与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体SH2结构域的制作方法

与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域
技术领域
1.本发明属于蛋白酪氨酸硫酸化检测技术领域。更具体地，涉及与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域。


背景技术：

2.酪氨酸蛋白硫酸转移酶(tyrosylprotein sulfotransferase，tpst)所催化的蛋白质酪氨酸硫酸化是作用于分泌蛋白和膜蛋白的一种常见的翻译后修饰类型。很多蛋白质经过酪氨酸硫酸化后才能被识别，从而参与蛋白质与蛋白质间的相互作用。tpst和酪氨酸硫酸化的蛋白质参与许多生理过程，如病毒入侵、发炎、凝血与不孕症等，与多种重要的生物活性密切相关。含有酪氨酸硫酸化的蛋白质还可影响细胞受体与相应配体相互作用的亲和力，从而造成机体氧化应激损伤或自身免疫性疾病。因此，对含酪氨酸硫酸化修饰的蛋白/肽的检测和富集在诸多研究工作中具有重要的意义。
3.但是，由于蛋白酪氨酸硫酸化在生物体内的丰度很低，且修饰的氨基酸残基种类较少，同时由于缺乏有效富集硫酸化酪氨酸(sulfated tyrosine，styr)的工具，导致目前报道的含styr的多肽或蛋白质以及styr位点的数量有限(潘露露等.蛋白酪氨酸硫酸化修饰的研究进展[j].生命科学,2017,29(2):7.)。anti-styr抗体虽具有特异性结合styr的能力，但其对styr的亲和力较弱。因此，开发一种对styr亲和力高，可以有效富含styr的多肽或蛋白质的产品或方法，对styr的研究具有重要意义。
[0004]
src同源区2(src homology 2，sh2)结构域是传递细胞内磷酸化修饰信号的主要元件，fyn sh2结构域也是其中之一。野生型的fyn sh2结构域能够结合磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine，ptyr)，但不结合styr。有研究以sh2-trm为模板，应用噬菌体展示技术，靶向含styr的多肽，开发出了可以结合styr的突变体sh2-58.6，sh2-1.8和sh2-3.1(lawrie,et al.acs chem biol.2021,16(8):1508-1517；ju,et al.acs chem biol.2021,16(8):1508-1517)。但是这些突变体对styr肽的亲和力仍然较弱，最强的突变体sh2-58.6的kd值也仅为188nm，不能高效富集含styr的肽。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域。
[0006]
本发明的第一个目的是提供一种与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域。
[0007]
本发明的第二个目的是提供一种编码所述变体sh2结构域的dna序列。
[0008]
本发明的第三个目的是提供一种含有所述dna序列的载体。
[0009]
本发明的第四个目的是提供一种含有所述变体sh2结构域的多肽。
[0010]
本发明的第五个目的是提供所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的产品中的应用。
[0011]
本发明的第六个目的是提供所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度的产品中的应用。
[0012]
本发明的第七个目的是提供一种检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法。
[0013]
本发明的第八个目的是提供一种分离含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法。
[0014]
本发明的第九个目的是提供一种检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度的方法。
[0015]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0016]
本发明通过对亲代sh2结构域的特定区域引入单个或多个氨基酸残基取代，获得了对含酪氨酸硫酸化修饰的肽的结合亲和性显著增强的变体sh2结构域。
[0017]
具体地，所述变体sh2结构域为变体sh2结构域1～5任一所示。
[0018]
其中，变体sh2结构域1的氨基酸序列如seq id no.3所示；变体sh2结构域2的氨基酸序列如seq id no.4所示；变体sh2结构域3的氨基酸序列如seq id no.5所示；变体sh2结构域4的氨基酸序列如seq id no.6所示；变体sh2结构域5的氨基酸序列如seq id no.7所示。
[0019]
本发明的变体sh2结构域可通过使用本领域技术人员已知的重组dna技术进行制备。例如，利用编码本发明所述变体sh2结构域的dna序列，利用合适的方式引入合适的表达载体(即重组表达载体)诱导表达获得。
[0020]
因此，本发明申请保护编码所述变体sh2结构域的dna序列。
[0021]
本发明还申请保护含有编码所述变体sh2结构域的dna序列的载体。
[0022]
本发明还提供了一种多肽，其包含多个sh2结构域，所述多个sh2结构域中包含至少一个本发明所述的变体sh2结构域。
[0023]
由于本发明所述变体sh2结构域表现出与styr的高亲和力，而本发明的变体sh2结构域可标记标签以利于其在多种分析中的检测。因此，本发明还申请保护所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的产品中的应用。
[0024]
本发明还申请保护所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度的产品中的应用。
[0025]
本发明还申请保护所述变体sh2结构域在体外或体内的肽或蛋白中结合或检测styr残基的应用。
[0026]
本发明还申请保护所述变体sh2结构域在制备用于结合或检测体外或体内的肽或蛋白中的styr残基的产品中的应用。
[0027]
本发明所述可标记变体sh2结构域的标签包括但不限于放射性标记、细胞毒素标记或荧光标记。本发明的sh2单体还可与载体一起提供，所述肽可以通过共价或非共价偶联至固相载体。所述肽可直接或间接用标签标记，所述标签选自但不限于生物素、荧光素、酶、辣根过氧化物酶。
[0028]
具体地，所述产品包含结合至亲和性柱或结合在侧流试纸条上的变体sh2结构域。
[0029]
本发明还提供了一种检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法，将样品接触本发明任一所述变体sh2结构域，如果样品中存在含酪氨酸硫酸化修饰的肽，则会形成含酪氨酸硫酸化修饰肽/变体sh2结构域复合物，检测复合物是否形成即可检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽是否存在。
[0030]
本发明还提供了一种分离含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法，将样品接触本发明任一所述变体sh2结构域，如果样品中存在含酪氨酸硫酸化修饰的肽，则会形成含酪氨酸硫酸化修饰肽/变体sh2结构域复合物，从复合物中释放含酪氨酸硫酸化修饰的肽，即可对含酪氨酸硫酸化修饰的肽进行分离。
[0031]
进一步地，在分离含酪氨酸硫酸化修饰的肽的基础上，可通过检测所释放的含酪氨酸硫酸化修饰的肽的数量来检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽在样品中的浓度。
[0032]
此外，还可通过检测样品中的硫酸化水平检测酪氨酸硫酸转移酶活性。
[0033]
具体地，本发明所述检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽在样品中的浓度的方法包括以下步骤：
[0034]
s1.将本发明的变体sh2结构域固定在树脂上；
[0035]
s2.将样品流经具有结合的变体sh2结构域的树脂；
[0036]
s3.通过添加去除变体sh2结构域结合含酪氨酸硫酸化修饰肽的能力的溶剂，释放结合到树脂上的任何含酪氨酸硫酸化修饰的肽，从而产生洗脱组份；
[0037]
s4.测定在洗脱组份中存在的含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度。
[0038]
所述含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度可通过高效液相色谱(hplc)进行确定。
[0039]
本发明还提供了一种用于检测受试者体内蛋白硫酸化水平的方法，通过将受试者的组织样品接触本发明所述变体sh2结构域，以检测样品中含有的硫酸化蛋白，根据样品硫酸化水平检测酪氨酸硫酸转移酶活性。
[0040]
所述组织样品可以为组织裂解物、血液或其它体液。
[0041]
除通过检测组织裂解液、血液或其它体液中的硫酸化蛋白检测受试者体内蛋白硫酸化水平外，也可通过使用带有荧光标记的变体sh2结构域，在组织切片上造影硫酸化的蛋白；或使用基于elisa的变体sh2结构域组合目标蛋白特异性抗体，以分析其在正常或疾病组织/细胞中的硫酸化等，来检测组织的蛋白硫酸化水平。同时，为了检测样品中的sh2变体，可用探针分子标记。
[0042]
styr阳性细胞的检测也可通过探针进行，所述探针至少包括一个包含变体sh2结构域的多肽和一个造影组分。
[0043]
具体地，所述探针可用可检测的标记物进行标记，其可允许用于检测styr阳性细胞的位置，可允许跟随styr阳性细胞移动和发展。
[0044]
探针的造影组分一般包含标签，所述标签可以是适于体内造影使用的那些分子，而标记的方法是本领域技术人员熟知的。
[0045]
sh2单体探针可在检测前进行可检测的标记，可以使用可结合杂交产物的可检测标签；这些可检测标签包括但不限于具有可检测的物理或化学性质且在免疫分析领域已经良好开发的任何材料。
[0046]
用于本发明的标签可以是通过显微镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何组合物。
[0047]
此外，还可以通过制备和使用能识别本发明所述任一变体sh2结构域的单克隆抗体以检测样品中是否存在变体sh2结构域。
[0048]
本发明所述具有对styr超高亲和性的sh2变体可被用作抗-styr抗体的替代品，被用于使用抗-styr抗体的研究领域，例如蛋白质印迹、免疫荧光、蛋白质组学(硫酸蛋白/肽
的富集)等。
[0049]
本发明具有以下有益效果：
[0050]
本发明通过对亲代sh2结构域的特定区域引入单个或多个氨基酸残基取代，获得了对含styr的肽结合亲和性显著增强的变体sh2结构域，利用所述变体sh2结构域可以有效地对含styr的肽进行富集，可用于检测样品中是否存在含styr的肽以及用于检测样品中含styr的肽的浓度，或通过检测样品中蛋白的硫酸化程度检测酪氨酸硫酸转移酶活性等。此外，所述变体sh2结构域还可被用作抗-styr抗体的替代品，用于使用抗-styr抗体的研究，例如蛋白质印迹、免疫荧光、蛋白质组学、硫酸蛋白/肽的富集等。
附图说明
[0051]
图1为以sh2-58.6为模板构建的sh2文库中选择的11个残基位点的示意图。
[0052]
图2为通过bli实验测定的野生型和变体sh2结构域与含styr的肽的结合曲线和kd值；其中，图a为变体sh2结构域1的结合曲线；图b为变体sh2结构域2的结合曲线；图c为变体sh2结构域3的结合曲线；图d为变体sh2结构域4的结合曲线；图e为变体sh2结构域5的结合曲线；图f为sh2-58.6的结合曲线；图g为sh2-1.8的结合曲线；图h为sh2-3.1的结合曲线。
具体实施方式
[0053]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0054]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0055]
本发明所述“含络氨酸硫酸化修饰的肽”，即“含styr的肽”或“含styr肽”，是指含有styr的氨基酸序列分子，包括多肽或蛋白质。
[0056]
本发明使用的术语"亲代sh2结构域"包括任何真核sh2结构域或多肽，其中该多肽具有与源自含有sh2结构域的人蛋白的sh2结构域至少约60％序列同一性。
[0057]
术语“亲代sh2结构域”还包括人工制备的序列以及病毒sh2结构域。例如，可以基于一种或多种哺乳动物sh2结构域序列产生或制备人工sh2结构域序列作为亲代sh2结构域，其将代表一种典型的sh2结构域序列，但是与任何哺乳动物sh2都不相同。
[0058]
术语"片段"指具有比本发明所示氨基酸残基序列的肽更短的氨基酸残基序列的任何受试肽。
[0059]
视具体情况，术语“分离的肽”或“分离的dna”可被定义为肽或dna分子，其基本上与可能是天然伴随着所述肽或dna的其它细胞组分分离；该术语包括(没有限制)重组或克隆的dna分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
[0060]
术语“配体”表示结合另一分子或目标的分子。
[0061]
术语“肽”或“多肽”定义为氨基酸残基的链，通常具有定义的序列；本发明使用的“肽”与“多肽”、“肽”和“蛋白”互相包括。
[0062]
术语“变体sh2结构域”、“sh2变体”、“sh2单体”、"sh2结构变体"无差别地被用于指为了本发明的亲和性增强而引入取代的亲代sh2结构域。
[0063]
实施例1 fyn的变体sh2结构域的设计与鉴定
[0064]
本发明通过将人的fyn sh2结构域上特定区域的氨基酸残基随机替换为20种天然氨基酸之一，来鉴定能够结合含styr的肽的变体sh2结构域。
[0065]
人fyn sh2结构域所有氨基酸残基数根据uniprot数据库条目(entry)fyn_human的全长同种型。将编码ala139和gly249之间(其氨基酸序列见seq id no.1)的野生型fyn sh2结构域的基因亚克隆入pdest15载体(invitrogen canada inc.)。
[0066]
通过quikchange ii定点突变试剂盒(qiagen inc.)将seq id no.1中的三个半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基(避免在噬菌体筛选过程中，半胱氨酸残基相互作用而形成二硫键，导致可能的筛选失败)，突变产生了seq id no.2所示的蛋白序列。
[0067]
将seq id no.2所示蛋白质的编码基因融合至编码m13噬菌体主外壳蛋白的基因。通过对与styr结合的sh2 domain区域的位点进行突变，形成多样性文库，用于高亲和力突变体的筛选。
[0068]
用kunkel方法(具体方法参见：sidhu等，2000，method enzymol.vol.328，pp.333)在如下详述的11个氨基酸位点上进行同时随机化，这些位点可连续编号为位点1至位点11，如图1所示。这11个位点对应于野生型全长人fyn sh2的残基arg176(位点1)、glu177(位点2)、ser178(位点3)、glu179(位点4)、thr180(位点5)、thr181(位点6)、tyr185(位点7、ser186(位点8)、his202(位点9)、tyr203(位点10)、lys204(位点11)。在seq id no.1中，这11个位点如下：arg38(位点1)、glu39(位点2)、ser40(位点3)、glu41(位点4)、thr42(位点5)、thr43(位点6)、tyr47(位点7)、ser48(位点8)、his64(位点9)、tyr65(位点10)、lys66(位点11)。突变产生了fyn的sh2结构域库，其在11个位点上含有随机取代的氨基酸残基。
[0069]
本发明使用噬菌体展示方法来在m13噬菌体表面上展示这些引入取代的fyn sh2结构域。利用带生物素标记的styr肽进行噬菌体筛选，所述styr肽的序列如下(seq id no.11)所示：
[0070]
带生物素标记的styr肽：生物素-a-a-e-p-q-styr-e-e-i-p-i-y-l
[0071]
其中，a表示6-氨基乙酸，styr表示硫酸化酪氨酸；
[0072]
本发明通过高通量测序分析了利用带生物素标记的styr肽筛选文库时，各变体sh2结合域的变化，结合实验验证的方式鉴定结合至styr肽的变体sh2结构域，获得了5种fyn的变体sh2结构域。所得变体sh2结构域在亲代sh2结构域特定区域中的11个氨基酸位点的残基如表1所示。在每种变体中，至少一个位点含有对野生型残基的氨基酸取代。
[0073]
表1变体sh2结构域的突变序列
[0074][0075]
实施例2变体sh2结构域序列
[0076]
在以下的描述中，使用位点编号具体指明被取代的残基。例如，e2n表示对野生型构建体进行位点2的glu取代为asn；e2c/t5r/t6r/s8v/k11l表示组合的5个取代。通过对不含半胱氨酸的fyn的sh2结构域野生型构建体(seq id no.2)进行取代，获得了以下5个变体sh2结构域，5个变体sh2结构域的位点1和位点11间的氨基酸序列如下所示：
[0077]
变体sh2结构域1：e2n/s3q/e4p/t5g/t6v/s8v/k11r，其氨基酸序列如下(seq id no.3)所示：arg asn gln pro gly val lys gly ala tyr val leu ser ile arg asp trp asp asp met lys gly asp his val lys his tyr arg
[0078]
变体sh2结构域2：e2c/t5r/t6v/y7h/s8v/k11l，其氨基酸序列如下(seq id no.4)所示：arg cys ser glu arg val lys gly ala his val leu ser ile arg asp trp asp asp met lys gly asp his val lys his tyr leu
[0079]
变体sh2结构域3：e2c/e4a/t5r/t6v/y7h/s8v/k11l，其氨基酸序列如下(seq id no.5)所示：arg cys ser ala arg val lys gly ala his val leu ser ile arg asp trp asp asp met lys gly asp his val lys his tyr leu
[0080]
变体sh2结构域4：e2q/e4a/t5r/t6v/y7f/s8v/k11l，其氨基酸序列如下(seq id no.6)所示：arg gln ser ala arg val lys gly ala phe val leu ser ile arg asp trp asp asp met lys gly asp his val lys his tyr leu
[0081]
变体sh2结构域5：e2c/t5r/t6r/s8v/k11l，其氨基酸序列如下(seq id no.7)所示：arg cys ser glu arg arg lys gly ala tyr val leu ser ile arg asp trp asp asp met lys gly asp his val lys his tyr leu
[0082]
实施例3变体sh2结构域与含styr肽在体外的亲和性
[0083]
本发明利用合成的含styr的肽，即生物素-a-a-e-p-q-styr-e-e-i-p-i-y-l，对实施例2所示变体sh2结构域，以及已报道的sh2-58.6、sh2-1.8和sh2-3.1(序列依次如seq id no.8～10所示)变体进行了结合分析。
[0084]
在lb培养基(emd chemicals)中培养大肠杆菌bl21(de3)菌株，通过过表达来生产
出每种变体和野生型sh2结构域。通过0.5mm异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达，细胞培养物在18℃下培育20小时。在含20mm磷酸钠、0.1m nacl、20mm咪唑、1mg/ml溶菌酶和1％triton-x 100，ph为7.8的缓冲溶液中，离心收集细胞，并在冰上破碎。用ni-nta琼脂糖树脂(qiagen inc.)按照制造商的说明进行亲和纯化。所得蛋白保存至pbt缓冲液(0.05％吐温20，0.5％牛血清白蛋白，磷酸缓冲盐溶液)。
[0085]
octet red96 system(fortebio)用于生物膜干涉实验分析变体sh2结构域与含styr肽的亲和性强度，使用链霉亲和素生物传感器(货号：18-5019)进行测量。合成的含有styr的肽固定于生物传感器。变体sh2结构域的浓度梯度依次为300nm、150nm和0nm用于测量。
[0086]
通过bli实验测定的野生型及变体sh2结构域与含styr肽的结合曲线和kd值如图2所示，kd值总结汇总于表2。其中，图2a为变体sh2结构域1(图中简称为变体1)与含styr肽的结合曲线；图2b为变体sh2结构域2与含styr肽的结合曲线；图2c为变体sh2结构域3与含styr肽的结合曲线；图2d为变体sh2结构域4与含styr肽的结合曲线；图2e为变体sh2结构域5与含styr肽的结合曲线；图2f为sh2-58.6与含styr肽的结合曲线；图2g为sh2-1.8与含styr肽的结合曲线；图2h为sh2-3.1与含styr肽的结合曲线；由于野生型fyn sh2不与含styr的肽结合，故无结合曲线。
[0087]
kd值越小代表亲和力越高，由图2和表2所示结果可知，本发明所述变体sh2结构域(变体sh2结构域1～5)与含styr肽的亲和力明显强于已经报道的sh2突变体(sh2-58.6，sh2-1.8和sh2-3.1)，与三个对照中相对亲和力最高的sh2-58.6相比，本技术变体sh2结构域1～5的亲和力提高了22％～48％，可有效地对含styr的肽进行富集，可用于检测、分离含styr肽或用于制备检测、分离含styr肽的产品。
[0088]
表2野生型及变体sh2结构域与含styr肽的kd值
[0089][0090][0091]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.3～7任一所示。2.一种编码权利要求1所述变体sh2结构域的dna序列。3.一种含有权利要求2所述dna序列的载体。4.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含多个sh2结构域，所述多个sh2结构域中的至少一个为权利要求1所述变体sh2结构域。5.权利要求1所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的产品中的应用。6.权利要求1所述变体sh2结构域在检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度或用于制备检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度的产品中的应用。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述产品中包含结合至亲和性柱或结合在侧流试纸条上的变体sh2结构域。8.一种检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法，其特征在于，将样品接触权利要求1所述变体sh2结构域，如果样品中存在含酪氨酸硫酸化修饰的肽，则会形成含酪氨酸硫酸化修饰肽/变体sh2结构域复合物，检测复合物是否形成即可检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽是否存在。9.一种分离含酪氨酸硫酸化修饰的肽的方法，其特征在于，将样品接触权利要求1所述变体sh2结构域，如果样品中存在含酪氨酸硫酸化修饰的肽，则会形成含酪氨酸硫酸化修饰肽/变体sh2结构域复合物，从复合物中释放含酪氨酸硫酸化修饰的肽，即可对含酪氨酸硫酸化修饰的肽进行分离。10.一种检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽的浓度的方法，其特征在于，在权利要求9所述方法的基础上，再通过检测所释放的含酪氨酸硫酸化修饰的肽的数量来检测含酪氨酸硫酸化修饰的肽在样品中的浓度。

技术总结
本发明公开了与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体SH2结构域。本发明通过对亲代SH2结构域的特定区域引入单个或多个氨基酸残基取代，获得了对含sTyr的肽结合亲和性增强的变体SH2结构域，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3～7任一所示。利用本发明所述变体SH2结构域，可以有效地对含sTyr的肽进行富集与检测，还可用于检测样品中含sTyr的肽的浓度，或通过检测样品中蛋白的硫酸化程度检测酪氨酸硫酸转移酶的活性等。此外，所述变体SH2结构域还可被用作抗-sTyr抗体的替代品，用于使用抗-sTyr抗体的研究，例如蛋白质印迹、免疫荧光、蛋白质组学、硫酸蛋白/肽的富集等。硫酸蛋白/肽的富集等。硫酸蛋白/肽的富集等。


技术研发人员：李磊 赵东平 周长景
受保护的技术使用者：青岛肿瘤研究院
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2022/5/25