用于肝硬化预后评估的标志物组合的制作方法

1.本技术涉及的临床医学，具体地，提供了用于肝硬化预后评估的标志物 组合。


背景技术：

2.众所周知，人体会释放出大量挥发性有机化合物(volatile organiccompounds，voc)，主要来自呼出的气体、汗液、皮肤分泌物、尿液、粪便 和唾液，所有这些都是通过代谢途径产生的。中医和古代西方医生，包括希 波克拉底，认为呼出的气在诊断和治疗上都很重要，并把气味作为诊断工具。 医生的嗅觉技能在现代医学中并没有得到常规的应用，有大量的文献记载， 许多疾病，如癌症、糖尿病、呼吸系统疾病、肝脏疾病等都与独特的气味有 关。最近，“super-smeller”，一位在临床症状出现前就能嗅到帕金森病病情 的女性，帮助科学家开发了一种基于挥发性有机化合物来识别帕金森病最早 期的新型诊断测试。一些研究表明，呼出气体中的挥发性有机化合物可以为 患者的病理生理状况提供有价值的信息。
3.此外，患有严重肝病的患者长期以来一直抱怨有一种被称为“肝臭味
”ꢀ
的臭味，其中大部分来自呼吸。已经检测到一些呼吸气味化合物，用于鉴别 健康志愿者和患有肝脏并发症的患者。例如，二甲基硫醚以前被确定为对肝 病性肝臭起作用的重要代谢物。
4.失代偿期肝硬化(dc)是一种常见的后果，也是多种病因导致的慢性肝 病的最后阶段，主要是由于慢性乙型和丙型病毒性肝炎、有害饮酒和自身免 疫性肝病，如原发性胆汁性胆管炎，伴有致命并发症，包括腹水、消化道出 血和肝性脑病。失代偿期肝硬化患者呼气的相关性尚未确定。


技术实现要素：

5.在本研究中，发明人研究了dc患者，包括乙型肝炎肝硬化(hlc)、酒精 相关性肝硬化(alc)和原发性胆汁性肝硬化(pbc)患者呼出气中的挥发性有机 化合物。通过呼气代谢组学的检测，发明人确定了dc患者预后的最佳预测因 子，从新的角度探索了dc与不同病因的内在联系，为今后进一步早期干预和 创新治疗方法提供参考。
6.本技术提供了一组用于肝硬化预后评估的标志物组合，包括：(
±
)-3,5,5
‑ꢀ
三甲基-1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、 亚油酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰芳胺 (n-acetylarylamine)。优选地，所述n-乙酰芳胺是n-乙酰苯胺。
7.本技术还提供了确定肝硬化预后评估的标志物组合的方法，所述标志物 组合包括(
±
)-3,5,5-三甲基-1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸 乙酯、愈创木酚、亚油酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n
‑ꢀ
乙酰芳胺，优选地，所述n-乙酰芳胺是n-乙酰苯胺，所述方法包括以下步骤：
8.步骤1.收集呼出气冷凝物(ebc)；
9.步骤2.使用二维气相色谱串联飞行时间质谱分析呼出气冷凝物，采集质 谱数据；
3,5,5-三甲基-1-己醇、以及(+)-3,5,5-三甲基-1-己醇与(-)-3,5,5-三甲基-1-己醇 的混合物。
22.类似地，本技术所述的(
±
)-赤-异亮氨酸包括(+)-赤-异亮氨酸、(-)-赤-异亮 氨酸、以及(+)-赤-异亮氨酸与(-)-赤-异亮氨酸的混合物。
23.本技术的第二方面提供了确定肝硬化预后评估的标志物组合的方法，所 述标志物组合包括(
±
)-3,5,5-三甲基-1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅 醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙 醛和n-乙酰芳胺，优选地，所述n-乙酰芳胺是n-乙酰苯胺，所述方法包括 以下步骤：
24.步骤1.收集呼出气冷凝物(ebc)；
25.步骤2.使用二维气相色谱串联飞行时间质谱分析呼出气冷凝物，采集质 谱数据；和
26.步骤3.用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析对质谱数据进行分析， 得到用于肝硬化预后评估的标志物组合。
27.呼出气体冷凝是一种收集呼出气体样本的非侵入性方法。呼出的空气被 引导通过一个独特的单向阀，进入一个冷却的收集室，在那里，呼吸中的蒸 汽、气溶胶和水分沿着受保护的rtube内壁冷凝。单向阀然后被用作柱塞， 收集粘附在内壁上的液滴，并将样品保持在rtube顶部附近。对于正常潮汐 呼吸努力的成年人，典型的冷凝液产量为100-250毫升/分钟。所有患者和志 愿者都被要求在正常呼吸的情况下呼气至少2分钟，这为大多数实验室测试 提供了足够的液体量。
28.在一些优选实施方案中，还包括收集呼出气冷凝物后进行样品提取，优 选地，包括：培养时间和温度分别设定为15分钟和50℃，搅拌器速度固定在 500转/分持续5-10分钟、然后在100转/分持续5-10分钟用于样品提取，解 吸时间为10分钟。更优选地，培养时间和温度分别设定为15分钟和50℃， 搅拌器速度固定在500转/分持续10分钟、然后在100转/分持续10分钟用于 样品提取，样品提取时间为35分钟。
29.在一些优选实施方案中，气相色谱条件为：进样量10μl，氦气用作载气， 前入口吹扫流量为3ml
·
min-1
，通过色谱柱的气体流速为1ml
·
min-1
；初始温 度保持在50℃持续1分钟，然后以4℃/分钟的速度升至150℃，接着以8℃/ 分钟的速度升至210℃，并在210℃保持5.5分钟。
30.在一些优选实施方案中，质谱条件为：注射、转移管线和离子源温度分 别为240℃、280℃和220℃；电子碰撞模式下能量为70ev；在溶剂延迟0.3 分钟后，以每秒50
±
5个光谱的速率，在m/z范围为33-500的全扫描模式下采 集质谱数据。
31.本技术的第三方面提供了肝硬化预后评估的标志物组合用于制备肝硬化 预后评估试剂盒的应用，所述标志物组合包括(
±
)-3,5,5-三甲基-1-己醇、二氯甲 烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油酸甲酯、氧戊二酸、 (
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰芳胺，优选地，所述n-乙酰芳胺是n-乙 酰苯胺。
32.在一些优选实施方案中，用于预后评估的样品为呼出气冷凝物。
33.实施例
34.1.研究参与者
35.本研究符合世界医学协会赫尔辛基宣言的伦理原则，实验方案经中国人 民解放
军总医院第五医学中心伦理委员会批准，并在中国临床试验注册中心 注册，注册号为chictr-roc-17010 345。2017年4月至2017年10月，从中 国人民解放军总医院第五医学中心招募了96名参与者，包括66名肝硬化(dc) 患者(男性33名，女性33名)和30名健康志愿者(男性13名，女性17名)，所 有参与者均签署了知情同意书。健康志愿者(c组)在半年内通过正常常规检查 确认健康。66名肝硬化患者的所有诊断，包括24名乙型肝炎肝硬化(hlc) 患者、22名酒精相关性肝硬化(alc)患者和20名原发性胆汁性肝硬化(pbc) 患者，均已由医院医生根据相应的指南进行了确认。
36.2.呼出气冷凝物样本收集
37.在取样之前，志愿者和患者都被要求禁食至少两个小时，停止服用任何 药物8小时，并在24小时内戒酒和/或戒烟。在收集呼出气冷凝物(ebc)样本 之前，所有参与者用水漱口两次。ebc样本收集在带有冷却套的rtube呼出 气体冷凝物收集器(呼吸研究公司，rri)中，然后在-80℃的实验室冰箱中冷冻。
38.3.分析方法
39.通过使用安捷伦7890气相色谱系统(美国加州圣克拉拉的安捷伦科技公 司)，在db-5ms柱(30米
×
250微米
×
0.25微米，美国)上分离收集样品中的 所有目标分析物。将呼出气冷凝物样本在50℃培养15分钟。然后在速度固定 在500转/分的搅拌器中持续10分钟，然后在100转/分的搅拌器中持续10分 钟用于样品提取。样品提取时间为35分钟，解吸时间为10分钟。样本进样 量10μl，氦气用作载气，前入口吹扫流量为3ml
·
min-1
。通过色谱柱的气体流 速为1ml
·
min-1
。初始温度保持在50℃持续1分钟，然后以4℃/分钟的速度升 至150℃，接着以8℃/分钟的速度升至210℃，并在210℃保持5.5分钟。注 射、转移管线和离子源温度分别设定为240、280和220℃。电子碰撞模式下 能量为70ev。在溶剂延迟0.3分钟后，以每秒50
±
5个光谱的速率，在m/z 范围为33-500的全扫描模式下采集质谱数据。总共取10μl每个样品进行混合， 作为质量控制(qc)样品，每10个测试样品后分析一个qc样品。
40.4.统计分析
41.使用ibm spss 22.0软件进行统计分析。受试者生物学特征的连续变量表 示为平均标准偏差，临床数据表示为中位数[第25、75个百分点]。 kruskal-wallis检验或方差分析(anova)用于评估连续变量的差异，而pearson 的χ2检验用于分类因子。spearman或pearson相关系数用于评估呼出化合物 和患者临床特征之间的相关性。差异在p《0.05时显著，在p《0.01时高度显著。 代谢组学分析和代谢物鉴定利用chroma tof软件(v4.3x，leco)对质谱数据 进行分析：依次进行峰提取、基线校正、去卷积、峰积分和峰对齐。移除qc 样品中检测率低于50％或相对标准偏差》30％的峰。metaboanalyst在线数据库 用于分析数据并筛选显示折叠变化(fc)》2的不同化合物(p《0.05)。利用 simca-p 13.0软件对归一化数据进行了主成分分析和opls-da分析。筛选 结果被用作潜在的生物标志物，并通过与美国国家标准与技术研究所(nist) 数据库中的已知化合物进行比较进行鉴定。
[0042]
5.结果
[0043]
5.1受试者的临床特征
[0044]
本研究共招募了96名受试者，包括30名健康对照受试者、24名hlc患 者、22名alc患者和20名pbc患者。不同亚组的临床信息和生化参数，如 性别、年龄以及并发症，包括腹水、肝性脑病(he)和上消化道出血(ugib)和 child-pugh评分，如表1所示。最新研究报告显
示，pbc男女发病率为1:10。 本研究男女发病率为1:9.5，符合pbc的临床特点。评估肝硬化预后的性别在 所有三组中没有显著差异，基线数据在本研究中是一致的。
[0045]
表1 肝硬化患者的临床特征
[0046][0047]
生物学特征表示为平均值
±
标准差，并且临床数据表示为中位数[p
25
,p
75
]。
[0048]
5.2呼出气体挥发性有机化合物的多变量分析
[0049]
总的来说，从96个呼气冷凝物中获得的挥发性有机化合物数据在预处理 后通过多变量分析进行分析。根据生成的主成分分析模型，质量控制小组提 出了良好、均匀的趋势，并显示了该方法令人满意的稳定性(如图1所示)。此 外，进行opls-da是为了展示hlc、alc、pbc和c组的趋势，这突出了 明显的代谢差异(图1)。此外，在健康对照组和三个dc组之间进行比较的 opls-da和vip-p(corr)图进一步证实，挥发性有机化合物可以区分健康个体 和不同病因的dc患者(图2，a-f)。投射重要性变量》1、|p(corr)|≥0.5和p《0.05 的化合物被定义为显著标记。
[0050]
5.3失代偿期肝硬化患者呼出气voc的预后分析
[0051]
在本研究中，我们通过opls-da分析获得了hlc组、alc组和pbc组 的不同代谢产物。采用roc曲线分析预测预后，筛选出hlc组、alc组和 pbc组中诊断价值最高的12种呼出气代谢物。如表2所示，(
±
)-3,5,5-三甲基
ꢀ‑
1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油 酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰苯基胺被筛选出来， 以预测dc患者更差的预后。
[0052]
表2 3组中roc曲线的前12种呼出气代谢物
[0053][0054]
3.4失代偿期肝硬化临床指标预后分析
[0055]
将66例dc病患者按预后分为两组。在2年的随访中，死亡和肝移植的 患者被归类为预后较差。45例患者分为预后良好组(gp组)，21例患者分为预 后较差组(bp组)。不同亚组的临床信息和生化参数如表3所示。至于dc患 者基于ebc的代谢物特征，我们观察到gp组和bp组之间的alb、inr、 pt、hdl、tbil、dbil、alt、che、tba、pta、wbc、rbc的临床指 标有显著变化。然后进行spearman相关分析和logistic回归分析，确定与预 后相关的指标。结果显示，inr和tbil可以有效预测dc患者的预后(表4 和表5)。
[0056]
表3 dc患者的临床信息和生化参数
[0057]
[0058][0059]
表4 临床指示物和患有dc的患者的预后的相关分析
[0060]
[0061][0062]
表5 临床指示物和患有dc的患者的预后的相关分析
[0063][0064]
5.5呼出气代谢物临床诊断价值与临床生化参数的比较
[0065]
为了验证呼出气代谢物的诊断价值，构建了roc曲线，以评估ebc代 谢物生物标志物作为预测dc患者不良结局的无创生物标志物的潜在效用。图 3(a)和表6的结果显示，呼出代谢物的诊断([auc]＝0.891，95％[ci]＝ 0.815-0.967)、meld评分([auc]＝0.925，95％[ci]＝0.851-0.999)、child-pugh 评分([auc]＝0.781，95％[ci]＝0.664-0.898)、tbil([auc]＝0.898)。同时，我 们观察到由12种化合物建立的模型在评估dc患者预后方面优于其他8种模 型，这些患者与未肝移植存活者相比预后较差。该roc分析表明，ebc代谢 物生物标志物可用于有效预测未肝移植存活的dc患者的更差预后，其auc 值为0.906(95％[ci]＝0.806-1.000)(图3(b))。此外，与meld评分([auc]＝0.831， 95％[ci]＝0.671-0.991)相比，child-pugh评分([auc]＝0.822，95％[ci]＝ 0.679-0.966)，tbil([auc]＝0.766，95％[ci]＝0.595-0.936)，inr([auc]＝0.639， 95％[ci])。
[0066]
表6 患dc的66名患者的roc曲线的比较
[0067][0068][0069]
6.讨论
[0070]
在这项研究中，发明人对ebc的代谢物特征进行了分析，以区分预后较 差的dc患者和未进行肝移植的存活患者。本研究基于ebc的代谢组学方法， 为评估dc患者的预后提供了一种新的无创方法，有助于dc患者临床管理的 进一步研究。本研究通过roc曲线分析比较了不同原因引起的dc病的呼气 代谢产物。选择12种呼气代谢物作为不同的代谢物，以区分预后较差的dc 患者(表2)。结果表明，dc病患者预后的最佳预测因子包括(
±
)-3,5,5-三甲基-1
‑ꢀ
己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油酸甲 酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰苯胺。
[0071]
为了准确预测dc的不良预后，根据ebc的12个候选代谢物生物标志物 建立了一个预后模型，其auc值＝0.891(表6)。基于ebc代谢物特征的预后 模型具有高敏感度(77.8％)和特异度(85.7％)，可以有力地区分预后较差的dc 患者。ebc相关代谢物信号模型的这种能力已被证明优于通常的临床预测模 型，包括血清标志物tbil(auc＝0.878)、inr(auc＝0.769)和child-pugh 评分(auc＝0.871)(图3(a))。
[0072]
同时，ebc 12个候选代谢物生物标志物的预后模型可以有力地区分预后 较差的dc患者和没有肝移植的存活患者，auc值＝0.906。ebc相关代谢物 信号模型的这一诊断价值已被证明优于通常的临床预测模型，包括血清标志 物tbil(auc＝0.766)、inr(auc＝0.639)、child-pugh评分(auc＝0.822) 和meld评分(auc＝0.831)(图3(b))。
[0073]
本技术描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的， 并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本技术所描述的实施 例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多 可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许 多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的 任何特征或要素可以与任何其它实施例中的任何其他特征或要素结合使用， 或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或要素。
[0074]
本技术包括并设想了与本领域普通技术人员已知的特征和要素的组合。 本技术已经公开的实施例、特征和要素也可以与任何常规特征或要素组合， 以形成由权利要求限定的独特的发明方案。任何实施例的任何特征或要素也 可以与来自其它发明方案的特征或要素组合，以形成另一个由权利要求限定 的独特的发明方案。因此，应当理解，在本技术中示出和/或讨论的任何特征 可以单独地或以任何适当的组合来实现。因此，除了根据所附权利要求及其 等同替换所做的限制以外，实施例不受其它限制。此外，可以在所附权利要 求的保护范围内进行各种修改和改变。

技术特征：
1.用于肝硬化预后评估的标志物组合，包括：(
±
)-3,5,5-三甲基-1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰芳胺，优选地，所述n-乙酰芳胺为n-乙酰苯胺。2.一种确定肝硬化预后评估的标志物组合的方法，所述标志物组合包括(
±
)-3,5,5-三甲基-1-己醇、二氯甲烷、吡啶、γ-丁内酯、香茅醛、乳酸乙酯、愈创木酚、亚油酸甲酯、氧戊二酸、(
±
)-赤-异亮氨酸、3-苯丙醛和n-乙酰芳胺，优选地，所述n-乙酰芳胺为n-乙酰苯胺，所述方法包括以下步骤：步骤1.收集呼出气冷凝物(ebc)；步骤2.使用二维气相色谱串联飞行时间质谱分析呼出气冷凝物，采集质谱数据；和步骤3.用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析对质谱数据进行分析，得到用于肝硬化预后评估的标志物组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中气相色谱条件为：进样量10μl，氦气用作载气，前入口吹扫流量为3ml
·
min-1
，通过色谱柱的气体流速为1ml
·
min-1
，初始温度保持在50℃持续1分钟，然后以4℃/分钟的速度升至150℃，接着以8℃/分钟的速度升至210℃，并在210℃保持5.5分钟。4.根据权利要求3所述的方法，其中质谱条件为：注射、转移管线和离子源温度分别为240℃、280℃和220℃；电子碰撞模式下能量为70ev；在溶剂延迟0.3分钟后，以每秒50
±
5个光谱的速率，在m/z范围为33-500的全扫描模式下采集质谱数据。5.根据权利要求4所述的方法，还包括收集呼出气冷凝物后进行样品提取，包括：培养时间和温度分别设定为15分钟和50℃，搅拌器速度固定在500转/分持续5-10分钟、然后在100转/分持续5-10分钟后用于样品提取，解吸时间为10分钟；优选地，培养时间和温度分别设定为15分钟和50℃，搅拌器速度固定在500转/分持续10分钟、然后在100转/分持续10分钟后用于样品提取。6.权利要求1所述的肝硬化预后评估的标志物组合用于制备肝硬化预后评估试剂盒的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其中用于肝硬化预后评估的样品为呼出气冷凝物。

技术总结
本申请提供了用于肝硬化预后评估的标志物组合，包括：(


技术研发人员：王睿林 牛明 王仲霞 景婧 何婷婷 荣文雅
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第五医学中心
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2022/5/25