miR528在禾本科牧草生产和育种中的应用

mir528在禾本科牧草生产和育种中的应用
技术领域
1.本技术涉及mir528在禾本科牧草的生产和育种中的应用。具体而言，本技术涉及mir528表达/功能下调在提高禾本科牧草产量、分蘖能力和再生能力中的用途。


背景技术：

2.草原是生态农业重要组成部分，对现代农牧业可持续发展和人类生存的生态环境至观重要。但由于长期的过度开发和掠夺式利用，我国草原面积急剧减少，草原“三化”(退化、沙化、盐碱化)面积日益增加，导致草畜矛盾日益尖锐，水土流失严重，生态环境逐年恶化，已严重影响了经济、生态、社会和各项事业的发展。为此，草原生态保护修复工作势在必行。综合改良和筛选高产、优良的牧草品种是草原生态保护修复最有效的途径。
3.禾本科牧草是牧草的一个主要类群，通常具有草质柔嫩、适口性好、营养丰富等优质特点。除了作为优质饲草外，某些禾本科草种还可以作为生物能源植物。例如柳枝稷(panicum virgatum)由于具有速生、高产、环境适应能力强等特性，其在生物能源方面的应用在美国已被广泛关注。生物能源以植物光合产物为原料，生产清洁无污染的乙醇燃料，整个能源生产和消耗过程中具有环境友好、成本可控和持续稳定等优点。同时由于生物能源植物在生产能源的同时可以兼顾土壤修复、充分利用边际土地、克服“与民争利，与粮争地”的不足，因此，研发可替代化石能源的环境友好的新型能源成为各国的关注点，并被认为是解决目前人口增长和城市化导致的能源危机、环境污染恶化等问题的有效途径。
4.分蘖是禾本科牧草生长发育过程中在茎秆基部节上产生的独立于主干的一种特殊分枝特性，为禾本科牧草的重要农艺性状之一，直接影响牧草的产草量和种子产量。而再生能力是禾本科牧草的主要特性之一，直接关乎牧草的产量及优质性。放牧或刈割能移去植物顶端和衰老组织，促进隐性蘖、芽的萌发或分枝数的增加，刺激牧草再生。培育分蘖及再生能力强的禾本科牧草，是从根本上解决目前我国草畜矛盾，修复和保护草原资源，保护绿色生态环境的重要途径之一。
5.mirna是一类长度为21-24nt的内源小分子rna，它们不编码蛋白质，而是以rna的形式，通过碱基互补配对的形式在转录后水平负调控靶基因的表达，进而参与到生物的生长发育及对环境的响应中。mirna的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一，在2002和2003连续两年被《science》杂志评为“年度十大科技进展”。在植物中，mirna主要通过降解靶mrna而负调控靶基因的表达，进而在所有的生物学过程中行使调控功能。尽管在模式植物和某些作物中，已经揭示了mirna的作用机制并发现了部分mirna的功能。但是如何在生产上利用mirna，为现代农牧业服务，产生经济价值是现代生物领域的一大难题。
6.mirna528(mir528)是水稻中最早被报道的mirna家族成员之一，且在单子叶植物中保守存在。中国申请cn201410423077.x记载了mirna528在水稻抽穗期和抗病毒方面的作用。具体而言，mir528的过量表达使水稻抽穗时间提前，而表达下调则使得水稻的抗rsv病毒能力增强、且抽穗时间延迟。


技术实现要素：

7.本技术的发明人通过大量研究，发现mir528在柳枝稷等禾本科牧草的分蘖及再生能力上具有重要的调控功能。即，mir528的表达和/或功能的下调，能够显著增强牧草的分蘖数及再生能力。
8.因此，在一个方面，本技术提供一种提高禾本科牧草的分蘖能力的方法，包括使禾本科牧草中的mir528的表达和/或功能下调。
9.mir528的表达下调可以通过mir528编码基因mir528的基因敲除、基因编辑等实现。在一个实施方式中，mir528的表达下调通过mir528的转录区和/或其上、下游调控区的基因编辑而实现。在一个实施方式中，mir528的表达下调通过mir528的转录区及其上、下游调控区的基因编辑而实现。在一个实施方式中，基因编辑经crispr/cas系统进行。
10.mir528的功能下调可以通过在禾本科牧草中表达能够被mir528识别、与mir528相互作用而不被mir528切割的人工模拟靶序列和/或短串联模拟靶标(sttm)而实现。在一个实施方式中，对禾本科牧草导入表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的载体，其中该载体组成型地表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标。在一个实施方式中，人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的表达处于组成型启动子的调控下。组成型启动子包括但不限于，泛素(ubquitin)启动子、肌动蛋白启动子等。在一个实施方式中，人工模拟靶序列为ctcctctgcatctagccccttcca(seq id no：1)。在一个实施方式中，短串联模拟靶标为ctcctctgcatctagccccttccagttgttgttgttatggtctaatttaaatatggtctaaagaagaagaatctcctctgcatctagccccttcca(seq id no：2)。
11.禾本科牧草包括但不限于柳枝稷、羊草、二穗短柄草、芒草、中间偃麦草、猫尾草、狗尾草、复活草、panicum hallii、brachypodium stacei、老芒麦、和无芒雀麦。在一个实施方式中，禾本科牧草为柳枝稷。
12.在另一个方面，本技术提供一种提高禾本科牧草的再生能力的方法，包括使禾本科牧草中的mir528的表达和/或功能下调。
13.mir528的表达下调可以通过mir528编码基因mir528的基因敲除、基因编辑等实现。在一个实施方式中，mir528的表达下调通过mir528的转录区和/或其上、下游调控区的基因编辑而实现。在一个实施方式中，mir528的表达下调通过mir528的转录区及其上、下游调控区的基因编辑而实现。在一个实施方式中，基因编辑经crispr/cas系统进行。
14.mir528的功能下调可以通过在禾本科牧草中表达能够被mir528识别、与mir528相互作用而不被mir528切割的人工模拟靶序列和/或短串联模拟靶标(sttm)而实现。在一个实施方式中，对禾本科牧草导入表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的载体，其中该载体组成型地表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标。在一个实施方式中，人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的表达处于组成型启动子的调控下。组成型启动子包括但不限于，泛素启动子、肌动蛋白启动子等。在一个实施方式中，人工模拟靶序列如seq id no：1所示。在一个实施方式中，短串联模拟靶标为如seq id no：2所示。
15.禾本科牧草包括但不限于柳枝稷、羊草、二穗短柄草、芒草、中间偃麦草、猫尾草、狗尾草、复活草、panicum hallii、brachypodium stacei、老芒麦、和无芒雀麦。在一个实施方式中，禾本科牧草为柳枝稷。
16.本技术还保护mir528表达/功能下调在改善禾本科牧草的分蘖能力和再生能力中
的用途。
17.本技术还保护能够实现mir528功能下调的人工模拟靶序列和短串联模拟靶标(sttm)。
18.本技术的发明人发现，下调mir528的表达和/或功能，对禾本科牧草的株高没有不良影响，因而在显著增强禾本科牧草的分蘖能力的基础上，可以大大增加牧草的生物量累积。此外，mir528表达和/或功能的下调，会增强禾本科牧草的再生能力，而再生能力的增强也有有助于牧草总量的增加。对于既可作为饲草又可作为生物能源植物的禾本科牧草而言，总供应量的增加，利于畜牧业和乙醇燃料产业的可持续发展。
19.本领域技术人员可以利用上述发现，筛选、培养出mir528的表达和/或功能下调的牧草种子，以方便该技术的推广。
20.本技术的内容将在以下结合附图和具体实施方式的描述进一步阐述，其中附图和具体实施方式仅为示例说明，并不限制本发明的范围。本技术实施方式中的各元素可以做出变更、取代、省略等，而不脱离本发明的本质。本技术的保护范围由权利要求及其等同方式决定。
附图说明
21.图1示出几种已测序禾本科草中mir528前体序列比对。
22.图2示出mir528在多种禾本科牧草中的表达。
23.图3示出本技术中用于抑制mir528功能的sttm序列，该序列含有两个mir528结合位点，各位点中间含有3个碱基(cta)的“凸起”，因此不能被mir528介导切割。
24.图4示出所构建的sttm表达载体，其中特异结合mir528的sttm序列在组成型启动子泛素启动子的驱动下。
25.图5示出导入sttm表达载体的柳枝稷中的sttm表达水平。
26.图6示出导入sttm表达载体的柳枝稷的表型，其中与导入空载体的柳枝稷相比，导入sttm表达载体的柳枝稷具有增加的分蘖数目和生物量。
27.图7示出导入sttm表达载体的柳枝稷在刈割10天后的再生表型，其中与导入空载体的柳枝稷相比，导入sttm表达载体的柳枝稷具有增强的刈割后再生能力。
具体实施方式
28.mirna是一类长度为21-24nt的内源小分子rna，通过碱基互补配对的形式在转录后水平负调控靶基因的表达。mir528是一种水稻中最早被报道的mirna家族成员之一，在水稻的抽穗期和抗病毒方面发挥一定的作用。
29.本技术的发明人利用水稻mir528的成熟序列，在phytozome v12.1(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)已测序基因组的植物物种中进行blast，对完全匹配序列的旁侧序列(前后各200bp)进行二级序列折叠分析。上下游200bp区间内存在能折叠茎环(stem-loop)结构的序列即被认为是mir528基因位点。将符合条件的序列调出，利用culstal x和genedoc进行序列比对及编辑(图1)。比对发现，在已测序的禾本科草中均发现存在mir528前体，这一结果被后续的northern杂交所验证(图2)。柳枝稷有3个拷贝；brachypodium stacie有1个拷贝；brachypodium hydridum，1个拷贝；二穗短柄草
(brachypodium distachyon)，1个拷贝；狗尾草(green foxtail)，1个拷贝；panicum hallii，1个拷贝；芒草(chinese silvergrass)，2个拷贝；复原草(oropetium thomaecum)，1个拷贝。拷贝数越高，mir528发挥的调控作用可能越大。
30.本技术通过在柳枝稷中下调mirna的功能，增强了柳枝稷的分蘖能力和再生能力。此外，本技术还在短柄草、小黑麦及羊草中下调mir528了表达。鉴于mir528在禾本科牧草中的序列/功能保守性，其功能下调很可能使得这些禾本科牧草获得相同/相似的优良性状，即更佳的分蘖能力和再生能力。
31.mir528的表达下调可以通过编码序列mir528的敲除或编辑实现。
32.基因敲除可以通过传统的同源重组进行。基因敲除可以发生在mir528成熟序列区或其表达调控区，只要该敲除引发mir528的表达下调。
33.基因编辑可以通过crispr/cas进行，其中crispr/cas是一种由向导rna引导cas核酸酶对靶向基因dna双链进行切割从而达到基因组修饰目的的技术。基因编辑可以发生在mir528成熟序列区或其表达调控区，只要该敲除引发mir528的表达下调。
34.mir528的功能下调还可以通过表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标(sttm)等方式实现。例如，在一个实施方式中，在禾本科牧草中过表达被mir528识别、与mir528相互作用而不被mir528切割的人工模拟靶序列或短串联模拟靶标(sttm)而实现。
35.mirna的人工模拟靶序列，是根据mirna的核酸序列而人工设计出的互补寡聚核苷酸链。对该互补寡聚核苷酸链进行优化设计，例如在中间插入不与mirna互补因而形成“凸起结构”的碱基，这一凸起结构使得mirna能与该人工模拟靶序列结合而无法将其切割，从而得到非切割型人工模拟靶序列。非切割型人工模拟靶序列在植物体内的过表达，可以抑制相应mirna的功能。
36.在非切割型人工模拟靶序列的基础上，进一步发展出短串联模拟靶标技术。sttm由一段48nt的特定序列将两个非切割型人工模拟靶序列桥连起来(图3)。在一些拟南芥的实验中发现，sttm的mirna抑制效果更优于非切割型人工模拟靶序列。
37.在一个实施方式中，对禾本科牧草导入表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的载体，其中该载体组成型地表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标。在一个实施方式中，人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的表达处于组成型启动子的调控下。组成型启动子包括但不限于，泛素启动子、肌动蛋白启动子等。
38.人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的表达载体可以为双元表达载体，例如pniac6b。表达载体可以通过农杆菌介导的愈伤侵染体系、基因枪等方法导入植株中。载体的导入效率和表达情况等可以通过提取转基因植株的总rna，并进行人工模拟靶序列或短串联模拟靶标的定量pcr来确定。
39.实施例
40.实施例1、mir528前体blast及序列比对
41.利用水稻mir528的成熟序列，在phytozome v12.1(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)已测序基因组的植物物种中进行blast，将完全匹配的序列及其旁侧序列(前后各200bp)进行二级序列的折叠分析，将能折叠stem-loop的序列调出，存成fasta格式。利用culstal x和genedoc进行序列比对及编辑。
42.比对结果见图1。结果显示，在所有已测序的禾本科草基因组中均存在mir528前
体。
43.实施例2、成熟mir528在多种牧草中的检测
44.人工合成一段与mir528成熟序列互补的dna序列ctcctctgcatgccccttcca(seq id no：3)，利用多聚核苷酸激酶t4 pnk(neb，m0201s)对该dna进行末端γ-32
p同位素标记，标记好的dna序列用作杂交探针。u6探针序列为tgtatcgttccaattttatcggatgt(seq id no：4)，标记方式同mir528探针标记，在此用作样品间上样量的对照。
45.利用trnzol(tiangen)提取多种草的总rna，并通过含有7m尿素的15％聚丙烯酰胺胶电泳分离，转膜后用于杂交。杂交在42摄氏度条件下反应过夜，利用洗膜缓冲液(2xssc，0.2％sds)洗膜两次，然后用保鲜膜将膜包好，利用typhoon 8600激光扫描成像仪采集同位素信号，并依据信号强弱表征mir528累积量。
46.杂交结果见图2，表明在所检测的各种牧草中均能检测到mir528。
47.实施例3、成熟mir528特异的sttm序列设计
48.如图3所示设计对成熟mir528特异的sttm序列。具体而言，在一段总长96个碱基序列的两端，各设计一个mir528结合位点，并在mir528结合区的第10-11碱基间额外加3个碱基cta。
49.具体序列如seq id no：2所示，该序列能够结合mir528，但不会被mir528介导的转录后调控所切割。
50.实施例4、抑制mir528功能的转基因载体构建
51.首先合成dna序列cf3380及其反向互补序列cf3381。
52.cf3380：
[0053][0054]
cf3381：
[0055][0056]
将cf3380和cf3381等摩尔混匀，95℃变性10分钟后退火形成双链dna片段，利用pentr
tm
/tev/d-topo
tm
克隆试剂盒(thermofisher，k253520)将双链dna重组到中间载体，然后利用gateway
tm lr clonase
tm
试剂盒(thermofisher，11791020)将该目的dna片段连入双元表达载体pniac6b，并使其位于ubi强启动子下游，具体实验流程完全按照试剂盒说明书规范操作，所得最终双元表达载体图谱见图4。
[0057]
实施例5、mir528功能被抑制的转基因株系鉴定
[0058]
利用农杆菌介导的愈伤侵染体系，将实施例4中构建好的sttm载体转入柳枝稷愈伤，同时一部分愈伤转入空载体做对照。分化出苗后转移到蛭石营养土培养，4个月后利用trnzol(tiangen)提取转基因柳枝稷的总rna。每个样品取2μg总rna，通过hiscript ii 1st strand cdna合成试剂盒(vazyme，r211)逆转录生成cdna，然后利用定量pcr确定各个转基因株系中sttm rna的表达水平。用于鉴定sttm rna的引物为cf6738和cf6739，扩增内参基因actin的引物为cf6095和cf6096。
[0059]
cf6738：gtacaaaaagcaggctccgc(seq id no：7)
[0060]
cf6739：agatgcagaggagattcttc(seq id no：8)
[0061]
cf6095：caagatttggagatcccgtg(seq id no：9)
[0062]
cf6096：aatgctccacggcgaacag(seq id no：10)
[0063]
各转基因株系中的sttm表达量如图5所示。在多个独立的转基因株系中，均检测到了较高水平的sttm rna表达；而在转入空载体的转基因株系中，未检测到sttm rna表达。
[0064]
实施例6、mir528功能抑制的转基因柳枝稷的分蘖及生物量
[0065]
观察蛭石营养土中培养的4个月大的转基因柳枝稷的表型。
[0066]
如图6所示，与转入空载体的对照株系相比，mir528被抑制的转基因株系具有更多的分枝数，且生长高度不受影响，总生物量多。换言之，mir528被抑制的转基因株系表现出更强的分蘖能力和更大的生物量积累。
[0067]
实施例7、mir528功能抑制的转基因柳枝稷刈割10天后的再生表现
[0068]
将蛭石营养土中培养的4个月大的转基因柳枝稷苗顶端部分进行统一刈割，使植株地上部只保留15cm长茎秆，并将各个植株从根部分成同等大小，重新种到回到蛭石营养土培养中，10天后观察新生分蘖表型。
[0069]
结果如图7所示，与转入空载体的对照株系相比，mir528被抑制的转基因株系具有更多新萌发的芽，分枝数较多。即，mir528被抑制的转基因株系表现出更强的再生能力。

技术特征：
1.一种增强禾本科牧草的分蘖能力和/或再生能力的方法，包括使禾本科牧草中mir528的表达和/或功能下调。2.根据权利要求1所述的方法，其中mir528的表达下调通过mir528编码基因mir528的基因敲除或基因编辑而进行。3.根据权利要求2所述的方法，其中基因编辑为对mir528的转录区、其上游调控区、和/或其下游调控区的基因编辑。4.根据权利要求3所述的方法，其中基因编辑通过crispr/cas系统进行。5.根据权利要求1所述的方法，其中mirna的功能下调通过在禾本科牧草中表达能够被mir528识别且与mir528相互作用的序列而进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中mirna的功能下调通过在禾本科牧草中表达能够被mir528识别、与mir528相互作用而不被mir528切割的人工模拟靶序列或短串联模拟靶标而进行。7.根据权利要求6所述的方法，其中对禾本科牧草导入表达人工模拟靶序列和/或短串联模拟靶标的载体，其中该载体组成型地表达人工模拟靶序列或短串联模拟靶标。8.根据权利要求6所述的方法，其中人工模拟靶序列如seq id no：1所示。9.根据权利要求6所述的方法，其中短串联模拟靶标如seq id no：2所示。10.根据权利要求1所述的方法，其中禾本科牧草选自柳枝稷、羊草、二穗短柄草、芒草、中间偃麦草、猫尾草、狗尾草、复原草、panicum hallii、brachypodium stacei、老芒麦、和无芒雀麦。

技术总结
本申请公开miR528在禾本科牧草生产和育种中的应用，miR528表达/功能下调在提高禾本科牧草分蘖能力和再生能力中的用途。科牧草分蘖能力和再生能力中的用途。科牧草分蘖能力和再生能力中的用途。


技术研发人员：曹晓风 杨荣新 唐善杰 付春祥 宋显伟
受保护的技术使用者：中国科学院遗传与发育生物学研究所
技术研发日：2020.11.04
技术公布日：2022/5/25