一种靶向端粒酶纳米药物递送系统及其制备方法与应用

1.本发明涉及抗肿瘤纳米药物技术领域，具体来说是一种靶向端粒酶纳米药物递送系统及其制备方法与应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤作为一种危害性大且难治性的疾病，一直是生命科学各领域研究的重点，当前在肿瘤的治疗中仍存在三大难以解决的问题：肿瘤耐药性、肿瘤转移和肿瘤的微环境。随着生物学家对恶性肿瘤不断深入地研究，发现基因突变信号通路不仅与恶性肿瘤发生有关，而且与肿瘤治疗中所存在的转移性和化学药物耐药性相关。
3.蒽环类药物，如阿霉素、表阿霉素和柔红霉素等，是被广泛用于癌症治疗的化疗药物，能够达到直接治疗癌症的目的。但由于其不具有靶向性，在杀死癌细胞的同时，对正常细胞也会造成杀伤，产生较大的毒副作用，并直接导致心脏毒性；另一方面，蒽环类药物作为化疗药物在治疗癌症时容易产生多药耐药性，降低了药物的疗效。
4.端粒酶(telomerase)在调节细胞生长、衰老、癌变等多种生理过程中发挥着重要的作用。通常在正常细胞中，端粒酶活性会被有效地抑制，然而在几乎所有的肿瘤细胞中，端粒酶的活性会被激活，因此端粒酶被认为是一种可靠的肿瘤标记物，其活性的有效检测和原位监测对肿瘤的早期诊断和生物医学研究具有重要意义。
5.到目前为止，细胞内端粒酶活性的检测主要使用各种纳米材料作为载体，端粒酶探针的研究主要集中在：(1)纳米金作为载体：通过au-s键结合，虽然核酸荧光探针克服了肿瘤细胞的异质性，在分子水平上实现了肿瘤的普适性检测，可以实现对肿瘤从分子、细胞、组织到活体的跨平台检测和肿瘤手术的可视化导航。
6.(2)msn载体：所制得的纳米探针以多孔硅纳米粒子(msn)为载体，在其孔道中共价固定荧光猝灭剂bhq，填充荧光素，并通过静电吸附在其表面包裹含端粒酶底物片段(tp)的dna链，将荧光素封堵在孔道中。bhq的存在猝灭了荧光素的荧光，探针进入细胞质后，在细胞质中端粒酶作用下打开探针孔道，利用释放的荧光素产生的荧光，实现细胞内端粒酶活性的原位检测。
7.尽管这些方法具有较高的细胞传递效率和高对比度成像，但这些载体一般制备过程复杂，同时在分析检测端粒酶活性时通常涉及多个反应阶段，会表现出一定程度的环境敏感性以及非特异性释放。此外，对活细胞端粒酶活性进行检测时，缺乏肿瘤靶向递送往往会导致非肿瘤特异性的假阳性信号的产生。
8.dna作为一种共同的生物分子和不同生物的基本遗传物质，用于保存遗传信息。dna材料具有沃森克里克碱基对的高精度和高可控性等特点，具有纳米化的潜力。20世纪80年代，seeman等人首次提出了dna纳米结构的合成规则，引发了dna纳米技术多年的蓬勃发展。dna纳米技术是一种人为设计dna序列并自组装得到dna纳米结构的技术，dna适体能够特异性靶向癌细胞，增加药物在肿瘤组织的富集。带有适体的dna纳米结构具有高靶向性、高载药量、良好的生物相容性、提高药物溶解度等优势，是降低化疗药物毒副作用的高效载
体。然而，无论是dna折纸术还是dna模板组合所制备的dna纳米药物递送系统，在治疗应用方面，这些多功能高分子dna纳米材料在体内仍然存在易代谢、缺乏靶向性、稳定性差等缺点。
9.为了解决上述问题，本技术利用金属配位法，通过dna-多酚-金属配位相结合的技术，构建新型纳米诊疗剂ddtp nps。ddtp nps是利用分子信标荧光-淬灭原理设计对端粒酶具有靶向性的发卡dna片段作为内核，以多酚-金属离子配位形成为纳米诊疗剂的表面，可溶性高分子-多酚-金属离子或者荧光染料-多酚-金属离子配位形成为纳米诊疗剂的外围，自组装形成靶向端粒酶纳米药物递送系统。利用“端粒酶
→
主动靶向肿瘤组织”、“纳米载药系统平台
→
实现诊疗一体化监测
→
分析药物分布及肿瘤组织变化”、“多酚化合物
→
提高抗氧化系统功能
→
增强药物抗肿瘤作用
→
降低心脏毒性”等多方位相结合的协同作用，杀死肿瘤细胞，实现分子影像诊断与靶向化疗的同步治疗，实时监测肿瘤组织的变化，及时调整治疗方案，达到恶性肿瘤精准治疗的目的。


技术实现要素：

10.本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种载药量高、稳定性好的纳米药物递送系统，其提高小分子抗肿瘤药物药效的同时，多酚和小分子抗肿瘤药物还具有协同药效，实现分子影像诊断与靶向化疗的同步治疗，达到恶性肿瘤精准治疗的目的。
11.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
12.本发明第一方面提供一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，包括具有配位能力的金属离子、靶向端粒酶发卡dna、小分子抗肿瘤药物、多酚化合物、体内成像示踪剂；
13.所述靶向端粒酶发卡dna的茎部包括长度为5-8个碱基对的g-c碱基，所述小分子抗肿瘤药物装载在茎部发卡dna的茎部；所述靶向端粒酶发卡dna的中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基，所述具有配位能力的金属离子与发卡dna的中间环部配位；所述靶向端粒酶发卡dna的两端为荧光基团-淬灭基团。
14.且所述具有配位能力的金属离子与装载小分子抗肿瘤药物的发卡dna形成纳米药物递送系统的内核；具有配位能力的金属离子与多酚化合物配位形成纳米药物递送系统的表面；具有配位能力的金属离子与体内成像示踪剂配位形成纳米药物递送系统的外围。
15.有益效果：本技术将小分子抗肿瘤药物装修在发卡dna上，并使用荧光基团-淬灭基团对发卡dna进行标记，然后发卡dna、多酚化合物、体内成像示踪剂分别与金属离子形成配位形成内核、表面和外围结构，以此构建以金属离子为骨架的纳米药物递送系统，用于运载发卡dna、小分子抗肿瘤药物、多酚、荧光染料等。
16.当发卡dna在体内与肿瘤细胞中的端粒酶结合后，发卡式的结构打开，并释放小分子抗肿瘤药物，同时淬灭的荧光基团恢复荧光，实现精准诊断和准确释药；利用多酚清除氧自由基，增强机体抗氧化系统的功能，从而实现多酚和小分子抗肿瘤药物的协同用药，提高抗肿瘤小分子化疗药物的药效，减轻小分子抗肿瘤药物心脏毒性的毒副作用；多酚与金属离子配位所形成的配位化合物，可解决dna纳米递送系统易代谢、溶解性差、稳定性差等问题，提高在体内的生物利用度，进而增强dna纳米载体在体内抗肿瘤的功能；利用体内成像示踪剂的跟踪，实现药物在体内的代谢途径的实时监测。
17.优选的，所述荧光基团连接在发卡dna的5’端，淬灭基团连接在发卡dna的3’端。且
所述荧光基团-淬灭基团选自1-氨基萘-8-羧酸(edans)-二甲氨基偶氮苯甲酰(dabsyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-羧基四甲基罗丹明(tamra)、德克萨斯红(texasred)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、荧光素(fluoresein)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)中的一种或任意种的组合。
18.有益效果：本技术中发卡dna的5’端与3’配对的同时，由于3’端较长，使淬灭基团与荧光基团之间有一定的距离，以此实现荧光基团荧光淬灭；当发卡dna进入体内后，发卡dna上的引物与端粒酶结合，以此实现对肿瘤组织的靶向。
19.优选的，所述具有配位能力的金属离子选自二价铁离子、镁-锌离子、汞-银离子、钾离子、钠离子中的一种或任意种的组合。
20.优选的，所述小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、dox、dox-紫杉醇前药、dox-多西紫杉醇中的一种或任意种的组合。
21.优选的，所述多酚化合物选自单宁酸、黄芩素、老鹳草、杨梅素、二氢杨梅素、杨梅黄素、杨梅黄酮中的一种或任意种的组合。
22.优选的，所述体内成像示踪剂选自近红外荧光染料和多酚的共价偶联化合物、可溶性高分子和多酚的共价偶联化合物中的一种或任意种的组合。
23.优选的，所述近红外荧光染料选自icg、二氢卟吩ce6、亚甲蓝、罗丹明中的一种或任意种的组合。
24.优选的，所述多酚选自多巴胺、5-羟基多巴胺中的一种或任意种的组合。
25.优选的，所述可溶性高分子为聚乙二醇。进一步方案，所述聚乙二醇为羧基聚乙二醇(peg)，且所述聚乙二醇(peg)的分子量为5000-100000。
26.本发明第二方面提供一种靶向端粒酶纳米载药系统的制备方法，包括如下步骤：
27.s1、设计靶向端粒酶发卡dna：合成茎部包括长度为5-8个碱基对g-c碱基、中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基的dna发卡结构，并在dna发卡结构的两端标记荧光基团-淬灭的基团；
28.s2、制备靶向内核：将小分子抗肿瘤药物溶液加入靶向端粒酶发卡dna中，并对两者进行混合，使小分子抗肿瘤药物插入到靶向端粒酶发卡dna的茎部，以此形成dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液；
29.s3、制备内核配位溶液：在具有配位能力的金属离子过量的条件下，将dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液加入具有配位能力的金属离子盐溶液中，并对两者进行混合，使dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液与具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的内核，该混合溶液为第一配位溶液；
30.s4、制备表面复合溶液：将多酚化合物溶液加入到第一配位溶液中，并对两者进行混合，使多酚化合物溶液与过量的具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的表面，该混合溶液为第二配位复合溶液；
31.s5、制备外围复合溶液：将体内成像示踪剂溶液加入到第二配位复合溶液中，并对两者进行混合，使体内成像示踪剂与剩余的具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的外围，该混合溶液为第三配位复合溶液；
32.s6、纯化外围复合溶液：对第三配位复合溶液进行纯化，得到靶向端粒酶纳米药物
递送系统。
33.优选的，所述步骤1中端粒酶发卡dna的浓度为1-2mmol/l。
34.优选的，所述步骤2中小分子抗肿瘤药物溶液加入靶向端粒酶发卡dna后先进行涡旋，涡旋的速度为1500-2500次/分、时间为3-5分钟，再搅拌10-15小时，使两者混合均匀。
35.优选的，所述步骤2中小分子抗肿瘤药物溶液为该药物溶的二甲基甲酰胺溶液，溶液浓度为1-3mmol/l。
36.优选的，所述步骤3中具有配位能力的金属离子盐溶液为该金属离子的卤化物水溶液。进一步方案，所述金属离子的卤化物水溶液为金属离子的氯化物水溶液。
37.优选的，所述步骤3中具有配位能力的金属离子盐溶液的浓度为5-20mmol/l。
38.优选的，所述步骤3中dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液加入具有配位能力的金属离子盐溶液中后先进行涡旋，涡旋的速度为1500-2500次/分、时间为1-3分钟，再搅拌10-15小时，使两者混合均匀。
39.优选的，所述步骤4中多酚化合物溶液为水溶液，且该水溶液的浓度为1-5mmol/l。
40.优选的，所述步骤4中多酚化合物溶液加入第一配位溶液中后进行涡旋，涡旋的速度为1500-2500次/分、时间为1-10分钟。
41.优选的，所述步骤5中体内成像示踪剂溶液为水溶液，且该水溶液的浓度为10-30μmol/l。
42.优选的，所述步骤5中体内成像示踪剂溶液加入第二配位复合溶液中后进行涡旋，涡旋的速度为1500-2500次/分、时间为1-10分钟。
43.优选的，所述步骤5中体内成像示踪剂溶液与多酚化合物溶液的体积比为1:5-10。
44.优选的，所述步骤5中体内成像示踪剂的制备方法：利用聚乙二醇nhs与多酚在edc/nhs或ddc/nhs催化下反应制备聚乙二醇-多酚；或近红外荧光染料与多酚在edc/nhs或ddc/nhs催化下反应制备多酚-荧光染料。
45.优选的，所述步骤s6中所述第三配位复合溶液采用透析袋在双蒸水溶液中透析的方式进行纯化。
46.优选的，所述步骤s6中透析袋的分子量为5000-10000。
47.优选的，所述步骤s6中透析时的转子转速为200-500rpm/分钟、透析时间为10-15小时。
48.本发明第三方面提供一种靶向端粒酶纳米载药系统在制备抗肿瘤纳米药物产品中的应用。
49.优选的，所述靶向端粒酶纳米载药系统用于制备肿瘤细胞或肿瘤组织的主动和被动纳米药物智能递送系统。
50.优选的，所述靶向端粒酶纳米载药系统用于制备dna-化疗药物联合用药系统。
51.优选的，所述靶向端粒酶纳米载药系统用于制备药物体内成像与跟踪、监测药物分布及代谢的肿瘤诊断制剂或精准治疗制剂。
52.优选的，所述靶向端粒酶纳米载药系统用于制备抗肿瘤纳米药物试剂盒。
53.本发明的优点在于：
54.1.本技术当发卡dna在体内与肿瘤细胞中的端粒酶结合后，发卡式的结构打开，并靶向释放小分子抗肿瘤药物，同时淬灭的荧光基团恢复荧光，即利用多酚-荧光染料监测药
物在体内的代谢途径，实现精准诊断和准确释药。
55.2.本技术利用多酚清除氧自由基，增强机体抗氧化系统的功能，从而实现多酚和小分子抗肿瘤药物的协同用药，提高抗肿瘤小分子化疗药物的药效，减轻小分子抗肿瘤药物心脏毒性的毒副作。
56.3.本技术多酚与金属离子配位所形成的配位化合物，可解决dna纳米递送系统易代谢、溶解性差、稳定性差等问题，提高在体内的生物利用度，进而增强dna纳米载体在体内抗肿瘤的功能。
57.4.本技术的纳米药物递送系统具有靶向性强、载药量高、稳定性好的优点，提高小分子抗肿瘤药物药效的同时，多酚和小分子抗肿瘤药物还具有协同药效，实现分子影像诊断与靶向化疗的同步治疗，达到恶性肿瘤精准治疗的目的。
附图说明
58.图1为本技术实施例2中ddtp nps的tem表征图。
59.图2为本技术实施例2中ddtp nps的dls分析图。
60.图3为本技术实施例4中ddtp nps的dox体外释药曲线图。
61.图4为本技术实施例5中在激光共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞u87mg对ddtp nps的摄取情况。
62.图5为本技术实施例5中流式细胞仪定量测定肿瘤细胞u87mg对ddtp nps的摄取率。
63.图6为本技术实施例6中ddtp nps在小鼠体内药代动力学曲线的研究。
具体实施方式
64.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
65.本发明提供了一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，包括具有配位能力的金属离子、靶向端粒酶发卡dna、小分子抗肿瘤药物、多酚化合物。
66.其中，具有配位能力的金属离子选自二价铁离子、镁-锌离子、汞-银离子、钾离子、钠离子中的一种或任意种的组合。
67.小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、dox、dox-紫杉醇前药、dox-多西紫杉醇中的一种或任意种的组合。
68.靶向端粒酶发卡dna的茎部包括长度为5-8个碱基对的g-c碱基、中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基、两端标记荧光基团-淬灭基团。小分子抗肿瘤药物装载在茎部发卡dna的茎部，具有配位能力的金属离子与发卡dna的中间环部配位，以此形成纳米药物递送系统的内核。
69.荧光基团连接在发卡dna的5’端，淬灭基团连接在发卡dna的3’端。且荧光基团-淬灭基团选自1-氨基萘-8-羧酸(edans)-二甲氨基偶氮苯甲酰(dabsyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-羧基四甲基罗
丹明(tamra)、德克萨斯红(texasred)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、荧光素(fluoresein)-4-(4
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二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)中的一种或任意种的组合。
70.多酚化合物选自单宁酸、黄芩素、老鹳草、杨梅素、二氢杨梅素、杨梅黄素、杨梅黄酮中的一种或任意种的组合。具有配位能力的金属离子与多酚化合物配位，形成纳米药物递送系统的表面。
71.体内成像示踪剂选自近红外荧光染料和多酚的共价偶联化合物、可溶性高分子和多酚的共价偶联化合物中的一种或任意种的组合。具有配位能力的金属离子与体内成像示踪剂配位形成纳米药物递送系统的外围。
72.其中，红外荧光染料选自icg、二氢卟吩ce6、亚甲蓝、罗丹明中的一种或任意种的组合；多酚选自多巴胺、5-羟基多巴胺中的一种或任意种的组合；可溶性高分子为聚乙二醇。进一步的，聚乙二醇为羧基聚乙二醇(peg)，且聚乙二醇(peg)的分子量为5000-100000。
73.一种靶向端粒酶纳米药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：
74.s1、设计靶向端粒酶发卡dna：合成茎部包括长度为5-8个碱基对g-c碱基、中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基的dna发卡结构，并在dna发卡结构的两端标记荧光基团-淬灭基团，且端粒酶发卡dna的浓度为1-2mmol/l。
75.s2、制备靶向内核：将1-3mm小分子抗肿瘤药物的二甲基甲酰胺溶液加入靶向端粒酶发卡dna中，先以1500-2500次/分的速度涡旋3-5分钟，再搅拌10-15小时，使两者混合均匀，此时小分子抗肿瘤药物插入到靶向端粒酶发卡dna的茎部，以此形成dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液。
76.s3、制备内核配位溶液：在具有配位能力的金属离子过量的条件下，将5-20mmol/l的dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液加入具有配位能力的金属离子的卤化物水溶液中，先以1500-2500次/分的速度涡旋1-3分钟，再搅拌10-15小时，使两者混合均匀，此时dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液与具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的内核，该混合溶液为第一配位溶液。
77.s4、制备表面复合溶液：将1-5mmol/l的多酚化合物水溶液加入到第一配位溶液中，并以1500-2500次/分的速度涡旋1-10分钟，使两者混合均匀，此时多酚化合物溶液与过量的具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的表面，该混合溶液为第二配位复合溶液。
78.s5、制备外围复合溶液：利用聚乙二醇nhs与多酚化合物在edc/nhs或ddc/nhs催化下反应制备聚乙二醇-多酚；或近红外荧光染料与多酚化合物在edc/nhs或ddc/nhs催化下反应制备多酚-荧光染料，以此形成浓度为10-30μmol/l的体内成像示踪剂水溶液。
79.按照体内成像示踪剂水溶液与多酚化合物溶液的体积比为1:5-10的比例，将体内成像示踪剂水溶液加入到第二配位复合溶液中，并以1500-2500次/分的速度涡旋1-10分钟，使两者混合均匀，此时体内成像示踪剂与剩余的具有配位能力的金属离子形成纳米药物递送系统的外围，该混合溶液为第三配位复合溶液。
80.s6、纯化外围复合溶液：将第三配位复合溶液置于分子量为5000-10000的透析袋中，设定转子转速为200-500rpm/分钟，透析10-15小时，以此对第三配位复合溶液进行纯化，得到靶向端粒酶纳米药物递送系统。
81.靶向端粒酶纳米载药系统可用于制备肿瘤细胞或肿瘤组织的主动和被动纳米药
物智能递送系统，dna-化疗药物联合用药系统，药物体内成像与跟踪、监测药物分布及代谢的肿瘤诊断制剂或精准治疗制剂以及抗肿瘤纳米药物试剂盒等抗肿瘤纳米药物产品。
82.实施例1
83.本技术实施例公开一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，包括fe
2+
、靶向端粒酶发卡dna、dox、单宁酸、peg-多巴胺。
84.靶向端粒酶发卡dna的5’端与3’端对位g-c相配对碱基形成茎部，且茎部的长度为7个碱基对。3’端以端粒酶ttaggg为开头，并与端粒酶引物结合，引物为5
’‑
aatcccaccaccacctcc-3’。发卡dna的中间环部为a/c碱基，且中间环部长度为15个碱基。且发卡dna的5’端标记有荧光基团6-fam，3’端标记有淬灭基团dabcyl。则本实施例所设计的靶向端粒酶发卡dna分子信标的发卡结构为5
’‑
6-fam-tgggattgggcgggaaaaaaaaaaaaaaacccgcccaatcccaggaggtggtggtgggatt-dabcyl-3’。
85.dox装载在茎部发卡dna的茎部，fe
2+
与发卡dna的中间环部配位形成fe
2+-dna，以此形成dna-dox作为纳米药物递送系统的内核；过量fe
2+
与单宁酸配位形成纳米药物递送系统的表面；fe
2+
与peg-多巴胺配位形成纳米药物递送系统的外围，从而构成靶向端粒酶纳米药物递送系统。
86.实施例2
87.本技术实施例公开一种靶向端粒酶纳米药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：
88.s1、设计靶向端粒酶发卡dna：合成茎部长度为7个碱基对的g-c碱基、中间环部长度为15个长度碱基的a/c碱基的dna发卡结构，并在5’端标记6-fam、3’端标记dabcyl，以此合成靶向端粒酶dna分子信标发卡，且浓度为1.5mmol/l。
89.s2、制备靶向内核：将100μl(1mm)dox的二甲基甲酰胺溶液加入500ml靶向端粒酶发卡dna中，先以2000次/分的速度涡旋3分钟，再搅拌12小时，使两者混合均匀，此时dox插入到靶向端粒酶发卡dna的茎部，以此形成dna-dox混合溶液。
90.s3、制备内核配位溶液：在fe
2+
过量的条件下，将30μl的dna-dox混合溶液加入30-80μl(15mmol/l)的fecl2水溶液中，先以2000次/分的速度涡旋2分钟，再搅拌12小时，使两者混合均匀，此时dna-dox混合溶液与fe
2+
配位形成纳米药物递送系统的内核，该混合溶液为第一配位溶液。
91.s4、制备表面复合溶液：将150μl(1mmol/l)的单宁酸水溶液加入到第一配位溶液(含有内核dna-dox)中，并以2000次/分的速度涡旋5分钟，使两者混合均匀，此时单宁酸与过量的fe
2+
配位形成fe
2+-多酚，作为纳米药物递送系统的表面，该混合溶液为第二配位复合溶液。
92.s5、制备外围复合溶液：利用聚乙二醇nhs与多巴胺在ddc/nhs催化下反应制备peg-多巴胺水溶液，利用icg与多巴胺在ddc/nhs催化下反应制备icg-多巴胺水溶液，以此得到peg-多巴胺/icg-多巴胺溶液，且溶液浓度为12μmol/l；。
93.按照peg-多巴胺/icg-多巴胺溶液与单宁酸-fe
2+
水溶液的体积比为1:7的比例，将20μlpeg-多巴胺/icg-多巴胺溶液加入到第二配位复合溶液中，并以2000次/分的速度涡旋3分钟，使两者混合均匀，此时peg-多巴胺/icg-多巴胺与剩余的fe
2+
配位形成peg-多巴胺-fe
2+
，作为纳米药物递送系统的外围，以此制备靶向端粒酶纳米药物递送系统(ddtp nps)，
该混合溶液为第三配位复合溶液。
94.对制备的ddtp nps进行tem和dls分析，结果如图1、图2所示。图1为tem表征图，可以看出ddtp nps的粒径大小均匀、分散分布；图2为dls分析图，可以看出ddtp nps的粒径为82.4
±
6nm。
95.s6、纯化外围复合溶液：将第三配位复合溶液置于分子量为8000的透析袋中，设定转子转速为350rpm/分，透析12小时，实现对第三配位复合溶液进行纯化。即利用透析原理将ddtp nps纳米递送系统完全转化成水相ddtp nps，并储存于-20℃的环境中备用。
96.实施例3
97.本技术实施例公开一种靶向端粒酶纳米药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：
98.s1、设计靶向端粒酶发卡dna：合成茎部长度为7个碱基对的g-c碱基、中间环部长度为15个长度碱基的a/c碱基的dna发卡结构，并在5’端标记6-fam、3’端标记dabcyl，以此合成靶向端粒酶dna分子信标发卡，且浓度为1.5mmol/l。
99.s2、制备靶向内核：将100μl(1mm)dox的二甲基甲酰胺溶液加入500ml靶向端粒酶发卡dna中，先以2000次/分的速度涡旋3分钟，再搅拌12小时，使两者混合均匀，此时dox插入到靶向端粒酶发卡dna的茎部，以此形成dna-dox混合溶液。
100.s3、制备内核配位溶液：在fe
2+
过量的条件下，将30μl的dna-dox混合溶液加入30-80μl(15mmol/l)的fecl2水溶液中，先以2000次/分的速度涡旋2分钟，再搅拌12小时，使两者混合均匀，此时dna-dox混合溶液与fe
2+
配位形成纳米药物递送系统的内核，该混合溶液为第一配位溶液。
101.s4、制备表面复合溶液：将150μl(1mmol/l)的单宁酸水溶液加入到第一配位溶液(含有内核dna-dox)中，并以2000次/分的速度涡旋5分钟，使两者混合均匀，此时单宁酸与过量的fe
2+
配位形成fe
2+-多酚，作为纳米药物递送系统的表面，该混合溶液为第二配位复合溶液。
102.s5、制备外围复合溶液：利用icg与多巴胺在ddc/nhs催化下反应制备icg-多巴胺水溶液，浓度为12μmol/l。
103.按照icg-多巴胺水溶液与单宁酸-fe
2+
水溶液的体积比为1:7的比例，将20μlicg-多巴胺水溶液加入到第二配位复合溶液中，并以2000次/分的速度涡旋3分钟，使两者混合均匀，此时icg-多巴胺与剩余的fe
2+
配位形成icg-多巴胺-fe
2+
，作为纳米药物递送系统的外围，以此制备靶向端粒酶纳米药物递送系统(ddtp nps)，该混合溶液为第三配位复合溶液。
104.s6、纯化外围复合溶液：将第三配位复合溶液置于分子量为8000的透析袋中，设定转子转速为350rpm/分，透析12小时，实现对第三配位复合溶液进行纯化。即利用透析原理将ddtp nps纳米递送系统完全转化成水相ddtp nps，并储存于-20℃的环境中备用。
105.实施例4
106.为了研究纳米药物递送系统ddtp nps的释药特征，将实施例2制备的纳米药物递送系统ddtp nps分别孵育在ph为7.4的模拟生理环境缓冲液和ph为5.5酸性缓冲液中，并在不同的时间点用高效液相色谱(hplc)检测dox的释放量，ddtp nps的dox体外释药曲线如图3所示。
107.从图3可以看出，在ph为7.4的模拟生理环境缓冲液中和酸性ph为5.5的缓冲液中，ddtp nps释药速率缓慢且持续释放，半衰期分别为13.1h、9.2h。相比之下，在ph为5.5的酸性缓冲液中，ddtp nps具有较快的释放率，表明酸性条件更有利dox药物的释放。
108.实施例5
109.为了研究纳米药物递送系统ddtp nps在肿瘤细胞中的摄取情况，以人胶质瘤细胞u87mg肿瘤细胞为研究对象。肿瘤细胞u87mg购买于中科院细胞库，用实施例2制备的纳米药物递送系统ddtp nps孵育肿瘤细胞u87mg，ddtp nps中dox的浓度为0.65μmol/l，用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对细胞摄取量进行定性和定量分析，结果如图4、图5所示。
110.图4为肿瘤细胞u87mg对ddtp nps的摄取情况，图中标出的荧光来自ddtp nps中dox的红色荧光和dna5’端的6-fam绿色荧光，同时用蓝色dapi染细胞核。从图中可以用看出，在激光共聚焦显微镜下，用荧光标记的ddtp nps和dox荧光都随着时间的增加，且荧光强度越来越强，表明肿瘤细胞u87mg对ddtp nps的摄取与时间成正比关系。
111.图5为流式细胞仪定量测定肿瘤细胞u87mg对ddtp nps的摄取率，从图中可以用看出，8h时的细胞摄取率为88.2％，且摄取后其荧光强度有明显的位移，证明ddtp nps在肿瘤细胞中有较好的摄取率，且具有很强的靶向性。
112.实施例6
113.为了研究纳米药物递送系统ddtp nps在活体生物体内的药代动力学特性，以小鼠为研究对象，分别对10只u87mg肿瘤鼠(肿瘤体积：95
±
28mm3)注射实施例2制备的纳米药物递送系统ddtp nps，其中的dox相当于2mg/kg。每3只肿瘤鼠在注射后的0.15、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24和48h时间点取血。每100μl血浆用3ml三氯甲烷和甲醇混合液(v
三氯甲烷
:v
甲醇
＝4:1)进行萃取，并加入30μl内标安定(500ng/ml)，以15000rpm/分的转速离心3min，取上清液并吹干，再重新溶解于200μl的甲醇中，最后用hplc检测，ddtp nps在小鼠体内药代动力学曲线如图6所示。
114.根据图6，用药代动力学的方法研究ddtp nps中dox在体内血液及组织中分布情况可以看出，ddtp nps在体内有较好的代谢动力学曲线，半衰期为9.8h，表明ddtp nps在体内有较长的滞留量和时间，从而提高药物的靶向性，降低毒性。
115.实施例7
116.本技术实施例制备的靶向端粒酶纳米载药系统可用于制备肿瘤细胞或肿瘤组织的主动和被动纳米药物智能递送系统，dna-化疗药物联合用药系统，药物体内成像与跟踪、监测药物分布及代谢的肿瘤诊断制剂或精准治疗制剂以及抗肿瘤纳米药物试剂盒等抗肿瘤纳米药物产品。
117.使用原理及优点：本技术将小分子抗肿瘤药物装修在发卡dna上，并使用荧光基团-淬灭基团对发卡dna进行标记，然后发卡dna、多酚化合物、体内成像示踪剂分别与金属离子形成配位形成内核、表面和外围结构，以此构建以金属离子为骨架的纳米药物递送系统，用于运载发卡dna、小分子抗肿瘤药物、多酚、荧光染料等；当发卡dna在体内与肿瘤细胞中的端粒酶结合后，发卡式的结构打开，并释放小分子抗肿瘤药物，同时淬灭的荧光基团恢复荧光，实现精准诊断和准确释药；利用多酚清除氧自由基，增强机体抗氧化系统的功能，从而实现多酚和小分子抗肿瘤药物的协同用药，提高抗肿瘤小分子化疗药物的药效，减轻小分子抗肿瘤药物心脏毒性的毒副作用；多酚与金属离子配位所形成的配位化合物，可解
决dna纳米递送系统易代谢、溶解性差、稳定性差等问题，提高在体内的生物利用度，进而增强dna纳米载体在体内抗肿瘤的功能；利用多酚-荧光染料的跟踪，可实现监测药物在体内的代谢途径；本技术的纳米药物递送系统具有靶向性强、载药量高、稳定性好的优点，提高小分子抗肿瘤药物药效的同时，多酚和小分子抗肿瘤药物还具有协同药效，实现分子影像诊断与靶向化疗的同步治疗，达到恶性肿瘤精准治疗的目的。
118.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：包括具有配位能力的金属离子、靶向端粒酶发卡dna、小分子抗肿瘤药物、多酚化合物、体内成像示踪剂；所述靶向端粒酶发卡dna的茎部包括长度为5-8个碱基对的g-c碱基，所述小分子抗肿瘤药物装载在茎部发卡dna的茎部；所述靶向端粒酶发卡dna的中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基，所述具有配位能力的金属离子与发卡dna的中间环部配位；所述靶向端粒酶发卡dna的两端为荧光基团-淬灭基团。且所述具有配位能力的金属离子与装载小分子抗肿瘤药物的发卡dna形成纳米药物递送系统的内核；具有配位能力的金属离子与多酚化合物配位形成纳米药物递送系统的表面；具有配位能力的金属离子与体内成像示踪剂配位形成纳米药物递送系统的外围。2.根据权利要求1所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述荧光基团-淬灭基团选自1-氨基萘-8-羧酸(edans)-二甲氨基偶氮苯甲酰(dabsyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、6-羧基荧光素(6-fam)-羧基四甲基罗丹明(tamra)、德克萨斯红(texasred)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)、荧光素(fluoresein)-4-(4
’‑
二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(dabcyl)中的一种或任意种的组合。3.根据权利要求1所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述具有配位能力的金属离子选自二价铁离子、镁-锌离子、汞-银离子、钾离子、钠离子中的一种或任意种的组合。4.根据权利要求1所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述小分子抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、dox、dox-紫杉醇前药、dox-多西紫杉醇中的一种或任意种的组合。5.根据权利要求1所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述多酚化合物选自单宁酸、黄芩素、老鹳草、杨梅素、二氢杨梅素、杨梅黄素、杨梅黄酮中的一种或任意种的组合。6.根据权利要求1所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述体内成像示踪剂选自近红外荧光染料和多酚的共价偶联化合物、可溶性高分子和多酚的共价偶联化合物中的一种或任意种的组合。7.根据权利要求6所述的一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，其特征在于：所述近红外荧光染料选自icg、二氢卟吩ce6、亚甲蓝、罗丹明中的一种或任意种的组合；所述多酚选自多巴胺、5-羟基多巴胺中的一种或任意种的组合。8.一种靶向端粒酶纳米载药系统的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、设计靶向端粒酶发卡dna：合成茎部包括长度为5-8个碱基对g-c碱基、中间环部包括长度为15-20个碱基的a/c碱基的dna发卡结构，并在dna发卡结构的两端标记荧光基团-淬灭基团；s2、制备靶向内核：将小分子抗肿瘤药物溶液加入靶向端粒酶发卡dna中，并对两者进行混合，使小分子抗肿瘤药物插入到靶向端粒酶发卡dna的茎部，以此形成dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液；s3、制备内核配位溶液：在具有配位能力的金属离子过量的条件下，将dna-小分子抗肿瘤药物混合溶液加入具有配位能力的金属离子盐溶液中，并对两者进行混合，使dna-小分
子抗肿瘤药物混合溶液与具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的内核，该混合溶液为第一配位溶液；s4、制备表面复合溶液：将多酚化合物溶液加入到第一配位溶液中，并对两者进行混合，使多酚化合物溶液与过量的具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的表面，该混合溶液为第二配位复合溶液；s5、制备外围复合溶液：将体内成像示踪剂溶液加入到第二配位复合溶液中，并对两者进行混合，使体内成像示踪剂与剩余的具有配位能力的金属离子配位形成纳米药物递送系统的外围，该混合溶液为第三配位复合溶液；s6、纯化外围复合溶液：对第三配位复合溶液进行纯化，得到靶向端粒酶纳米药物递送系统。9.根据权利要求8所述的一种靶向端粒酶纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤s6中所述第三配位复合溶液采用透析袋在双蒸水溶液中透析的方式进行纯化。10.一种靶向端粒酶纳米载药系统在制备抗肿瘤纳米药物产品中的应用。

技术总结
本发明涉及抗肿瘤纳米药物技术领域，具体来说是一种靶向端粒酶纳米药物递送系统，包括具有配位能力的金属离子、靶向端粒酶发卡DNA、小分子抗肿瘤药物、多酚化合物、体内成像示踪剂；发卡DNA茎部为5-8个碱基对的G-C碱基，用于装载小分子抗肿瘤药物；中间环部为15-20个碱基的A/C碱基，与金属离子配位；两端为荧光基团-淬灭基团；金属离子与发卡DNA-小分子抗肿瘤药物、多酚化合物、体内成像示踪剂配位形成纳米药物递送系统的内核、表面、外围。本申请的纳米药物递送系统具有靶向性、载药量高、稳定性好，提高小分子抗肿瘤药物药效的同时，多酚和小分子抗肿瘤药物还具有协同药效，实现分子影像诊断与靶向化疗的同步治疗，达到恶性肿瘤精准治疗的目的。精准治疗的目的。精准治疗的目的。


技术研发人员：单玲玲 赵芳 卢一飞 徐冲 吴雷
受保护的技术使用者：宿州学院
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2022/5/25