本说明书涉及疫苗。特别地，本说明书涉及包含以下物质的疫苗：编码来自感染性微生物的抗原(特别是hpv抗原)的mrna多核苷酸、以及来自rala肽家族的两亲性细胞穿透肽。本说明书还涉及制备此类疫苗的方法以及它们在治疗中的用途。
背景技术：
1、疫苗涉及将抗原(一种免疫系统会攻击的物质)直接或间接引入体内，通常通过注射引入体内。疫苗分为两大类：预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗被设计为建立免疫力——抗原引起身体的免疫系统产生抗体和细胞反应，以防止将来的感染和/或疾病。治疗性疫苗被设计为帮助身体更好地对抗已经患有的感染和/或疾病。
2、为了生产治疗性疫苗，需要一种特殊类型的免疫反应，其被称为cd8+反应。cd8+t细胞是免疫系统的细胞毒性t细胞。它们在遇到致病性刺激时被激发，并杀死呈递外源免疫原性抗原片段的细胞。cd8+t细胞是细胞免疫反应的关键成分，并且在控制病毒感染中起到重要作用。cd8+t细胞能够识别和破坏受感染细胞，并抑制病毒结合和转录。据认为，cd8+介导的反应是治疗活动性、潜伏性和持久性病毒病原体所必需的(例如cosma et al.,2018apr 27；7:f1000 faculty rev-508；beura et al.,immunity,2018 feb 20；48(2):327-338.e5,and mcmichael,cold spring harb.perspect.biol.,2018 sep 4；10(9):a029124)，并且需要将抗原特异性递送到抗原呈递细胞中(gessani et al.,toxins(basel),2014 may 26；6(6):1696-723)。目前通过肌内注射递送的抗原蛋白疫苗利用cd4+介导的途径和佐剂，以产生细胞溶解性cd4+免疫反应或抗原交叉呈递，从而引发cd8+反应。cd4+t细胞是“辅助”细胞，它们调节针对特定抗原的免疫反应，因此比cd8+t细胞更间接地发挥作用。由于先天性细胞免疫的触发以及无法将抗原递送到正确免疫细胞内的正确位置，引起cd8+主导的反应的疫苗仍然难以捉摸。
3、疫苗有几种类型，包括灭活疫苗；减毒活疫苗；信使核糖核酸(mrna)疫苗；亚基、重组、多糖和结合疫苗；类毒素疫苗；以及病毒载体疫苗。这些不同的疫苗以不同的方式将抗原引入体内。
4、mrna疫苗向细胞传递指令以制造抗原，进而引起免疫反应。所选的mrna编码待治疗的感染和/或疾病的抗原。与其他类型的疫苗相比，mrna疫苗有几个好处，包括更短的制造时间，而且由于mrna不会被引入细胞基因组，因此它们不会在接种疫苗的人中产生引起疾病的风险。然而，未修饰的合成mrna是不稳定的，并且mrna本身可以刺激不需要的(例如cd4+)免疫反应的激活。因此，可能需要对核糖、rna末端和核碱基进行化学修饰，以提高稳定性并降低免疫原性(例如，参见gao et al.,acta.biomater.2021 sep 1；131:1–15)。
5、人乳头瘤病毒(hpv)是最常见的性传播疾病，全世界估计有2亿人感染(世界卫生组织2018年全球hpv市场研究)。感染hpv可导致生殖器疣、癌前病变和癌症。大多数hpv感染的临床症状不明显，即使不进行治疗，所有新hpv感染的患者中超过90％在两年内也无法检测到。不幸的是，一些感染持续存在并导致并发症，并且作为一种病原体，hpv造成了全世界所有癌症的5％，包括所有宫颈癌的99％和所有皮肤非黑素瘤癌症(如基底细胞和鳞状细胞癌)的60％(de martel et al.,new microbiol.2017 apr；40(2):80-85 and brianti etal.,int j cancer.2017 aug 15；141(4):664-670)。hpv引起的宫颈癌是仅次于乳腺癌的女性第二常见死亡原因。
6、在150多种hpv菌株中，40种影响生殖器区域，但大多数不会对健康构成严重风险。一个人一次可能感染不止一种hpv菌株，并且菌株按编号标识。hpv菌株分为低危型hpv或高危型hpv。大多数低危型hpv菌株的感染是无症状的，并且这些菌株与癌症无关。感染高危型hpv的问题更严重，并且可能导致宫颈非典型增生和某些类型的癌症。至少有12种高危型hpv菌株，包括hpv 16、hpv 18、hpv 31、hpv 33、hpv 35、hpv 39、hpv 45、hpv 51、hpv 52、hpv 56、hpv 58和hpv 59，其中两种(hpv 16和hpv 18)导致大多数的hpv相关癌症。
7、目前的hpv疫苗是预防性疫苗，目的在于给11-14岁的少年接种以预防感染(cooket al.,pediatrics.2018 sep；142(3))。这些疫苗对已经感染hpv的人无效，即使预防性覆盖是普遍的，也需要至少20多年才能转化为hpv相关发病率的显著降低(kumar et al.,medjarmed forces india,2015apr；71(2):171-7)。同时，预计到2035年，仅英国的宫颈癌发病率将上升43％，每100,000名女性中有17例新增病例(英国癌症妇科学会(bgcs)宫颈癌指南：实践建议)。毫无疑问，需要一种治疗性疫苗、或能够同时起到治疗和预防作用的疫苗，以解决现有的hpv感染、特别是hpv 16和hpv 18感染。
8、有几种已知的hpv蛋白(l1、l2、e1、e2、e4、e5、e6和e7)可以在治疗hpv感染的疫苗接种途径中作为抗原发挥作用。市场上的预防性疫苗利用了主要衣壳(病毒表面)蛋白l1(kirnbauer et al.,proc.natl.acad.sci.u s a,1992dec 15；89(24)和schiller etal.,vaccine,2018aug 6；36(32pt a):4768-4773)。然而，在hpv基因组整合到细胞基因组中的过程中，l1(和l2)蛋白被灭活或删除，因此，一旦发生灭活或删除，则采用l1和l2抗原的疫苗对hpv感染无效。早期蛋白e1、e2、e4、e5、e6和e7在hpv的生命周期中表达的时间更长，因此代表了治疗性疫苗的更好靶点，即使对于晚期hpv感染亦是如此(pal et al.,front microbiol.2019；10:3116)。
9、mrna疫苗接种中采用的抗原递送系统在确定免疫反应的类型方面起到关键作用。载体:mrna的比率也起到作用，mrna分子是带负电荷的多核苷酸，而载体需要保护货物(cargo)免受降解，并将其递送至正确的靶细胞。优化载体:mrna的比率有助于生产具有合适尺寸和电荷特性的纳米颗粒，以确保被抗原呈递细胞摄取。
10、rala肽家族是由重复rala单元组成的两亲性肽，其能够在体外和体内克服基因递送的生物屏障。术语“rala”在文献中的使用不一致，但通常是指由大概少于约50个氨基酸残基的重复rala单元组成的两亲性肽或肽组。cohen-avrahami m等人(j.phys.chem.b2011,115:10 189-1 097和colloids and surfaces b:biointerfaces 77(201 0)131-138)公开了被称为“rala”的两亲性16聚体肽。nouri fs等人(biomacromolecules 2013,14,2033-2040)使用术语“rala”描述了30聚体rala肽，mccarthy等人(journal ofcontrolled release189(2014)141-149)也是如此，但描述的是不同的30聚体肽。wo 2014/087023和wo 2015/189205将术语“rala”定义为落入本文所述发明的范围内的一组肽的通用术语。
11、rala肽家族已被用于递送遗传物质，例如质粒dna(mccarthy ho et al.jcontrol release,2014 sep 10；189:141-9；和ali aa et al.,nanomedicine,2017 apr；13(3):921-932)、mrna(udhayakumar et al.,adv.healthc.mater.2017 jul；6(13))、sirna(mulholland e.j.et al.,j control release,2019dec 28；316:53-65)以及小分子，例如双膦酸盐类(jena ln et al.,j.nanobiotechnology.2021may 4；19(1):127)和磷酸钙(sathy b.n.et al.,j.mater.chem.b.2017 mar 7；5(9):1753-1764)。
12、特异性rala肽wearlaralaralarhlaralaralracea(seq id_no 1)是30个氨基酸、无毒的肽，在生理ph下带有+6个电荷，在细胞的内涵体中建立的酸性条件下转化为+8螺旋细胞穿透构象。已经表明，当在水中与某些有效负载例如dna和mrna复合时，其能够自发地自组装成纳米颗粒(mccarthy et al.2014和udhayakumar et al.2017)。这种ph依赖性变化使肽和货物能够在细胞内逃逸，产生高效的细胞摄入和货物递送，而在细胞外的生理ph7.4下没有任何相关毒性。已经表明，纳米颗粒在一定的温度范围内和随着时间的推移是极其稳定的，并且rala肽本身不会引起免疫反应。
13、udhayakumar等人(udhayakumar et al.2017)通过用编码模型抗原卵清蛋白(蛋清中发现的主要蛋白质)的rala复合mrna免疫小鼠，评估了这种rala肽在mrna纳米复合物中启动cd8+t细胞的能力。udhayakumar等人得出结论，需要多种不同的mrna核苷酸修饰和非常高的n/p比(即肽中带正电荷的氮原子与mrna骨架中带负电荷的磷酸盐的比率)，才能实现卵清蛋白mrna的最佳复合，并实现有效的cd8+t细胞启动。
14、ali等人(ali et al.2017)研究了用于宫颈癌的dna接种疫苗；通过聚合物微针递送rala浓缩的e6/e7质粒dna纳米颗粒。然而，为了使dna疫苗发挥作用，货物必须到达细胞核，被转录成mrna，并被翻译成蛋白质。mrna疫苗消除了转录步骤、以及核酸到达靶细胞核的需要。
15、coolen等人(biomaterials,vol.195,2019al.,p.23-37)研究了结合有细胞穿透肽的聚乳酸纳米颗粒增强基于mrna的疫苗在树突状细胞中表达从而触发其激活的能力。然而，与egfp(绿色荧光蛋白)复合的rala肽未能有效转染dc2.4树突状细胞，因此未被选择以进行进一步评估。
16、本说明书描述了包含编码来自感染性微生物的抗原(特别是hpv抗原)的mrna多核苷酸以及特异性rala肽的疫苗。这些疫苗产生mrna货物的细胞内递送，保护其免受降解，并且不会引起先天(cd4+)免疫反应。此外，rala复合的mrna纳米颗粒可以轻而易举地冻干(保留住功能)，稳定且易于重构，不需要冷链储存，并且制造成本相对低廉。
技术实现思路
1、本说明书部分地描述了一种疫苗，其包含：
2、i)mrna多核苷酸，其包括编码来自感染性微生物的抗原或其免疫原性片段的开放阅读框；以及
3、ii)两亲性细胞穿透肽，其包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
4、wearlaralaralarhlaralaralracea(seq id_no 1)
5、或与其具有至少80％的序列同一性或同源性的序列。
6、本说明书还部分地描述了如本文所述的疫苗在治疗中的用途、特别是在治疗病毒感染和治疗癌症中的用途。
1.一种疫苗，其包含：
2.根据权利要求1所述的疫苗，还包含第二mrna多核苷酸，所述第二mrna多核苷酸包括编码来自感染性微生物的抗原或其免疫原性片段的开放阅读框。
3.根据权利要求2所述的疫苗，还包含第三mrna多核苷酸，所述第三mrna多核苷酸包括编码来自感染性微生物的抗原或其免疫原性片段的开放阅读框。
4.根据权利要求2或3所述的疫苗，其中所述mrna多核苷酸以大约相等的％w/w比率存在。
5.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框编码hpv抗原或其免疫原性片段。
6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框编码e1和/或e6和/或e7 hpv抗原或其免疫原性片段。
7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框编码hpv 6、8、11、16或18抗原或其免疫原性片段。
8.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框编码hpv 16抗原或其免疫原性片段。
9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述两亲性细胞穿透肽包括以下氨基酸序列：
10.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述两亲性细胞穿透肽由以下氨基酸序列组成：
11.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其包含：
12.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其包含：
13.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述mrna多核苷酸包括五端帽(5′帽)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述mrna多核苷酸包括经修饰的尿苷核苷酸，其中所有的尿苷核苷酸都是n1-甲基假尿苷核苷酸。
15.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述mrna多核苷酸包括未修饰的胞苷核苷酸。
16.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含纳米颗粒。
17.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗中的两亲性细胞穿透肽:mrna多核苷酸的n:p比为约8.5-9.5:1。
18.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，还包含海藻糖。
19.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其包含
20.一种静脉内制剂，其包含在水中配制的根据前述权利要求中任一项所述的疫苗。
21.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗作为治疗性疫苗的用途。
22.根据权利要求1至20所述的疫苗在癌症的治疗中的用途。
23.一种药物组合物在性传播疾病的治疗中的用途，所述药物组合物包含根据权利要求1至20所述的疫苗。
24.一种治疗温血动物例如人的hpv感染的方法，所述方法包括向所述动物施用有效量的根据权利要求1至20所述的疫苗。
