本发明属于病原检测，具体地涉及一种同时定性并定量五种病原的引物组和检测方法及其应用。
背景技术：
1、水产养殖行业作为全球食品生产的重要组成部分，近年来得到了迅猛发展。甲壳动物在水产养殖业中占有重要地位，包括经济上重要的种类如虾、蟹等。然而，近年来，甲壳动物的集约化养殖，疾病挑战愈发严重，成为该行业可持续发展的关键瓶颈。各种疾病不仅导致养殖生物的大规模死亡，还严重降低了经济收益。
2、十足目虹彩病毒1（div1）对虾和其他甲壳动物具有显著的致病性。感染的虾通常会出现明显的病理变化，包括活力下降和高死亡率。div1的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失，特别是在亚洲，严重影响了养殖虾的产量和质量。白斑综合症病毒（wssv）具有高度传染性，可以水平传播给多种甲壳动物，包括虾、蟹。一旦感染，病毒在宿主体内迅速复制，最终导致高死亡率。传染性皮下和造血组织坏死病毒（ihhnv）感染通常导致虾生长迟缓和畸形，导致养殖产量显著下降。ihhnv的流行给水产养殖业造成了巨大的经济损失。ihhnv可通过水平和垂直传播，感染幼体和成年虾。感染的虾在早期可能没有明显的症状，但随着病毒的复制，病理变化变得更加严重。急性肝胰腺坏死病（ahpnd），主要由携带pirab基因的弧菌引起，感染虾的肝胰腺，导致肝胰腺组织的急性坏死。感染的虾表现出食欲减退、体色变暗、昏睡和快速死亡等症状。虾肝肠胞虫（ehp）主要感染虾的肝胰腺。ehp感染通常可通过受污染的水、饲料或感染的虾传播。尽管ehp不直接导致死亡，但它显著减缓了虾的生长速度，给农民带来了经济损失。并且，近年来经常出现被多种病原体同时感染的情况，因此加强病原的早期快速诊断和大范围筛查，研发多种病原同时检测的多目标检测手段迫在眉睫。
3、为了应对近年出现的一种水生动物被多种病原体同时感染的现状，多重evagreen荧光定量法应运而生，该技术既具有荧光定量检测技术时间短、操作简单、敏感性和特异性高等优点，还可以实现多种病原的同时检测，大大缩短了多病原单一检测的时间，是一种比较有前景的多目标快速检测技术。虽然多重evagreen荧光定量技术拥有如此多的优势，但其在水生动物病原快速检测方面的研究尚处于起步阶段，已有的研究仍主要集中在对虾病原多目标快速检测方面。多重evagreen荧光定量法在甲壳动物病原多目标快速检测方面仍存在很大空白，可同时检测甲壳动物五种重要病原（ehp, div1, ihhnv, wssv和vahpnd）的多目标检测技术更是从未见报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可同时检测ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，且特异性强、操作方便简单、可以明显区分各病原的多重evagreen荧光定量法检测引物组和检测方法。
2、本发明利用多重evagreen荧光定量技术，以ehp的swp蛋白对应的基因序列(genbank 登录号kx258197.1)、div1的mcp蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号ky681039.1)、ihhnv的ns1蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号 jn616415.1)、wssv的wsv313蛋白对应基因序列(genbank登陆号 nc_075105.1)和vahpnd的pirb蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号km067908.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种多重evagreen荧光定量检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过对熔解曲线进行分析，以达到高准确性，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本发明的目的。
3、本发明的第一个目的是提供一种同时定性并定量五种病原的引物组，所述的五种病原为ehp、div1、hhnv、wssv和 vahpnd，所述的ehp为虾肝肠胞虫、div1为十足目虹彩病毒1、ihhnv为传染性皮下和造血组织坏死病毒、wssv为白斑综合症病毒、vahpnd为致急性肝胰腺坏死病弧菌，所述的检测引物组具体序列如表1；
4、表1 引物名称及核苷酸序列
5、。
6、本发明的第二个目的是提供多重evagreen荧光定量引物组在同时定性并定量多种病原中的应用，所述的多种病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd。
7、本发明的第三个目的是提供一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测试剂盒，所述的试剂盒包括所述的引物组。
8、本发明的第四个目的是提供一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测方法，所述的病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，所述方法具体包括以下步骤：
9、(1) 对样品进行收集，提取样品的基因组dna作为荧光定量反应的模板，ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd阳性样品作为阳性对照；
10、(2) 使用所述的引物组，与evagreen荧光定量预混液及样品基因组dna混合形成扩增反应体系，进行evagreen荧光定量扩增反应；
11、(3) 扩增反应结束后，通过溶解曲线分析检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd。
12、进一步，所述的通过扩增曲线分析检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，具体为：若阴性对照无扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线，并ct值≤37，则判定试验有效。否则试验无效，应重新进行试验；若样品的ct值≤37，则判定检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd；若37＜样品的ct值≤40时，应对样品再次检测。再次检测时加入2.5 μl模板，并相应减少水的体积，若再次检测样品出现扩增曲线，并ct值≤37，判定rt-qpcr检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，否则判定为阴性；若样品无扩增曲线，结果判定检测结果为阴性。
13、进一步，所述的通过熔解曲线分析检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，具体为：熔解曲线出现单峰，若tm值与ehp阳性对照tm值相同，则样品中含有ehp；若tm值与wssv阳性对照tm值相同，则样品中含有wssv；若tm值与vahpnd阳性对照tm值相同，则样品中含有vahpnd；若tm值与ihhnv阳性对照tm值相同，则样品中含有ihhnv；若tm值与div1阳性对照tm值相同，出现峰则样品中含有div1。若熔解曲线出现两峰及以上，则出现峰与对应阳性对照峰tm值相同则该样品含有相应病毒。若熔解曲线未出现峰值则该样品不含有ehp、div1、ihhnv、wssv、vahpnd五种病原。
14、所述的evagreen 荧光定量反应体系总体积25 μl，包括2×含evagreen的mix（50u/μl taq dna 聚合酶，2 mm dntps，50×rox叠氮化物，evagreen，20 mm tris-hcl，0.1mm edta，100 mm nacl，0.5% 吐温-20，1 mm 二硫苏糖醇，50% (v/v) 甘油）12.5 μl，引物ehp-2-f和ehp-2-r各0.56 μm，引物ihhnv-p-3f、ihhnv-p-3r、wssv-y-2f和wssv-y-2r各0.40 μm，引物div1-m-4f、div1-m-4r、vp-pb-3f、vp-pb-3r各0.32 μm，基因组dna模板1 μl，余量为去离子水。
15、所述的evagreen 荧光定量反应的反应条件优选为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，64℃20 s，40个循环；95℃ 15 s，64℃ 1 min，68℃-85℃收集熔解曲线。
16、本发明与现有技术相比的有益效果：本发明根据ehp 的swp蛋白对应的基因序列(genbank 登录号kx258197.1)、div1的mcp蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号ky681039.1)、ihhnv的ns1蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号 jn616415.1)、wssv的wsv313蛋白对应基因序列(genbank登陆号 nc_075105.1)和vahpnd的pirb蛋白对应的基因序列(genbank 登陆号km067908.1)为特异靶基因设计特异性引物组，具有很好的特异性，可同时检测ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及检测方法，进而确定检测的样品中是否存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd。本发明的检测引物组和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，灵敏度高，可同时检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd五种病原等优点，特别适合养殖场的多重检测，具有广阔的应用前景。
1.一种同时定性并定量五种病原的引物组，其特征在于，所述的五种病原为ehp、div1、hhnv、wssv和vahpnd，所述的ehp为虾肝肠胞虫、div1为十足目虹彩病毒1、ihhnv为传染性皮下和造血组织坏死病毒、wssv为白斑综合症病毒、vahpnd为致急性肝胰腺坏死病弧菌，所述引物组的具体序列如seq id no.1-10。
2.一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在同时定性并定量多种病原中的应用，其特征在于，所述的多种病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，所述的应用为非疾病诊断和治疗的目的。
4.一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测方法，其特征在于，所述检测非疾病诊断和治疗目的，所述的病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，所述方法具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的通过扩增曲线分析检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，具体为：若阴性对照无扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线，并ct值≤37，则判定试验有效；否则试验无效，应重新进行试验；若样品的ct值≤37，则判定检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd；若37＜样品的ct值≤40时，应对样品再次检测；再次检测时加入2.5 μl模板，并相应减少水的体积，若再次检测样品出现扩增曲线，并ct值≤37，判定rt-qpcr检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，否则判定为阴性；若样品无扩增曲线，结果判定检测结果为阴性。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，熔解曲线出现峰，若tm值与ehp阳性对照tm值相同，则样品中含有ehp；若tm值与wssv阳性对照tm值相同，则样品中含有wssv；若tm值与vahpnd阳性对照tm值相同，则样品中含有vahpnd；若tm值与ihhnv阳性对照tm值相同，则样品中含有ihhnv；若tm值与div1阳性对照tm值相同，出现峰则样品中含有div1；若熔解曲线出现两峰及以上，则出现峰与对应阳性对照峰tm值相同则该样品含有相应病毒，若熔解曲线未出现峰值则该样品不含有ehp、div1、ihhnv、wssv、vahpnd五种病原。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的evagreen 荧光定量反应体系总体积25 μl，包括2×含evagreen的混合液 12.5 μl，引物ehp-2-f和ehp-2-r各0.56 μm，引物ihhnv-p-3f、ihhnv-p-3r、wssv-y-2f和wssv-y-2r各0.40 μm，引物div1-m-4f、div1-m-4r、vp-pb-3f、vp-pb-3r各0.32 μm，基因组dna模板1 μl，余量为去离子水。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的evagreen 荧光定量反应的反应条件为：95℃ 3min；95℃ 10s，64℃ 20s，40个循环；95℃ 15s，64℃ 1min，68℃-85℃收集熔解曲线。
