一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是一种能持续定植于人类胃粘膜并引起胃感染的细菌，与多种肠胃疾病有关。目前，国内外根除hp主要使用抗生素联合铋剂进行治疗，抗菌药物主要包括甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星等。但随着抗生素的广泛使用和滥用，hp耐药性越来越高，根除率也越来越低，严重威胁公众的健康安全。中药治疗hp具有疗效确切、不易产生耐药、毒性低、根除率高等优势，但很多中药抑菌的有效单体成分尚未清楚，即使找到中药单体有效成分，有时体外有效，但体内未必有效，需进一步实验验证。
3.我们的中药抗菌成分筛选研究发现黄连、吴茱萸、牛蒡子和丹参对hp抑制的主要成分分别为小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元和丹参酮ⅰ，其mic分别为16-32μg/ml、16-32μg/ml、1-2μg/ml、0.5-1μg/ml，而且这些单体化合物作用机制各不相同。不同单体化合物组合抗菌，增加组合物的作用靶点，有助于提高抑菌效果，减少化合物的耐药性。因此，本专利根据左金丸的质量配比，将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元和丹参酮ⅰ按照一定质量比例组合进行抑制hp，这个组合能协同增强对幽门螺杆菌的抑制作用，而且不容易产生耐药，对治疗幽门螺杆菌感染相关疾病非常好的效果。
4.本发明涉及的中药单体组合制备方法，未见有报道；该组合在体内体外对幽门螺杆菌具有特异性的抑制作用，能较好的促进幽门螺杆菌感染的急性胃炎小鼠胃粘膜炎症修复，且不容易产生耐药、安全性高，可作为治疗幽门螺杆菌感染相关疾病的候选药物，其用途属于首次公开。


技术实现要素：

5.解决的技术问题：为了提升中药对幽门螺杆菌的抑制活性，本发明提供了一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物及其制备方法和应用，该方法制备的组合物对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用，且抑菌作用和治疗效果明显提升。
6.技术方案：一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物的制备方法，步骤为：a.溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别溶解于无水乙醇中；b.组合药物：将上述制得的乙醇溶液，按小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ质量比6:1:(0.75-6):(0.75-6)混合在一起，即得到组合物。
7.上述小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ的质量比例为6:1:3:3。
8.上述方法制得的中药单体组合物。
9.上述中药单体组合物在制备治疗幽门螺杆菌感染相关疾病药物中的应用。
10.治疗幽门螺杆菌感染相关疾病药物，有效成分为上述的中药单体组合物。
11.有益效果：首先，本发明成功制备组合物；第二，本发明制备的组合物作用于抑制
幽门螺杆菌的生长，而且其作用特异性高、毒副作用小、不易产生耐药，能作为治疗幽门螺杆菌感染疾病的候选药物，有效缓解幽门螺杆菌严峻的耐药性问题。
附图说明
12.图1配制6:1:3:3组合物对细胞的毒性评价；
13.图2配制6:1:3:3组合物对小鼠胃、肝、脾和肾组织损伤；
14.图3配制6:1:3:3组合物耐药性评价；
15.图4配制6:1:3:3组合物治疗急性胃炎小鼠后hp159定植量；
16.图5配制6:1:3:3组合物治疗急性胃炎小鼠后胃粘膜组织修复情况；
17.图6配制6:1:3:3组合物治疗急性胃炎小鼠后炎症因子减少情况。
具体实施方式
18.实施例1
19.第一步，溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别称重后溶解于无水乙醇中，使得终浓度为4mg/ml。
20.第二步，组合药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ按照不同的质量比6:1:0.75:0.75混合在一起，即得到组合物1。
21.实施例2
22.第一步，溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别称重后溶解于无水乙醇中，使得终浓度为4mg/ml。
23.第二步，组合药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ按照不同的质量比6:1:1.5:1.5混合在一起，即得到组合物2。
24.实施例3
25.第一步，溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别称重后溶解于无水乙醇中，使得终浓度为4mg/ml。
26.第二步，组合药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ按照不同的质量比6:1:3:3混合在一起，即得到组合物3。
27.实施例4
28.第一步，溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别称重后溶解于无水乙醇中，使得终浓度为4mg/ml。
29.第二步，组合药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ按照不同的质量比6:1:6:6混合在一起，即得到组合物4。
30.实施例5
31.第一步，溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别称重后溶解于无水乙醇中，使得终浓度为4mg/ml。
32.第二步，组合药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ按照不同的质量比6:1:1.5:5.5混合在一起，即得到组合物5。
33.本发明对幽门螺杆菌的抑制作用通过如下实施例进一步详细的说明
34.1.材料
35.1.1样品
36.用实施例1、2、3、4、5分别制备组合物1、2、3、4、5。
37.1.2菌株
38.(1)幽门螺杆菌菌株:标准菌株26695、、nsh57、msd132及g27由南京医科大学毕洪凯老师赠送；临床甲硝唑耐药菌株、克拉霉素耐药菌株、左氧氟沙星耐药菌株、左氧氟沙星和甲硝唑耐药菌株、克拉霉素和甲硝唑耐药菌株、左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药菌株(hpbs001、hpbs002、hpbs003等)由右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心提供。
39.(2)非幽门螺杆菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、白色念珠菌、阴沟肠杆菌、空肠弯曲杆菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、弯曲乳杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、摩氏摩根菌、热带假丝酵母菌、溶血葡萄球菌、醋杆菌、酿酒酵母菌、霍氏肠杆菌由右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心提供。
40.1.3主要培养基和试剂：哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、mh培养基、沙氏培养基、标准小牛血清。
41.1.4主要仪器：三气培养箱、离心机、酶标仪、电子天平等。
42.1.5耗材：ep管、tip头、离心管等。
43.2.方法与结果
44.2.1棋盘法检测中药单体两两混合对幽门螺杆菌的协同抑制作用(fic，100μl体系)
45.(1)配制小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ的乙醇溶液，浓度均为4mg/ml，备用。
46.(2)mic板制备第一步：在96孔板上，b1、a2孔先加培养基167.2μl，再分别加12.8μl抗菌药物，其余孔加入90μl培养基，依次从a2至a12、b1至h1倍比稀释药物；第二步：a2至a12、b1至h1分别加入90μl培养基，第三步：先a至h纵向稀释，再1至12横向稀释。
47.(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od
600
为0.3(1
×
108cfu/ml)，稀释10倍，为1
×
107cfu/ml，备用。
48.(4)接种菌液除a1孔外，取10μl菌液加至每孔内(每孔菌液浓度约为1.0
×
106cfu/ml)，培养72h判断结果。
49.(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。用公式计算fic，公式为fic＝mica/a+micb/b(fic:部分抑菌联合指数)，式中a和b分别为两药单用时的mic值,mica和micb为两药联合时的mic值，fic≤0.5判断为协同作用；0.5＜fic≤1相加；1＜fic≤2判断为无关作用；fic＞2判断为拮抗作用，每个药物重复3次试验。
50.(6)结果：吴茱萸春碱和小檗碱联合用药为协同作用，牛蒡子苷元和丹参酮ⅰ联合用药为无关作用，其余联合用药为相加作用，结果见表1。
51.表1棋盘法fic(μg/ml)检测
[0052][0053]
2.2微量稀释法检测组合物对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)
[0054]
(1)配制小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ的乙醇溶液，浓度均为4mg/ml，分别按小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ质量比6:1:0.75:0.75、6:1:1.5:1.5、6:1:3:3、6:1:6:6、6:1:1.5:5.5混合在一起，备用。
[0055]
(2)mic板制备第一孔先加培养基175μl，再加5μl抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μl培养基，作为加菌不加药对照。
[0056]
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od
600
为0.3(1
×
108cfu/ml)，稀释10倍，为1
×
107cfu/ml，备用。
[0057]
(4)接种菌液取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0
×
106cfu/ml)。培养72h判断结果。
[0058]
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔第7孔(即不含抗生素)内细菌明显生长和第8孔(无菌)不生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
[0059]
(6)结果：小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ比例为6:1:3:3(即组合物2)时对幽门螺菌的抑制作用最明显，结果见表2。
[0060]
表2不同比例组合物mic检测
[0061][0062]
2.3微量稀释法检测6:1:3:3组合物对不同来源幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)
[0063]
(1)配备小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ4mg/ml，按6:1:3:3混合在一起，备用
[0064]
(2)mic板制备第一孔先加培养基175μl，再加5μl抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μl培养基，作为加菌不加药对照。
[0065]
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od
600
为0.3(1
×
108cfu/ml)，稀释10倍，为1
×
107cfu/ml，备用。
[0066]
(4)接种菌液取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0
×
106cfu/ml)。培养72h判断结果。
[0067]
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔第7孔(即不含抗生素)内细菌明显生长和第8孔(无菌)不生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
[0068]
(6)结果：小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ比例为6:1:3:3时对敏感和耐药的幽门螺菌均具有明显的抑制作用，结果见表3。
[0069]
表3 6:1:3:3组合物mic检测
[0070][0071]
2.2药物毒性检测
[0072]
2.2.1细胞毒性检测
[0073]
(1)制备ges-1、mgc823细胞悬液，调浓度为1
×
105。
[0074]
(2)接种到96孔板中：每孔100μl，同样的样本做3个重复。
[0075]
(3)37℃培养箱中培养24小时。
[0076]
(4)加入不同配比组合物3，设加药不加细胞组。
[0077]
(5)37℃培养箱中培养24小时。
[0078]
(6)加入10μl cck8，轻敲混匀后培养4小时。
[0079]
(7)测定450nm吸光度，根据公式计算存活率：细胞存活率＝[(as-ab)]/[(ac-ab)]
×
100％，as为含有细胞培养基、药物、cck-8孔，ac为含有细胞培养基、cck-8、没有药物孔，ab为不含细胞和药物、只有培养基和cck-8孔。根据存活率建立生存曲线。
[0080]
(8)结果实施例3配制6:1:3:3组合物的8倍mic对ges-1和bgc823细胞损伤不大，与左金丸无显著差异，毒性比较低，如图1所示。
[0081]
2.2.2动物毒性检测
[0082]
(1)准备小鼠：购买6-8周龄的c57bl/6小鼠，随机分给药组和阴性对照组每组10只。
[0083]
(2)灌胃给药：10倍治疗量给药，组合物(6:1:3:3)治疗给药量为7mg/kg，即小鼠毒性检测给药量为70mg/kg，连续3天，每天给药1次；阴性对照组给pbs液，次数和量同给药组。
[0084]
(3)称量体重：从给药前1天开始称小鼠体重，连续称量7天。
[0085]
(4)药效检测：停药后第3天感染组的小鼠称重并计算平均体重，眼球采血，行脱臼断颈处死，取胃、肾、肝和脾组织，做病理切片并进行he染色。
[0086]
(5)结果：a～d为正常小鼠灌pbs组胃、肝、脾和肾损伤情况，e～h为灌胃组合物(6:
1:3:3)对胃、肝、脾和肾肾损伤情况，两组相比，配制的组合物(6:1:3:3)10倍治疗量给药，对小鼠胃、肝、脾和肾均无明显损伤，其毒性非常低，如图2所示。
[0087]
2.3微量稀释法检测配制的6:1:3:3组合物对非幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(mic)
[0088]
(1)配备组合物(6:1:3:3)4mg/ml，混合备用。
[0089]
(2)mic板制备第一孔先加培养基175μl，再加5μl抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μl培养基，作为加菌不加药对照。
[0090]
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的菌用相应培养基制作成菌悬液，细菌调整浓度od600为0.3(1
×
108cfu/ml)，稀释100倍，为1
×
106cfu/ml，真菌调整浓度od600为0.5(5
×
106cfu/ml)，稀释1000倍，为5
×
103cfu/ml，备用。
[0091]
(4)接种菌液取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0
×
106cfu/ml)。培养72h判断结果。
[0092]
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔第7孔(即不含抗生素)内细菌明显生长和第8孔(无菌)不生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
[0093]
(6)结果：组合物(6:1:3:3)对大多数非幽门螺杆菌抑制作用比较差，说明抗菌谱比较窄、专一性强，能特异性作用于幽门螺杆菌，结果见表3。
[0094]
表3配制6:1:3:3组合物对非幽门螺杆菌mic(μg/ml)检测
[0095][0096]
注：6：1：3：3组“》”指大于46.1+7.7+23.1+23.1
[0097]
2.4配制的6:1:3:3组合物的耐药性检测
[0098]
(1)用幽门螺杆菌g27菌株进行检测连翘脂素衍生物的耐药性。首先检测甲硝唑和组合物(6:1:3:3)的mic分别为2μg/ml、0.72+0.12+0.36+0.36μg/ml，用1/4mic浓度进行诱
导，每3天检测一次，共诱导24天。诱导浓度随着mic变化而调整，如甲硝唑mic变为16μg/ml时，诱导的浓度则调为4μg/ml。
[0099]
(2)结果诱导24天后，甲硝唑耐药明显，mic增长了64倍；配制的6:1:3:3组合物mic无变化，不容易产生耐药，如图3所示。
[0100]
2.5构建动物模型体内检测组合物对h.pylori的抑制效果
[0101]
左金丸、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ、奥美拉唑、阿莫西林及克拉霉素均溶解稀释为10mg/ml。实验动物：c57bl/6。
[0102]
(1)动物分组：实验组将造模成功的感染组(bhk159)平均分成5组，分别为奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素组(三联疗法组)、奥美拉唑+组合物6:1:3:3(7mg/kg)、奥美拉唑+组合物6:1:3:3(7mg/kg)和pbs组，每组10只；未感染h.pylori的10只小鼠为阴性对照组。
[0103]
(2)动物给药：实验组灌胃给药，有奥美拉唑的组先给予奥美拉唑，30min后再给其它药物，给完药物后禁食禁水4小时；小鼠体重按照平均20g/只计算，给药量为奥美拉唑138.2mg/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg，每天给药1次，连续3次；阴性对照组给pbs溶液，容量、次数同上。
[0104]
(3)药效检测：停药后第2天感染组的小鼠称重并计算平均体重，眼球采血，行断颈处死，取胃组织，破碎，h.pylori的分离培养和鉴定及计算定植量，含6:1:3:3组合物组治疗效果明显优于三联疗法治疗和左金丸组，如图4所示。部分胃组织进行石蜡切片并做h&e染色和tunel免疫组化和荧光免疫检查，6:1:3:3组合物组胃组织修复效果好，炎症因子明显减少，如图5、图6所示。

技术特征：
1.一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物的制备方法，其特征在于步骤为：a.溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ分别溶解于无水乙醇中；b.组合药物：将上述制得的乙醇溶液，按小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ质量比6:1:（0.75-6）:（0.75-6）混合在一起，即得到组合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮ⅰ的质量比例为6:1:3:3。3.权利要求1-2任一所述方法制得的中药单体组合物。4.权利要求3述中药单体组合物在制备治疗幽门螺杆菌感染相关疾病药物中的应用。5.治疗幽门螺杆菌感染相关疾病药物，其特征在于有效成分为权利要求3所述的中药单体组合物。

技术总结
一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物及其制备方法和应用，步骤为：a.溶解药物：将小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮Ⅰ分别溶解于无水乙醇中；b.组合药物：将上述制得的乙醇溶液，按小檗碱、吴茱萸春碱、牛蒡子苷元、丹参酮Ⅰ质量比6:1:（0.75-6）:（0.75-6）混合在一起，即得到组合物。本发明成功制备一种治疗幽门螺杆菌中药单体组合物，该组合物在体内体外对幽门螺杆菌均具有非常明显的抑制作用，且作用专一，毒性低，不容易产生耐药。不容易产生耐药。不容易产生耐药。


技术研发人员：黄衍强 李如佳
受保护的技术使用者：右江民族医学院
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2022/5/25