大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。


背景技术：

2.鼠李糖脂(rhamnolipids)是一类糖脂类的生物表面活性剂，其结构由亲水基团和疏水基团两部分构成，其中亲水基团由1-2分子鼠李糖基组成，疏水基团由1-2个β-羟基脂肪酸单元组成。与传统的化学表面活性剂相比，鼠李糖脂不但具有更优异的表面活性和稳定性，还具有无毒、无污染、能生物降解、生物相容性好、良好的抗菌活性和促进伤口愈合等优点，从而在生物医药、食品、化妆品、农业、石油开采以及环境污染修复等众多领域展示了其独特的应用前景。随着社会的发展和人们环保意识的增强，生物表面活性剂将有更加广阔的前景，有望成为化学合成表面活性剂的替代品。
3.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)体内含有合成鼠李糖脂的完整代谢途径，也是目前用于合成鼠李糖脂最多的宿主。然而，目前鼠李糖脂的合成存在发酵产量低和分离成本高的问题，限制了它的工业化应用。大多数的研究，采用基因工程改造和发酵工艺优化(如培养条件、培养基成分、过程控制等)两种途径提升鼠李糖脂产量。发酵工艺优化虽然能够显著提升鼠李糖脂的产量，但转化效率、发酵底物选择、产物类型等重要生产指标仍受菌种遗传的背景限制。因此，利用基因工程开发更高效的鼠李糖脂合成菌株受到了越来越多的关注。
4.在一定范围内，细胞工厂产量与关键合成酶的表达量直接相关，通过基因表达层面的优化提高合成酶的表达量是提高鼠李糖脂产量的一种有效策略。鼠李糖脂合成基因的过表达需要有载体的参与，但目前广泛适用于大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体仅有pak1900。大多数研究采用克隆完整的鼠李糖基转移酶操纵子基因(rhlab)，并将其连接到穿梭克隆载体的方法，实现基因的过表达。然而，该方法存在天然启动子受到rhlr和rhli等全局转录因子调控的问题，使得鼠李糖脂的产量提升并不理想。此外，zhao等通过重叠延伸pcr技术将oprl基因的组成型启动子与rhlab基因连接，获得pbbrpoprab表达载体；xie等利用red/et dna重组技术将3种不同强度的组成型启动子(p
apra
、p
tac
和p
rhab
)替换rhlab基因的原始启动子，获得相应的表达载体。上述两种表达载体的构建方法步骤繁琐，更换启动子需要进行多次pcr，这不仅增加了pcr过程中引入突变的风险，也提高了克隆成本，降低了克隆的成功率，无法满足多样化、高通量的克隆需求。构建适用于铜绿假单胞菌的穿梭表达载体对于快速实现靶基因的过表达，提高鼠李糖脂的产量是至关重要的。
5.因此基于上述技术问题需要设计一种新的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，包括：
8.抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；
9.所述表达区片段包括：启动子、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子t0序列；
10.所述启动子及终止子t0序列前后带有酶切位点，以及
11.所述启动子包括rbs序列。
12.进一步，所述启动子前后带有hind iii和bamh i酶切位点。
13.进一步，所述终止子t0序列前后带有xho i和ecor i酶切位点。
14.进一步，所述rbs序列和终止子t0序列之间具有多克隆位点区域。
15.进一步，所述启动子为p
syn8
，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.进一步，所述启动子为p
rpsj
，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
17.进一步，所述表达区片段核苷酸序列如seq id no.3所示。
18.进一步，在表达区片段的多克隆位点插入mscarlet基因，构成含有荧光蛋白基因的表达载体，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
19.进一步，在表达区片段的多克隆位点插入任意目的基因，构成表达相应目的基因的表达载体。
20.另一方面，本发明还提供一种上述大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体的构建方法，包括：
21.以克隆载体pucp18作为骨架载体，酶切除去原有多克隆位点；
22.通过基因合成获得表达区片段p-mcs-t；
23.将表达区片段p-mcs-t插入经酶切修饰后的骨架载体pucp18的多克隆位点之间；
24.将目的基因或荧光指示蛋白基因插入上述表达区片段的多克隆位点之间。
25.本发明的有益效果是，本发明中表达区片段包括：启动子(含rbs序列)、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子t0序列；所述启动子(含rbs序列)及终止子t0序列前后带有酶切位点，使用组成型启动子p
syn8
或p
rpsj
，保证目的基因在宿主中高效持续地转录，同时避免使用昂贵的诱导剂；引入通过热力学计算获得的含有强翻译起始位点的rbs序列，保证目的基因在宿主中的高效表达。启动子元件和终止子元件前后带有酶切位点，可通过简单的酶切、连接反应快速实现不同启动子或终止子元件的更换，步骤简单，极大地缩短了更换载体表达元件的时间，满足多样化、高通量的克隆需求，同时为启动子文库的快速构建提供了新的方案；并且本发明提供的构建穿梭表达载体的方法同样适用于其他细菌，例如兽疫链球菌，该细菌可以用来生产透明质酸。
26.本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
27.为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1是本发明设计合成的p-mcs-t表达区图谱；
30.图2是克隆载体pucp18的图谱；
31.图3是本发明构建pucp18e表达载体的菌落pcr图；
32.图4是本发明构建的穿梭表达载体pucp18e的图谱；
33.图5是本发明构建pucp18e-mscarlet表达载体的菌落pcr图；
34.图6是本发明构建的穿梭表达载体pucp18e-mscarlet的图谱；
35.图7是本发明构建pucp18e-p
rpsj-mscarlet表达载体的菌落pcr图；
36.图8是本发明构建的穿梭表达载体pucp18e-p
rpsj-mscarlet的图谱；
37.图9是本发明含pucp18e-mscarlet和pucp18e-p
rpsj-mscarlet载体的重组铜绿假单胞菌的荧光强度测定结果图。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本实施例提供了一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，包括：抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；所述表达区片段包括：启动子(含rbs序列)、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子t0序列；所述启动子(含rbs序列)及终止子t0序列前后带有酶切位点；在大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭克隆载体pucp18基础上构建的，使用组成型启动子p
syn8
或p
rpsj
，保证目的基因在宿主中高效持续地转录，同时避免使用昂贵的诱导剂；引入通过热力学计算获得的强翻译起始位点rbs序列，保证目的基因在宿主中的高效表达。大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体中的启动子元件和终止子元件前后带有酶切位点，可通过简单的酶切、连接反应快速实现不同启动子或终止子元件的更换，步骤简单，极大地缩短了更换载体表达元件的时间，满足多样化、高通量的克隆需求，同时为启动子文库的快速构建提供了新的方案；并且本实施例提供的构建穿梭表达载体的方法同样适用于其他细菌，例如兽疫链球菌，该细菌可以用来生产透明质酸。
40.在本实施例中，所述启动子(含rbs序列)前后带有hind iii和bamh i酶切位点。
41.在本实施例中，所述终止子t0序列前后带有xho i和ecor i酶切位点。
42.在本实施例中，所述启动子和终止子t0序列之间具有多克隆位点区域。
43.在本实施例中，所述启动子为p
syn8
，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
44.在本实施例中，所述表达区片段核苷酸序列如seq id no.3所示。
45.在本实施例中，在表达区片段的多克隆位点插入mscarlet基因，构成含有荧光蛋白基因的表达载体，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
46.在本实施例中，表达载体为将构建表达载体pucp18e-mscarlet的启动子p
syn8
更换为铜绿假单胞菌内源启动子p
rpsj
，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
47.在本实施例中，在表达区片段的多克隆位点插入任意目的基因，构成表达相应目的基因的表达载体。
48.在本实施例中，大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体具有seq id no.5所示的核苷酸序列。
49.在本实施例中，大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体含有红色荧光蛋白基因，用于指示本实施例穿梭表达载体携带的目的基因是否在宿主细胞中表达；大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体以红色荧光蛋白mscarlet基因作为报告基因，实现了目的基因表达的可视化，解决了铜绿假单胞菌中目的基因表达量低，不易通过sds-page检测的问题。
50.具体的实施例如下所示，大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pucp18e的构建；
51.设计并合成包含铜绿假单胞菌人工合成启动子p
syn8
(含rbs序列)、多克隆位区域以及噬菌体λ的转录终止子t0序列的基因表达区片段p-mcs-t。该基因表达区片段由上海亦欣生物科技有限公司合成，长度为289bp，核苷酸序列如seq id no.3所示，序列图谱如图1所示。
52.pcr扩增上述基因表达区片段p-mcs-t，pcr扩增反应体系(50μl)为模板1μl、上游引物2.5μl(10μm)、下游引物2.5μl(10μm)、2
×
phanta master mix高保真dna聚合酶0.5μl、超纯水32.5μl。引物序列如下：
53.上游引物pf1：taaaacgacggccagtgccaagcttagctcttgacaaggtcggaaaa
54.下游引物pr1：gctatgaccatgattacgaattcattctcaccaataaaaaacgcccgg
55.pcr程序：(1)94℃,10min；(2)30cycles:95℃,30s；55℃,30s；72℃,1min；(3)72℃,10min；(4)16℃,+∞。
56.采用上海捷瑞生物工程有限公司dna产物胶回收纯化试剂盒对上述扩增得到的表达区片段p-mcs-t进行纯化，等待后续连接，纯化步骤详见其说明书。
57.使用限制性内切酶hind iii和ecor i双酶切克隆载体pucp18，所述克隆载体购买自武汉淼灵生物科技有限公司，图谱见附图2。电泳回收线性化的pucp18载体片段。
58.将上述获得的线性化载体片段与基因表达区片段p-mcs-t采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的一步克隆法连接试剂盒进行连接，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，在羧苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，穿梭表达载体经pcr及测序鉴定，鉴定结果如图3，表明本发明大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体构建成功，命名为pucp18e。该穿梭表达载体全长4776bp，含有铜绿假单胞菌人工合成启动子p
syn8
、rbs序列、多克隆位点区(mcs)以及噬菌体λ的转录终止子t0序列，表达载体图谱如图4所示，核苷酸序列如seq id no.5所示。
59.大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pucp18e-mscarlet的构建；
60.pcr扩增红色荧光蛋白mscarlet基因，基因长度为699bp(genbank：ky021423.1)，所述序列由上海亦欣生物科技有限公司合成。pcr扩增反应体系(50μl)：模板1μl(红色荧光蛋白mscarlet)、上游引物2.5μl(10μm)、下游引物2.5μl(10μm)、2
×
phanta master mix高保真dna聚合酶0.5μl、超纯水32.5μl。引物序列如下：
61.上游引物mscarlet-f：gagggggttctagagggatccatggtctcaaagggtgaagcc
62.下游引物mscarlet-r：aacaggagtccaagactcgagttacttgtaaagctcatccattcctc
63.pcr程序：(1)94℃,10min；(2)30cycles:95℃,30s；55℃,30s；72℃,1min；(3)72℃,10min；(4)16℃,+∞。
64.之后，采用上海捷瑞生物工程有限公司dna产物胶回收纯化试剂盒对上述得到的红色荧光蛋白mscarlet基因片段进行纯化，等待后续连接，纯化步骤详见其说明书。
65.使用限制性内切酶bamh i和xho i双酶切上述穿梭表达载体pucp18e，电泳回收线性化的pucp18e载体片段。
66.将上述获得的线性化载体片段与红色荧光蛋白mscarlet基因片段采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的一步克隆法连接试剂盒进行连接，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，在羧苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，重组载体经pcr及测序鉴定，结果如图5所示，证明载体构建正确，命名为pucp18e-mscarlet。上述成功构建的穿梭表达载体全长5373bp，表达载体图谱如图6所示，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
67.大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pucp18e-p
rpsj-mscarlet的构建；
68.所述表达载体为将上述构建表达载体pucp18e-mscarlet的启动子p
syn8
更换为铜绿假单胞菌内源启动子p
rpsj
，启动子序列如seq id no.2所示。
69.以铜绿假单胞菌pao1基因组为模板，扩增启动子p
rpsj
片段，该启动子片段长度为501bp。pcr扩增反应体系(50μl)：模板1μl、上游引物2.5μl(10μm)、下游引物2.5μl(10μm)、2
×
phanta master mix高保真dna聚合酶0.5μl、超纯水32.5μl。使用细菌基因组提取试剂盒抽提得到铜绿假单胞菌pao1基因组dna。引物序列如下：
70.上游引物p
rpsj-f：aacgacggccagtgccaagcttagcgcaccaagcgtgaagacgta
71.下游引物p
rpsj-r：tgcaggcgcgccgagctcggatcctttgacctcagactccaatttacc
72.pcr程序：(1)94℃,10min；(2)30cycles:95℃,30s；60℃,30s；72℃,1
73.min；(3)72℃,10min；(4)16℃,+∞。
74.之后，采用上海捷瑞生物工程有限公司dna产物胶回收纯化试剂盒对上述得到的启动子片段纯化，等待后续连接，纯化步骤详见其说明书。
75.使用限制性内切酶blp i和bamh i双酶切上述穿梭表达载体pucp18e-mscarlet，电泳回收线性化的pucp18e-mscarlet载体片段。
76.上述线性化载体片段与启动子p
rpsj
采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的一步克隆法连接试剂盒进行连接，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，在羧苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，重组表达载体经pcr及测序鉴定，结果如图7所示，结果证明启动子序列更换成功，表达载体构建正确，命名为pucp18e-p
rpsj-mscarlet。该表达载体全长5817bp，图谱如图8所示，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
77.pucp18e-mscarlet和pucp18e-p
rpsj-mscarlet表达验证；
78.取3μl上述构建成功的穿梭表达载体pucp18e-mscarlet和pucp18e-p
rpsj-mscarle，依次加入铜绿假单胞菌atcc 27853感受态细胞中，吹吸混匀，冰上孵育30min。使用bio-rad micro pulser电转仪，选用0.1cm的电击杯进行转化，电击电压为1.6kv，时间为2.0ms，电击结束后置于冰上，迅速加入800μl lb培养基，吹吸重悬后，吸出菌液置于离心管中，于37℃摇床中，震荡培养2h，之后将接菌液涂布在含有羧苄青霉素抗性的lb平板，挑取单菌落在含有羧苄青霉素抗性的lb培养基37℃培养，次日取适量菌液加入30％甘油后，置于-80℃冰箱保存。
79.取5μl上述铜绿假单胞菌mscarlet重组菌分别接入30ml lb培养基中，37℃、220rpm条件下过夜培养，吸取1ml菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，去除上清，可
观察到菌体呈红色。菌体用200μl蒸馏水重悬，震荡混匀后，于microplate reader酶标仪上分别测定od
600
和红色荧光蛋白mscarlet的荧光强度，最大激发波长为569nm，最大发射波长为594nm，收集数据，绘制启动子p
syn8
和p
rpsj
转录mscarlet的荧光强度图，结果如图9所示，由图可知，pucp18e载体可正确表达红色荧光蛋白mscarlet基因，将启动子更换为铜绿假单胞菌内源启动子p
rpsj
后同样可成功表达mscarlet荧光蛋白基因。证明了该载体构建方法和启动子更换方法的可行性。
80.本实施例还提供一种上述大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体的构建方法，包括：以克隆载体pucp18作为骨架载体，酶切除去原有多克隆位点；通过基因合成获得表达区片段p-mcs-t；将表达区片段p-mcs-t插入经酶切修饰后的骨架载体pucp18的多克隆位点之间；将目的基因或荧光指示蛋白基因插入上述表达区片段的多克隆位点之间。
81.综上所述，本发明以大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭克隆载体pucp18为基础，替换pucp18固有的多克隆位点区，引入启动子p
syn8
或p
rpsj
(含rbs序列)、mcs序列及噬菌体λ的转录终止子t0序列，成功构建了大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pucp18e、pucp18e-mscarlet及pucp18e-p
rpsj-mscarlet，本发明所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体的启动子(含rbs序列)前后带有hind iii和bamh i酶切位点，终止子序列前后带有xho i和ecor i酶切位点，能简便、快速地更换任一启动子及终止子序列，满足多样化、高通量的克隆需求；能广泛适用于以铜绿假单胞菌为宿主菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品的生产，为相关领域的应用提供了新的选择，为本领域的相关应用提供了一种新的表达载体工具。该穿梭表达载体的构建方法也可应用于其他宿主穿梭表达载体的设计与构建，具有良好的应用前景。
82.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
83.84.85.86.87.88.89.90.
技术特征：
1.一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，包括：抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；所述表达区片段包括：启动子、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子t0序列；所述启动子及终止子t0序列前后带有酶切位点，以及所述启动子包括rbs序列。2.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述启动子前后带有hind iii和bamhi酶切位点。3.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述终止子t0序列前后带有xho i和ecor i酶切位点。4.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述启动子和终止子t0序列之间具有多克隆位点区域。5.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述启动子为p
syn8
，其核苷酸序列如 seq id no.1所示。6.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述启动子为p
rpsj
，其核苷酸序列如 seq id no.2所示。7.如权利要求1所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，所述表达区片段核苷酸序列如 seq id no.3所示。8.如权利要求4-6任一项所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，在表达区片段的多克隆位点插入mscarlet基因，构成含有荧光蛋白基因的表达载体，其核苷酸序列如 seq id no.4所示。9.如权利要求4-6任一项所述的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，其特征在于，在表达区片段的多克隆位点插入任意目的基因，构成表达相应目的基因的表达载体。10.一种如权利要求1所述大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体的构建方法，其特征在于，包括：以克隆载体pucp18作为骨架载体，酶切除去原有多克隆位点；通过基因合成获得表达区片段p-mcs-t；将表达区片段p-mcs-t插入经酶切修饰后的骨架载体pucp18的多克隆位点之间；将目的基因或荧光指示蛋白基因插入上述表达区片段的多克隆位点之间。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法，其中大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体包括：抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；所述表达区片段包括：启动子、RBS序列、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子T0序列；所述启动子（含RBS序列）及终止子T0序列前后带有酶切位点，可通过简单的酶切、连接反应快速实现不同启动子或终止子元件的更换，步骤简单，极大地缩短了更换载体表达元件的时间，满足多样化、高通量的克隆需求。高通量的克隆需求。高通量的克隆需求。


技术研发人员：费一诺 刘亚菲 耿文鑫 刘沛铭
受保护的技术使用者：常州药物研究所有限公司
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2022/5/25