式，但是下面将详细说明和解释具体实例。然而，应当理解的是，这些并不旨在将本发明限制于特定的公开内容，并且本发明包括其所有修改、等同物或替代物而不脱离本发明的精神和技术范围。
42.在下文中，将更详细地解释根据本发明具体实施方式的构建严格厌氧沙门氏菌方法，利用该方法构建的严格厌氧沙门氏菌及其在肿瘤治疗中的应用。
43.在本发明的一个或多个实施方式中，本发明的载体是包含以下元件的原核细胞：(a)低氧或者严格厌氧激活启动子；和(b)受到(a)中启动子调控的必需基因，其中(a)中的启动子存在与厌氧激活的转录调控因子结合位点。
44.在本发明的一个或多个实施方式中，(a)低氧或者严格厌氧激活启动子例如可以为fnr-sp、hip1，i14018，ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1、ysgap。
45.在本发明的一个或多个实施方式中，所述转录调控因子是fnr或arca。
46.在本发明的一个或多个实施方式中，所述(b)受到(a)中启动子调控的必需基因例如可以为dapa、dapb、dapd、argd、dape、dapf、mure、murf、lysa等；特别是dapa或dape。
47.本发明提供了一种通过低氧或者严格厌氧诱导表达必需基因的回路使兼性厌氧细菌变成严格厌氧菌的方法。
48.在本发明的一个或多个实施方式中，所述严格厌氧调控基因回路由厌氧激活的启动子和必需基因组成。
49.在本发明的一个或多个实施方式中，厌氧激活的启动子例如可以为pept、fnr-sp、hip1、i14018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1、ysgap。
50.在本发明的一个或多个实施方式中，所述必需基因例如可以为dapa、dapb、dapd、argd、dape、dapf、mure、murf、lysa等；特别是dapa或dape。
51.当必需基因为dapa或dape基因时，本发明的载体进行有氧条件培养时需要在培养基中额外添加2,6-二氨基庚二酸(别名：2,6-二氨基蒲桃酸；2,6-diaminopimelic acid)或其类似物。
52.本发明所述的严格厌氧菌应用于体内肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
53.所述兼性厌氧菌可以为来自肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌等中任一个细菌菌属中的任意菌种。
54.所述兼性厌氧沙门氏菌菌株来源不限，只要是兼性厌氧即可，例如包括来源于人、鸡、狗、牛等的兼性厌氧沙门氏菌菌株。
55.所述兼性厌氧细菌是鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)。
56.本发明还提供了利用本发明的在有氧与无氧条件下均无法生长菌株治疗癌症的细菌疗法。
57.所述癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。
58.在本发明的一个或多个实施方式中，本发明的作为原核细胞的载体，或通过本发明的方法获得的严格厌氧菌可以作为细菌疗法用于抗肿瘤或癌症治疗。
59.在本发明的一个或多个实施方式中，本发明的细菌疗法可以与其他癌症治疗方法联合应用。
60.在本发明的一个或多个实施方式中，细菌疗法与其他癌症治疗方法的联合应用包括，例如：(a)厌氧菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)厌氧菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)厌氧菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，
植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼等；(d)厌氧菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)厌氧菌株的细菌疗法联合中医中药治疗。
61.本发明的作为原核细胞的载体，或通过本发明的方法获得的严格厌氧菌还可以用于在体外诱导表达药物或者作为载体携载药物，以进行癌症治疗。
62.在本发明的实施方式中，可以携带在所述载体中的药物包括：(a)表达具有癌症治疗效果的蛋白物质或者多肽物质；(b)表达具有癌症治疗效果的rna；(c)作为载体携载经修饰的rna药物。
63.本发明优点：
64.(1)改造菌株的厌氧调控模块更为简单，调控系统更为严谨，有氧条件下不存在本底泄漏问题；
65.(2)改造菌株在正常组织器官只需要很短时间内就会被完全清除干净；
66.(3)改造菌株在治疗荷瘤小鼠过程中，几乎对小鼠体重无影响，毒副作用比较小，安全性得到了提高。
67.菌株构建方案如图1和图5所示：在本实验室已经构建好的sl7207(δdapa)和sl7207(δdape)基础上，将fnr-sp、hip1、i14018、pept、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1、ysgap-bba_b0033-dapa厌氧基因回路整合到sl7207(δdapa)基因组(原dapa位置)；将fnr-sp、hip1、pept、r1074、ysgap-bba_b0033-dape厌氧基因回路整合到sl7207(δdape)基因组(原dapa位置)。dapa和dape基因是赖氨酸代谢通路上关键基因，敲除这两个基因中的其中任一个基因细菌无法形成正常细胞壁，细菌内外渗透压不平衡，细菌破裂无法存活。上述启动子是厌氧激活启动子，在厌氧或者低氧条件下上述启动子可以起始dapa或dape基因转录，从而使下游dap蛋白生成dap。细菌可以形成完整细胞壁。有氧条件下，9个启动子-bba_b0033-dapa或5个启动子-bba_b0033-dape基因回路处于失活状态，细菌无法生成完整细胞壁。有氧条件下培养sl7207(δdapa)-promoters(9个启动子，如表1所示)-bba_b0033-dapa菌株或sl7207(δdape)-promoters(5个启动子)-bba_b0033-dape菌株，需要添加dap(二氨基庚二酸)，可以弥补dapa或dape的基因缺失导致细菌无法形成完整细胞壁。
68.表1本发明采用的启动子
69.启动子名称序列fnr-sp5’gatccgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttgcaggtgaatgcaacgtcaagcgat 3’hip15’gatcggataaaagtgacctgacgcaatatttgtcttttcttgcttaataatgttgtca 3’i140185’gatctgtaagtttatacataggcgagtactctgttatgg 3’pept5’gatcgcaggggtaaaagtgacctgacgcaatatttgtcttttcttgcttcttaataatgttgtcacaaaaagtgagggtgactacatgg 3’ptet-arca5’gatcgttaataaaatgttattgacagttaataaaatgttatactgagc 3’ptet-fnr5’gatcaaaattgatctgaatcaatattttgacaaaaattgatctgaatcaatatttactgagc 3’r10745’gatcttaaatttcctctcgtcaggccggaataactccctataatgcgccaccacactgatagtgctagtgtagatcac 3’ssbp15’gatcaaccgaggtcacaacatagtaaaagcgctattggtaatggtacaatcgcgcgtttacacttattcagaacgatttttttcaggag 3’ysgap5’gatctcagaagaagcaaaaagacactttaccgaagggtttaacattttttcgtgatactcatcaccatgacgcaaatgcgttgcataaa 3’70.表2本发明克隆所用的引物
[0071][0072][0073]
实施例：
[0074]
实施例1：构建9株严格厌氧的菌株(sl7207(δdapa)-promoters-bba_b0033-dapa)(以下实验中所用引物如表2所示)
[0075]
1.构建psc101-bba_b0033-dapa质粒
[0076]
a.以psc101-fbfp-knar-loxp+启动子质粒为模板，以载体正向引物、载体反向引物为引物，pcr获得线性化载体片段1；
[0077]
b.以沙门氏菌sl7207基因组为模板，dapa基因正向引物、dapa基因反向引物为引物，pcr获得目的片段1；
[0078]
c.一步克隆方法获得psc101-bba_b0033-dapa质粒。
[0079]
2.构建psc101-r1074-bba_b0033-dapa质粒
[0080]
a.psc101-bba_b0033-dapa质粒通过bsai酶切，获得线性化载体片段2；
[0081]
b.引物退火方法获得r1074启动子片段；
[0082]
c.连接酶连接获得psc101-r1074-bba_b0033-dapa质粒。
[0083]
3.构建sl7207(δdapa)-r1074-bba_b0033-dapa菌株
[0084]
a.以psc101-r1074-bba_b0033-dapa质粒为模板，以dapa同源重组正向引物、dapa同源重组反向引物为引物，pcr获得同源重组片段2；
[0085]
b.通过λ-red同源重组方法将同源重组片段2整合到sl7207(δdapa)的原dapa基因位置，获得sl7207(δdapa)-r1074-bba_b0033-dapa目标菌株。
[0086]
其他8株目标菌株(如下)构建方法与sl7207(δdapa)-r1074-bba_b0033-dapa菌
株基本一致，需要将步骤2中b引物退火片段分别置换为hip1、i14018、ptet-fnr、pept、ptet-arca、ssbp1、fnr-sp、ysgap启动子片段。
[0087]
1.sl7207(δdapa)-fnr-sp-bba_b0033-dapa；
[0088]
2.sl7207(δdapa)-hip1-bba_b0033-dapa；
[0089]
3.sl7207(δdapa)-i14018-bba_b0033-dapa；
[0090]
4.sl7207(δdapa)-pept-bba_b0033-dapa；
[0091]
5.sl7207(δdapa)-ptet-arca-bba_b0033-dapa；
[0092]
6.sl7207(δdapa)-ptet-fnr-bba_b0033-dapa；
[0093]
7.sl7207(δdapa)-ssbp1-bba_b0033-dapa；
[0094]
8.sl7207(δdapa)-ysgap-bba_b0033-dapa。
[0095]
9株菌株分别简写成(fnr-sp；hip1；i14018；pept；ptet-arca；ptet-fnr；r1074；ssbp1；ysgap)，电泳结果如图2a-图2g所示。
[0096]
实施例2：9株菌株体外表征
[0097]
有氧条件下表征：挑取1个单克隆加入到含有卡那霉素的lb(dap+)培养基中；挑取3个克隆分别加入到含有卡那霉素的lb(dap-)培养基中。空气摇床中培养(37℃，220rpm)一段时间。
[0098]
厌氧条件下表征：挑取3个单克隆加入到含有卡那霉素的lb(dap+)培养基中。空气摇床中(37℃，220rpm)过夜培养。将过夜培养的菌液放入厌氧培养箱，以1：100比例进行转接。取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的lb(dap+)培养基中；取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的lb(dap-)培养基中，3个重复。测量转接后样品的初始od600值。厌氧箱中，37℃，静置培养24h。测量培养24h后样品的od600值。
[0099]
实验结果(如图3a-图3c)：
[0100]
(1)有氧条件下：9株菌株在lb(dap+)培养基中培养144h，这些菌株可以正常生长。9株菌株在lb(dap-)培养基中培养144h，这些菌株无法生长。
[0101]
(2)厌氧条件下：9株菌株在lb(dap+)培养基与lb(dap-)培养基中培养24h。这些菌株在lb(dap+)培养基与lb(dap-)培养基中均可以生长。
[0102]
实验结论：通过对该菌株在有氧与厌氧条件下的测试表明，成功将兼性厌氧菌株sl7207改造成为严格厌氧菌株。
[0103]
实施例3：9株菌株体内表征
[0104]
c57bl/6小鼠皮下接种1
×
106小鼠膀胱癌细胞(mb49)/只小鼠，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型。实验分为pbs组、sl7207菌株组、fnr-sp组、hip1组、i14018组、pept组、ptet-arca组、ptet-fnr组、r1074组、ssbp1组、ysgap组。尾静脉接种1
×
107个本发明的各种细菌/只小鼠。检测6天内细菌在荷瘤小鼠正常组织器官与肿瘤里分布、肿瘤体积变化、小鼠体重变化、小鼠生存率。实验结果(如图4a-图4e)：
[0105]
(1)细菌在荷瘤小鼠体内分布(图4a-图4e，左侧列)：fnr-sp组该菌株在体内清除速度比较慢，正常组织与肿瘤组织具有大量细菌；hip1组、i14018组、r1074组、ssbp1组菌株在体内清除比较快。在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、血液里细菌量比较少，脾脏和肿瘤组织存在细菌有104(cfu/g)。pept组和ysgap组细菌只在肝脏与脾脏有少量残留，其他组织器官与肿瘤均无细菌。ptet-arca组细菌只在心脏、肝脏、肺脏存在少量细菌，在脾脏、肾脏、血液和肿
瘤组织均无细菌。ptet-fnr组细菌只存在肝脏与肿瘤组织，其他脏器均无细菌。
[0106]
(2)肿瘤体积变化(图4a-图4e，中间列)：与pbs组比较，9株菌株组别在6天内均具有抑制肿瘤生长作用。
[0107]
(3)小鼠体重变化(图4a-图4e，右侧列)：与sl7207组比较，9株菌株组别小鼠体重下降比较少，略低于pbs组。
[0108]
(4)小鼠生存率：sl7207组小鼠6天内全部死亡。实验周期内9株菌株组别与pbs组别小鼠无死亡。
[0109]
实验结论：6天内，9株改造菌株在体内正常组织器官与肿瘤内分布不完全相同。与sl7207组比较，本发明的9种细菌在体内被大量清除。本发明的9株菌株组别肿瘤体积均减小。9株菌株的小鼠在实验周期内体重略微低于pbs组，并且无死亡。说明与现有技术相比，本发明的9株菌株安全性得到了提高，同时具有抑制肿瘤作用。
[0110]
实施例4：构建5株严格厌氧的菌株(sl7207(δdape)-promoters-bba_b0033-dape)
[0111]
1.构建psc101-promoters-bba_b0033-dape质粒
[0112]
a.以psc101-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dapa质粒为模板，以载体正向引物3、载体反向引物4为引物，pcr获得5个线性化载体片段(结果如图5中(a))；
[0113]
b.以沙门氏菌sl7207基因组为模板，dape基因正向引物、dape基因反向引物为引物，pcr获得目的片段2(结果如图5中(a))；
[0114]
c.一步克隆方法获得psc101-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape质粒(结果如图5中(b))。
[0115]
3.构建sl7207(δdape)-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape菌株
[0116]
a.以psc101-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape质粒为模板，以dape同源重组正向引物、dape同源重组反向引物为引物，pcr获得5个同源重组片段(结果如图5中(c))；
[0117]
b.通过λ-red同源重组方法将5个同源重组片段整合到sl7207(δdape)的原dape基因位置，获得sl7207(δdape)-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape目标菌株(结果如5中(d)、(e))。
[0118]
5株菌株分别简写成(r1074-1、ysgap-1、fnr-sp-1、pept-1、hip1-1)。
[0119]
实施例5：5株严格厌氧菌株(sl7207(δdape)-promoters(r1074、ysgap、fnr-sp、pept、hip1)-bba_b0033-dape)体外表征
[0120]
有氧条件下表征：挑取3个克隆加入到含有壮观霉素的lb(dap+)培养基中，空气摇床(37℃，220rpm)过夜培养。将过夜培养菌液以1：100比例进行转接。取20μl菌液加入到2ml含有壮观霉素的lb(dap+)培养基中；取20μl菌液加入到2ml含有壮观霉素的lb(dap-)培养基中，3个重复。在空气摇床(37℃，220rpm)中培养72h，观察菌株生长情况。
[0121]
厌氧条件下表征：挑取3个单克隆加入到含有壮观霉素的lb(dap+)培养基中，空气摇床中(37℃，220rpm)过夜培养。将过夜培养的菌液放入厌氧培养箱，以1：100比例进行转接。取20μl菌液加入到2ml含有壮观霉素的lb(dap+)培养基中；取20μl菌液加入到2ml含有
壮观霉素的lb(dap-)培养基中，3个重复。厌氧箱中(37℃)，静置培养24h。测量培养24h后样品的od600值。
[0122]
实验结果(如图6a、图6b、图6c)：
[0123]
(1)有氧条件下：5株菌株在lb(dap+)培养基中培养72h，这些菌株可以正常生长。5株菌株在lb(dap-)培养基中培养72h，这些菌株无法生长。
[0124]
(2)厌氧条件下：5株菌株在lb(dap+)培养基与lb(dap-)培养基中培养24h。这些菌株在lb(dap+)培养基与lb(dap-)培养基中均可以生长。
[0125]
实验结论：通过对5株菌株在有氧与厌氧条件下的测试表明，成功将兼性厌氧菌株sl7207改造成为严格厌氧菌株。
[0126]
实施例6：r1074-1菌株体内表征
[0127]
c57bl/6小鼠皮下接种1
×
106小鼠膀胱癌细胞(mb49)/只小鼠，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型。实验分为pbs组、r1074-1组。尾静脉接种1
×
107个本发明的细菌/只小鼠。检测14天内肿瘤体积变化、小鼠体重变化、小鼠生存率。实验结果(如图7)：
[0128]
(1)肿瘤体积变化(图7中a)：与pbs组比较，r1074-1菌株组别在实验周期内具有抑制肿瘤生长作用。
[0129]
(2)小鼠体重变化(图7中b)：与pbs组比较，r1074-1菌株组别在试验周期内小鼠体重无显著性差异
[0130]
(3)小鼠生存率:实验周期内，pbs组与r1074-1菌株组别小鼠均存活。
[0131]
实验结论：在实验周期内，r1074-1菌株可以抑制小鼠肿瘤生长；同时与pbs组比较，小鼠体重无显著性差异和小鼠均存活，说明该菌株比较安全。

技术特征：
1.一种通过低氧或者严格厌氧诱导表达必需基因的回路使兼性厌氧细菌变成严格厌氧菌的方法，并且所述的严格厌氧菌应用于肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述兼性厌氧细菌菌属包括：肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌，优选的是所述兼性厌氧细菌是沙门氏菌属物种(salmonella)，优选的是所述兼性厌氧沙门氏菌菌株包括来源于人、鸡、狗、牛；和/或其中所述严格厌养菌，体外有氧条件下培养时培养基中需要额外添加2，6-二氨基庚二酸(别名：2，6-二氨基蒲桃酸；2，6-diaminopimelic acid)或其类似物；和/或其中所述必需基因包括dapa或dape但不局限于该基因，还包括选自dapb、dapd、argd、dapf、mure、murf或lysa的一种或多种；和/或其中所述严格厌氧调控基因回路由厌氧激活的启动子和必需基因组成；和/或其中所述低氧或者严格厌氧诱导表达调节的必需基因的基因回路存在于染色体或者其他质粒载体。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述厌氧激活的启动子选自pept、fnr-sp、hip1、i141018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1和ysgap。4.一种使用厌氧回路调控的细菌治疗癌症的方法，所述细菌包含严格低氧调控必需基因表达；和/或优选的是，所述方法还包括：与其他治疗癌症疗法联合应用；和/或优选的是，其中所述其他癌症治疗方法联合应用包括：(a)厌氧菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)厌氧菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)厌氧菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼等；(d)厌氧菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)厌氧菌株的细菌疗法联合中医中药治疗；和/或优选的是，其中所述肿瘤癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。5.一种载体，其是包含以下元件的原核细胞：(a)低氧或者严格厌氧激活启动子；和(b)受到(a)中启动子调控的必需基因；其中，(a)中的启动子存在与厌氧激活的转录调控因子结合位点。6.根据权利要求5所述的载体，其中所述厌氧激活启动子选自pept、fnr-sp、hip1、i141018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1和ysgap。7.根据权利要求5所述的载体，其中所述必需基因所述必需基因包括dapa或dape但不
局限于该基因，还包括选自dapb、dapd、argd、dapf、mure、murf或lysa的一种或多种。8.根据权利要求5所述的载体，体外有氧条件下培养需要在培养基中添加2,6-二氨基庚二酸。9.一种严格厌氧沙门氏菌在表达药物或者作为载体携载药物中的应用，所述药物用于治疗癌症。10.根据权利要求9所述的严格厌氧沙门氏菌在表达药物或者作为载体携载药物中的应用，其中所述药物包括：(a)表达具有癌症治疗效果的蛋白物质或者多肽物质；(b)表达具有癌症治疗效果的rna；(c)作为载体携载经修饰的rna药物。

技术总结
本发明涉及构建严格厌氧沙门氏菌方法，利用该方法构建的严格厌氧沙门氏菌及其在肿瘤治疗中的应用。治疗中的应用。治疗中的应用。


技术研发人员：刘陈立 王作伟 盛方芊 曾正阳 卢伟琪 郭旋
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：2020.11.05
技术公布日：2022/5/25