本发明属于生物医药，涉及一种从酸枣仁中提取多种有效成分的方法及应用。
背景技术：
1、酸枣仁（semen ziziphi spinosae，szs）为鼠李科灌木植物酸枣（ziziphusjujuba mill. var. spinosa（bunge）hu ex h. f. chou）的干燥成熟种子，味甘、酸，性平，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津之功效。现代药理学研究表明，酸枣仁具有抗焦虑、抗惊厥、镇静催眠、增强免疫功能、改善认知功能、抗动脉粥样硬化、抗炎、心肌保护等作用。
2、酸枣仁中主要含有黄酮类、三萜类、挥发油及有机酸等成分。其中，黄酮类组分是以2-苯基色原酮为基本母核的一系列化合物，泛指两个苯环通过中央三碳链连接即具有c6-c3-c6基本母核的天然产物。酸枣仁中的黄酮类组分主要包括斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素等，具有镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑、抗氧化、增强学习记忆力、脑神经保护等药理作用。三萜类组分是一类基本母核由30个碳原子组成的萜类化合物。酸枣仁中的三萜类组分多为结合态的达玛烷型四环三萜皂苷，如酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b等，具有镇静催眠、抗惊厥、降血脂和心血管系统保护作用。酸枣仁中游离态三萜类组分有白桦脂酸、白桦脂醇、美洲茶酸、麦珠子酸等，为羽扇豆烷型五环三萜，除具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗hiv等药效活性外，也具有一定抗抑郁、镇静催眠的作用。酸枣仁黄酮类、皂苷类和游离三萜类均都具有一定的镇静催眠的作用，但在其他药效活性上有较大的区别，其结构及理化性质也截然不同。
3、对于酸枣仁中黄酮类等有效成分的提取，申请号为201910717516.0的中国专利公开了采用反相色谱填料，通过调节流动相中有机相的比例来分离纯化酸枣仁提取物中黄酮和皂苷两大类活性成分。申请号为201510137286.2的中国专利公开了采用hpd100 型大孔吸附树脂分离纯化黄酮及皂苷类有效部位。但上述专利只分离纯化了酸枣仁中的黄酮类及皂苷类组分，未涉及游离三萜类组分，也未对分离纯化出的组分进行药效的考察。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种从酸枣仁中提取多种有效成分的方法及应用，以解决现有提取方法未提取游离三萜类组分的问题。
2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、本技术提供一种从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，该方法包括：
4、s01：向酸枣仁粉末中添加5倍量的70%乙醇，加热回流1-1.5h，过滤、减压浓缩，得到浓缩液，所述浓缩液中酸枣仁生药量为0.2-0.4g/ml且含醇量为20-40%。
5、将干燥的酸枣仁粉碎，形成酸枣仁粉末。向酸枣仁粉末中添加5倍体积量的70%乙醇，在温度为90℃条件下，加热回流1-1.5h。回流结束后，过滤溶液，得到滤液。在50℃下对滤液减压浓缩，直至滤液中的酸枣仁生药量为0.2-0.4g/ml且含醇量为20-40%，得到浓缩液。
6、s02：所述浓缩液上样于大孔吸附树脂柱，静置吸附40-60min后，先后采用5 bv40%乙醇、6 bv 60%乙醇和8 bv 90%乙醇依次洗脱，分别收集洗脱液。
7、将浓缩液上样于大孔吸附树脂柱，其中，浓缩液的上样量为大孔吸附树脂柱体积bv的5倍，上样速率为2 bv/h。上样结束后，静置40-60min，使大孔吸附树脂柱充分吸附浓缩液。在本技术中，大孔吸附树脂柱为d101型大孔吸附树脂柱。该d101型大孔吸附树脂属于非极性树脂，是一种球状苯乙烯型非极性共聚体，对于不带极性或弱极性的有机化合物，普遍吸附能力强，特别对皂苷类、黄酮类组分的分离纯化效果尤佳，较多用于中草药天然活性成分的制备。本技术中使用d101型大孔吸附树脂对酸枣仁中的黄酮类组分、皂苷类组分及游离三萜类组分进行分离。
8、静置结束后，先后采用5 bv 40%乙醇、6 bv 60%乙醇和8 bv 90%乙醇分别对d101型大孔吸附树脂柱按照5 bv/h的洗脱速率进行洗脱，分别收集洗脱液，得到40%乙醇洗脱液、60%乙醇洗脱液、90%乙醇洗脱液。
9、s03：所述洗脱液分别减压浓缩、干燥成粉末，得到黄酮类组分、皂苷类组分及游离三萜类组分。
10、将40%乙醇洗脱液、60%乙醇洗脱液、90%乙醇洗脱液分别减压浓缩，在70℃下干燥成粉末，得到黄酮类组分、皂苷类组分及游离三萜类组分。
11、对制备得到的黄酮类组分、皂苷类组分及游离三萜类组分分别采用uplc-u3000超高效液相色谱系统进行分析，以确定其组成成分及含量，得到附图1-3。其中，uplc-u3000超高效液相色谱分析条件为：色谱柱：waters acquity uplc beh c18（100×2.1mm，1.7μm），流动相：0.1%磷酸水溶液（a）-乙腈（b），洗脱条件：0-15min：10%-15%b；15-20min：15%-20%b；20-30min：20%-22%b；30-35min：22%-42%b；35-39min：42%-49% b；39-40min：49%-81%b；40-47min：81%-90%b。柱温：35℃，流速：0.3 ml/min，进样量：5μl，波长203nm。
12、由附图1可见，40%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到的成分中含有斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素，表明其成分主要为黄酮类组分。该黄酮类组分含量以斯皮诺素及6'''-阿魏酰斯皮诺素的总量计，斯皮诺素回归方程y1=0.1499x1-0.2245，r12=0.9996，线性范围为6.2713~200.68 µg/ml。6'''-阿魏酰斯皮诺素回归方程y2=0.1599x2-0.1043，r22=0.9992，线性范围为6.4503~206.41 µg/ml。
13、由附图2可见，60%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到的成分中含有酸枣仁皂苷a，表明其主要成分为皂苷类组分。该皂苷类组分以酸枣仁皂苷a的含量计，酸枣仁皂苷a回归方程y3=0.0658x3-0.0444，r32=0.9997，线性范围为6.2784~200.91 µg/ml。
14、由附图3可见，90%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到的成分中含有白桦脂酸，表明其主要成分为游离三萜类组分。该游离三萜类组分以白桦脂酸的含量计，白桦脂酸回归方程y4=0.202x4-0.7989，r42=0.9992，线性范围为6.5047~208.15 µg/ml。
15、另外，本技术中，从酸枣仁中提取的黄酮类组分、皂苷类组分以及游离三萜类组分均分别用于制备具有养心安神、镇静催眠功能的药物。
16、本发明具有以下有益效果：
17、（1）该方法中，利用d101型大孔吸附树脂以及不同浓度的乙醇从酸枣仁浸提液中分离提取出黄酮类、皂苷类及游离三萜类组分，并对分离纯化的各部位进行药效学考察。
18、（2）从酸枣仁中提取的黄酮类、皂苷类及游离三萜类组分均对pcpa致失眠小鼠具有养心安神、镇静催眠的功效，其中，酸枣仁皂苷类组分镇静催眠作用更加显著。
19、（3）该方法工艺简单，高效，回收率高，使用的分离材料安全，使用的大孔树脂材料可多次反复使用，安全，生产成本低，为“安全、有效、可控”的酸枣仁有效部位原料的开发提供了良好的技术方案。
1.一种从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，加热回流温度为90℃。
3.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱为d101型大孔吸附树脂柱。
4.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述浓缩液的上样量为所述大孔吸附树脂柱体积bv的5倍。
5.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述浓缩液的上样速率为2 bv/h。
6.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，洗脱速率为5 bv/h。
7.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，在50℃下减压浓缩，得到浓缩液。
8.根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取多种有效成分的方法，其特征在于，干燥温度为70℃。
9.权利要求1所述的从酸枣仁中提取的黄酮类组分、皂苷类组分以及游离三萜类组分均分别用于制备具有养心安神、镇静催眠功能的药物。
