一种二价核酸适配体及其设计方法

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种二价核酸适配体及其设计方法。


背景技术：

2.核酸适配体具有特异性识别能力，从而直接或者间接调控蛋白的功能，对于生物体的活性调控具有很好的研究价值。凝血级联反应中的相关蛋白凝血酶是适配体研究中较早用到的一种受体，现有的适配体主要是经过指数富集配体系统进化技术(selex技术)进行筛选，或在已有的单价适配体基础上改进得到具有更高亲和力的二价或者多价适配体。
3.但是，现有技术中，结合凝血酶的单价适配体存在亲和力较低的缺陷，在二价适配体设计时又忽略了分子中适配体间的连接刚性、距离及空间取向，使得与受体结合过程中伴随构象的急剧变化，从而导致构象自由度极大降低，熵剧烈减少，亲和力降低。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种核酸半刚性二价适配体，以解决现有核酸适配体与受体结合过程中存在构象急剧变化，从而导致构象自由度极大降低、熵剧烈减少、亲和力降低的问题。
5.本发明的技术方案是一种二价核酸适配体，包括单价适配体a和单价适配体b，所述单价适配体a与单价适配体b为相同或者不同的单价适配体；单价适配体a的双链端延长形成双链延长臂a，单价适配体b的双链端延长形成双链延长臂b，延长臂a和延长臂b之间通过双链中间桥连接；所述延长臂a、中间桥和延长臂b形成二级结构为u型的连接部分，连接部分将单价适配体a和单价适配体b进行连接组装；所述中间桥与延长臂a的连接处为loop或互相排斥的两段末端短链；所述中间桥与延长臂b的连接处为loop或互相排斥的两段末端短链。
6.进一步的，所述的二价核酸适配体为至少1条单链核酸组装而成。
7.优选的，所述的二价核酸适配体为1～3条单链核酸组装而成。
8.进一步优选的，所述的的二价核酸适配体为1条单链核酸组装而成。
9.进一步的，所述loop的碱基为3～6个碱基。
10.具体的，所述断开的单链的游离碱基为相同的2～5个碱基。
11.特别的，所述核酸适配体中，碱基a和t/u的占比为40～60％，碱基c和g的占比为40～60％。尤其应注意碱基c和g的含量不要太高，否则可能形成g-四链体或i-motif。优选的，所述核酸适配体中，碱基a和t/u的占比约为50％，碱基c和g的占比约为50％。
12.具体的，所述单价适配体a和单价适配体b分别为凝血酶(t)上的纤维蛋白原结合位点和肝素结合位点的单价适配体。
13.进一步的，所述凝血酶的二价核酸适配体由核苷酸序列如seq id no.1～3所示单链核酸组装而成。
14.seq id no.1单链核酸：aagtccgtggtagggcaggttggggtgacttagatgaggcacgtcccg
ctc；
15.seq id no.2单链核酸：cgagtataggaatggtgcgtaggttggtgtggttggggcgcacaaaa；
16.seq id no.3单链核酸：aacattcctatactcggagcgggacgtgaactacctcatct。
17.具体的，所述凝血酶的二价核酸适配体组装所用缓冲液为tae/mg
2+
+100mm k
+
；所用seq id no.1～3所示单链核酸的摩尔比为1:1:1；所述缓冲液tae/mg
2+
+100mm k
+
的配方为：40mm三羟甲基氨基甲烷，2mm乙二胺四乙酸二钠，20mm冰乙酸，1.25mm四水乙酸镁和100mm氯化钾，ph 7.4。
18.其中，所述凝血酶的二价核酸适配体组装的反应程序为：95℃反应5min，65℃反应30min，50℃反应30min，37℃反应30min，25℃反应30min，4℃反应2h。
19.具体的，所述单价适配体a与单价适配体b相同，二者通过半刚性链连接，靶标为荧光素硫黄素t(tht)。
20.进一步的，所述荧光素硫黄素t(tht)的二价核酸适配体由核苷酸序列如seq id no.4和5所示单链核酸组装而成。
21.seq id no.4单链核酸：ggcgcgaggaaggaggucugaggaggucacugcgcc uuaugcuagcugucaauauuu，斜体为tht的单价适配体；
22.seq id no.5单链核酸：ggcgcgaggaaggaggucugaggaggucacugcgcc uuauauugacagcuagcauuu，斜体为tht的单价适配体。
23.具体的，所述荧光素硫黄素t(tht)的二价核酸适配体组装所用缓冲液为：40mm(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(hepes)，100mm氯化钾，1mm氯化镁，ph 7.4；seq id no.4和5所示单链核酸的摩尔比为1:1。
24.具体的，所述荧光素硫黄素t(tht)的二价核酸适配体组装程序为：85℃反应2min，65℃反应5min，50℃反应5min，45℃反应5min，37℃反应5min，25℃反应5min，20℃反应5min。
25.在组装二价适配体是，可根据需要调整组装用的单链数量，可以是1条，也可以是多条。其中，采用一条单链的效果为最好。
26.u型二价适配体中，当中间桥与延长臂a或延长臂b连接处，形成一条链不连接的状态时，游离的单链碱基采用相同的碱基种类，可以保持一定排斥力，使延长臂a或延长臂b靠近受体(靶标)。延长臂a、中间桥和延长臂b连接处，一端形成loop，另一端为非闭合链，可保证所形成的近u型二级结构为半刚性，提高与目标分子的结合效率。
27.本发明还提供了设计所述二价核酸适配体的方法，包括如下步骤：(a)找出两个适配体(a与b)与靶标(或根据deepmind公司的alphafold算法得到)分别作用的晶体结构；(b)设计延长单价适配体a的核酸双链延长臂a；(c)设计延长单价适配体b的双链延长臂b；(d)设计合适的核酸，使其长度和空间位置均能与延长臂a和延长臂b结合，长度连接延长臂a和延长臂b，该部分叫中间桥命名为中间桥；(e)连接延长臂a、中间桥和延长臂b，并保证中间桥与延长臂a或延长臂b的连接处有一段loop或/和有一条链不连接呈断开状态，断开的单链的游离碱基互相排斥，使每段核酸的构象在构建多价适配体前后的构象均保持不变，得到多价适配体的设计单元，即二价适配体。
28.本发明的有益效果：本发明提供了一种二价核酸适配体的构建方式：(1)柔性连接能带给适配体足够的自由度、最大程度调节其方向并结合目标受体，焓变有利。然而，这种
结合方式使连接部分固定为某一特定构象并产生巨大的熵损失，使整体自由度减少。因此，柔性连接常导致结合过程焓变有利，但仅能小幅度提高结合力。(2)适配体的方向：错误取向的刚性连接导致适配体不能有效地结合蛋白质，产生焓损失，亲和力不会大幅提高。(3)适配体连接部分的作用：在适配体和蛋白质结合前就能刚性地预组织与目标蛋白质作用的适配体，热力学有利。
29.本发明设计的核酸二价适配体与蛋白质、小分子等受体结合时具有明确方向和距离，具有很高的亲和力和特异性，因此可在核酸与相应蛋白质、病原微生物、小分子等靶标相互作用的医学、检验、生物学等领域发挥应用价值。并且本发明的设计方法简单、普适性强、合成方法反应条件温和，不需高温高压，操作简单，原料廉价易得，产物收率高。
30.本发明为设计多价核酸适配体提供一种新思路。基本本发明的设计思路，可根据靶标分子的晶体结构，进一步设计出亲和力高、结合度高、稳定性好的多价核酸适配体。
附图说明
31.图1、三维结构图，cd-re31和hd22为与凝血酶(t)上的纤维蛋白原结合位点和肝素结合位点结合的单价核酸适配体；hd22-凝血酶复合物(式ⅰ)和re31-凝血酶复合物(式ⅱ)，前述两种适配体与凝血酶分子同时作用得到式ⅲ；将hd22和re31适配体的双链部分延长，然后使用dna双链将两个单独的适配体连接得到二价核酸适配体(式v)；式ⅳ为二价核酸适配体与靶标凝血酶(t)复合物。
32.图2、三条单链核酸组装后的示意图；其中tba-1、tba-2u和tba-3分别seq id no.1～3所示单链核酸；0/0
a2
/0
a4
为本发明组装的二价适配体。
33.图3、tht与corn的晶体结构如vi所示；通过corn(式vii)，通过延伸corn的双链端，再通过连接臂连接，得到bcorn的二级结构(式viii)。
34.图4、两条单链核酸组装后的配对示意图。
35.图5、6％非变性聚丙烯酰胺电泳分析适配体与凝血酶的结合。对照二价适配体序列bapt 1:ggttggtgtggttggtttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact(seq id no.6)；对照二价适配体序列bapt 2:agcagcacagaggtcagatgggttggtgtggttggtgagaccttgcatgcgacttggtgagcacgtgagaagtccgtggtagggcaggttggggtgactcctatgcgtgctaccgtgaa(seq id no.7)；0/0
a2
/0
a4
为本发明组装的二价适配体；apt：适配体；t：凝血酶。
36.图6、实时光散射检测3nm适配体(tba15、hd22、bapt 1、bapt 2、0/0
a2
/0
a4
)分别抑制3nm凝血酶活性的能力。
37.图7、原子力显微镜表征二价适配体与凝血酶结合物的形貌图，(a)为本发明的刚性二价适配体0/0
a2
/0
a4
，(b)为中间柔性链连接的二价适配体，(c)为selex技术筛选分离得到的刚性二价适配体bapt2。
38.图8、corn和bcorn分别与tht的亲和力值。
具体实施方式
39.下述实施例中用到的主要试剂或仪器的来源：
40.主要仪器：美国bruker原子力显微镜、microcal itc-200型等温滴定量热仪(ge healthcare)、日立f-7000型荧光分光光度计、hoefer se600垂直电泳仪
41.主要试剂：所有dna均购自上海生工生物工程有限公司；所有rna均购自上海缔纳生物科技有限公司；stains-all染料、tht购自sigma aldrich；纤维蛋白原购自上海源叶生物有限公司，多聚赖氨酸购自美国ted pell公司，其余用于缓冲液的试剂购自上海生工生物有限公司、上海源叶生物有限公司、北京鼎国昌盛生物有限公司、四川成都科龙试剂厂。
42.实施例1凝血酶二价核酸适配体的组装
43.根据已知的凝血酶蛋白和适配体晶体结构(三维模拟结构如图1所示)，将这两种分子的晶体结构进行模拟对接，cd-re31和hd22这两个单价适配体折叠形成稳定的g-四链体结构，分别与凝血酶(t)上的纤维蛋白原结合位点和肝素结合位点结合形成hd22-凝血酶(式ⅰ)和re31-凝血酶(式ⅱ)，将这两种单价适配体与凝血酶作用形成式ⅲ的复合物结构，将hd22适配体的双链部分延长，然后使用dna双链将两个单独的适配体连接(式ⅳ)，形成一个由中间刚性结构连接的刚性二价适配体。中间连接部分的刚性结构、可调节方向的单链环和u型右下角互相排斥的短单链的设计保证适配体与蛋白质结合的理想距离，维持适宜的空间取向并调整到与蛋白质不同结合位点的最佳位置，作用前后构象不明显改变，具有最大的焓减小和最小的熵损失，多价作用与单价相比，会减少焓变降低值，而熵变不变，因而吉布斯自由能更低，热力学有利。
44.基于前述分析和思路，具体的操作如下：合成seq id no.1～3所示单链核酸，然后将其组装起来。组装所用缓冲液为tae/mg
2+
+10mm k
+
；所用seq id no.1～3所示单链核酸的摩尔比为1:1:1；所述缓冲液tae/mg
2+
+100mm k
+
的配方为：40mm三羟甲基氨基甲烷，2mm乙二胺四乙酸二钠，20mm冰乙酸，1.25mm四水乙酸镁和10mm氯化钾，ph7.4。组装的反应程序为：95℃反应5min，65℃反应30min，50℃反应30min，37℃反应30min，25℃反应30min，4℃反应2h。组装后的二价核酸适配体的配对情况如图2所示。
45.实施例2荧光素硫黄素t(tht)二价核酸适配体的组装
46.根据已知的荧光素硫黄素t(tht)与其rna适配体(corn)的晶体结构，设计tht的rna二价适配体(bcorn)，提高该荧光小分子与rna适配体的结合能力。tht与corn的晶体结构如vi所示(图3)，基于该结构，通过corn(式vii)设计得到bcorn的二级结构(式viii)。
47.基于前述分析和思路，具体的操作如下：合成seq id no.4和5所示单链核酸，然后将其组装。组装所用缓冲液为：40mm(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(hepes)，100mm氯化钾，1mm氯化镁，ph 7.4；seq id no.4和5所示单链核酸的摩尔比为1:1。组装程序为：85℃反应2min，65℃反应5min，50℃反应5min，45℃反应5min，37℃反应5min，25℃反应5min，20℃反应5min。组装后的二价核酸适配体的配对情况如图4所示。
48.实施例3凝血酶不同适配体的结合率比较
49.将单价适配体或已组装的二价适配体与等摩尔比的凝血酶在含k
+
的缓冲液和25℃温度下孵育2小时可得到适配体与凝血酶结合物。采用6％非变性聚丙烯酰胺电泳分析适配体与凝血酶的结合效果，如图5所示。采用本发明设计的刚性二价适配体与凝血酶的结合率最高，为71％。
50.实施例4凝血酶不同适配体的亲和力比较
51.等温滴定量热法滴定时设置样品池温度为25℃，滴定次数为20滴，间隔时间为120秒，注射器转数1000r/min，系统补偿功率一般设为5μcal/s，正式开始滴定前的基线运行时间选择60秒。滴定浓度分别为70μm tba15(seq id no.8：ggttggtgtggttgg)，滴定5μm凝血
酶，30μm hd22(seq id no.9：agtccgtggtagggcaggttggggtgact)滴定2μm凝血酶，25μm bapt 1滴定2μm凝血酶，20μm刚性二价适配体(bapt 2、0/0
a2
/0
a4
)滴定2μm凝血酶。不同适配体与凝血酶的结合亲和力测定结果如表1所示。采用本发明设计的刚性二价适配体与凝血酶的亲和力最高，为2.8
±
0.2nm。
52.表1亲和力kd值
53.适配体kd(nm)tba15422.0
±
8.2hd22234.8
±
14.5bapt 114.2
±
0.9bapt 27.8
±
0.70/0
a2
/0
a4
2.8
±
0.2
54.实施例5凝血酶不同适配体抑制凝血酶活性的能力比较
55.0.30mg/ml纤维蛋白原制备：称取0.03g纤维蛋白原，纯化水定容至10ml得到10倍浓缩液，再稀释十倍后使用，纤维蛋白原溶液现配现用并在四度保存。
56.3nm适配体(tba15、hd22、bapt 1、bapt 2、0/0
a2
/0
a4
)分别与3nm凝血酶混合于tae/mg
2+
+100mm k
+
缓冲液中；在缓冲体系环境下，使用相同体积的一级水代替适配体与3nm凝血酶混合作为空白对照，最后将这几组混合液均于25℃孵育0.5小时后立即开始测定荧光信号变化。
57.采用时间扫描，激发波长(ex)和发射波长(em)均设为650nm，激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为5nm，pmt电压为700v，响应时间2.0s，共扫描1200s，实时光散射测定的不同适配体抑制凝血酶活性的能力如图6所示。采用本发明设计的刚性二价适配体抑制凝血酶活性的能力最强。
58.实施例6原子力显微镜表征二价适配体与凝血酶结合物构象
59.已组装的二价适配体与等摩尔比的凝血酶在含k
+
的缓冲液和25℃温度下孵育2小时可得到适配体与凝血酶结合物作为待测样品。
60.滴加20μl 5μg/μl多聚赖氨酸溶液在云母表面，10分钟后用氮气吹干并用一级水洗两次表面；取5μl稀释至30nm的待测样品，滴在云母表面，分散均匀使样品吸附，静置3至5分钟；最后滴加20μl缓冲液于样品表面，将此样品放置于原子力显微镜下扫描，结果如图7所示。
61.实施例7tht不同适配体的亲和力比较
62.1.0μm的tht与不同浓度的bcorn(0.0625,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0μm)作用，测定在20℃时最大发射波长为487nm的荧光值。缓冲溶液：100mm氯化钾,1mm氯化镁，ph 7.4；荧光分光光度计型号为日立f-7000fl；最大激发波长：450nm。数据根据graphpad prism 9和公式hill equation拟合处理，计算得到亲和力值kd[参考文献：zhang,z.；oni,o.；liu,j.new insights into a classic aptamer:binding sites,cooperativity and more sensitive adenosine detection.nucleic acids research,2017,45(13):7593-7601]。corn和bcorn与tht的亲和力值分别为1.9μm和5.2μm，结果如图8所示。
[0063]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通
过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种二价核酸适配体，其特征在于，包括单价适配体a和单价适配体b，所述单价适配体a与单价适配体b为相同或者不同的单价适配体；单价适配体a的双链端延长形成双链延长臂a，单价适配体b的双链端延长形成双链延长臂b，延长臂a和延长臂b之间通过双链中间桥连接；所述延长臂a、中间桥和延长臂b形成二级结构为u型的连接部分，连接部分将单价适配体a和单价适配体b进行连接组装；所述中间桥与延长臂a的连接处为loop或互相排斥的两段末端短链；所述中间桥与延长臂b的连接处为loop或互相排斥的两段末端短链。2.如权利要求1所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述的二价核酸适配体为至少1条单链核酸组装而成。3.如权利要求1所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述loop的碱基为3～6 个碱基；所述断开的单链的末端碱基为相同的2～6个碱基。4.如权利要求1~3任一项所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述单价适配体a和单价适配体b分别为凝血酶（t）上的纤维蛋白原结合位点和肝素结合位点的单价适配体。5.如权利要求4所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述的二价核酸适配体由核苷酸序列如seq id no.1～3所示单链核酸组装而成。6.如权利要求5所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述凝血酶的二价核酸适配体组装所用缓冲液为tae/mg
2+ + 10 mm k
+
；所用seq id no.1～3所示单链核酸的摩尔比为1:1:1；所述缓冲液tae/mg
2+ + 100 mm k
+
的配方为：40 mm三羟甲基氨基甲烷，2 mm乙二胺四乙酸二钠，20 mm冰乙酸，1.25 mm四水乙酸镁和10 mm氯化钾，ph 7.4。7.如权利要求6所述的二价核酸适配体，其特征在于，组装的反应程序为：95 ℃反应5 min，65 ℃反应30 min，50 ℃反应30 min，37℃反应30 min，25 ℃反应30 min，4℃反应2 h。8.如权利要求1~3任一项所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述单价适配体a和单价适配体b相同，靶标为荧光素硫黄素t（tht）。9.如权利要求8所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述二价核酸适配体由核苷酸序列如seq id no.4和5所示两条单链核酸组装而成。10.如权利要求9所述的二价核酸适配体，其特征在于，所述二价核酸适配体组装所用缓冲液为：40 mm (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)（hepes），100 mm 氯化钾，1 mm 氯化镁，ph 7.4；seq id no.4和5所示单链核酸的摩尔比为1:1。11.如权利要求10所述的二价核酸适配体，其特征在于，组装程序为：85 ℃反应2 min，65 ℃反应5 min，50℃反应5 min，45 ℃反应5 min，37℃反应5 min，25℃反应5 min，20 ℃反应5 min。12.权利要求1～11任一项所述二价核酸适配体的设计方法，包括如下步骤：(a) 找出两个单价适配体（a与b）与靶蛋白分别作用的晶体结构；（b）设计延长单价适配体a的核酸双链延长臂a；(c)设计延长单价适配体b的双链延长臂b；（d）设计合适的核酸，使其长度和空间位置均能与延长臂a和延长臂b结合，长度连接延长臂a和延长臂b，该部分叫中间桥命名为中间桥；（e）连接延长臂a、中间桥和延长臂b，并保证中间桥与延长臂a连接处为loop或互相排斥的两段末端短链；中间桥与延长臂b的连接处为为loop或互相排斥的两段末端链，使每段核酸的构象在构建多价适配体前后的构象均保持不变，得到多价适配体的设计单元，即二价适配体。

技术总结
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种二价核酸适配体及其设计方法。本发明的目的是提供一种二价核酸适配体，解决核酸适配体与受体结合过程中存在构象急剧变化，导致构象自由度极大降低、熵剧烈减少、亲和力降低的问题。本发明的二价核酸适配体包括单价适配体A和单价适配体B，所述单价适配体A与单价适配体B为相同或者不同的单价适配体；单价适配体A的双链端延长形成双链延长臂A，单价适配体B的双链端延长形成双链延长臂B，延长臂A和延长臂B之间通过双链中间桥连接；所述延长臂A、中间桥和延长臂B形成二级结构为U型的连接部分，连接部分将单价适配体A和单价适配体B进行连接组装。单价适配体A和单价适配体B进行连接组装。单价适配体A和单价适配体B进行连接组装。


技术研发人员：左华 唐林林 胡晓丽 刘鉴 张哲 方亮
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2022/5/25