本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种对虾条形码的引物以及同时鉴定多种对虾的多重pcr引物组合、试剂盒及应用。
背景技术：
1、虾的种类繁多，是重要的经济水产品之一。广义上，所有对虾总科(penaeidae)的物种均称作对虾，约430种。狭义上，对虾特指隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、枝鳃亚目、对虾总科对虾属的物种，约32种。联合国粮农组织列出的具有商业或具有潜在商业价值的虾的种类有300多种，其中约100种在产量中占主要份额。2022年，全球对虾养殖产量达793万吨，占甲壳类养殖产量的62.2％。不同对虾的市场价值差异显著，例如基围虾通常指刀额新对虾(metapenaeus ensis)，但在华北地区，部分商家会用南美白对虾(penaeusvannamei)冒充，两者售价相差近3倍。非专业人士难以从形态上区分，因为两者额剑的锯齿差异细微，其中刀额新对虾的额剑只有上方有锯齿，而其额剑下方没有锯齿。
2、对虾的物种鉴定通常依据体色、斑纹、额角、中央沟、侧沟、齿式、额剑等等形态特征。仔虾的鉴别尤为困难，因为它们在早期生活阶段的形态极为相似，这对早期对虾的生态学研究构成挑战。对虾易腐烂变质，一旦受损，会迅速被细菌分解，释放硫化氢和组胺等，导致形态不可逆变化，增加了形态学鉴定的难度。
3、因此，形态学鉴定适用于特征明显的成体对虾，要求鉴定人员具备深厚的形态学知识。非专业人员难以掌握，且对特殊细胞如胚胎、生殖细胞，及加工产品如罐头、冷冻虾仁的鉴定存在局限。
技术实现思路
1、本发明针对上述技术问题提供一对获得可用于对虾总科鉴定的条形码引物，以及一种同时鉴定多种对虾的多重pcr引物组合、试剂盒及应用。
2、本发明是通过如下技术方案来实现的：
3、本发明提供一对对虾总科(penaeidae)鉴定的条形码引物，所述的引物为penf2：5’-agactaatgattatgctacc-3’(seq id no.13)；penr2：5’-cgagataagtcgtaacatag-3’(seqid no.14)；该引物扩增的目标片段长度为900bp。
4、本发明还提供一种利用该条形码引物(penf2/penr2)的应用，可以获得用于物种鉴定的对虾条形码。
5、进一步，所述的应用方法为提取样品的dna，利用所述对虾条形码引物进行pcr反应，对反应产物进行sanger测序后，将获得的序列进行blast(basic localalignmentsearch tool)后获得所检测的对虾的物种信息；
6、所述pcr体系共25μl：2×rapidtaqmastermix 12.5μl，penf2/penr2(10μm)均为1.0μl，待检测对虾dna2.0μl，ddh2o 8.5μl；
7、所述的pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸7min。
8、一种同时鉴定多种对虾的多重pcr引物组合，所述的引物组合和5种对虾的特异性片段大小如表1所示，所述的多种对虾为刀额新对虾(metapenaeus ensis)、南美白对虾(penaeus vannamei)、日本囊对虾(penaeusjaponicus)、短沟对虾(penaeussemisulcatus)和斑节对虾(penaeus monodon)；
9、表1不同对虾特异性引物信息
10、
11、本发明还提供一种同时鉴定多种对虾的试剂盒，所述试剂盒包含所述引物组合，所述的多种对虾为刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾。
12、本发明还提供一种所述引物组合在鉴定多种对虾中的应用，所述的多种对虾为刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾。
13、进一步，所述的应用方法为提取样品的dna，利用所述引物组合进行多重pcr反应，对反应产物进行琼脂糖凝胶检测；
14、所述多重pcr体系共25μl：2×rapid taq master mix 12.5μl，mensf1/mensr1(10μm)均为0.5μl，pvanf1/pvanr1(10μm)均为0.5μl，pjapf1/pjapr1(10μm)均为0.5μl，psemf1/psemr1(10μm)均为0.5μl，pmonf2/pmonr2(10μm)均为1.5μl，待检测对虾dna2.0μl，ddh2o 3.5μl；
15、所述的pcr反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸7min。
16、本发明还提供一种鉴定刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾的方法，所述的方法为首先提取样品dna，然后使用对虾总科(penaeidae)鉴定的条形码引物进行扩增，对扩增产物进行检测，如果能够扩增出900bp的条带，则说明样品中有虾的成分，然后在利用所述引物组合进行鉴定，对扩增结果进行分析样品是否含有对应目标虾的成分。
17、本发明与现有技术相比的有益效果：本发明所述的对虾条形码引物是针对分子数据库里的37种83个对虾总科的线粒体基因组进行设计的，相对于以往的针对所有无脊椎动物的条形码引物的扩增效果更好。本发明所述多重pcr引物组合能够对刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾进行快速并且准确的鉴定，可以对于缺乏必要的外部特征的胚胎、生殖细胞(卵子)、对虾加工的食品或半成品等进行鉴定。
1.一对对虾总科鉴定的条形码引物，其特征在于，所述的引物为seq id no.13-14所示，所述引物扩增的目标片段长度为900bp。
2.一种同时鉴定多种对虾的多重pcr引物组合，其特征在于，所述的引物组合和5种对虾的特异性片段大小如表1所示，所述的多种对虾为刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾；
3.一种同时鉴定多种对虾的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述引物组，所述的多种对虾为刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾。
4.权利要求2所述引物组在鉴定多种对虾中的应用，其特这在于，所述的多种对虾为刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用方法为提取样品的dna，利用权利要求2所述引物组进行多重pcr反应，对反应产物进行琼脂糖凝胶检测。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多重pcr体系共25μl：2×rapid taqmastermix 12.5μl，10μm mensf1/mensr1均为0.5μl，10μm pvanf1/pvanr1均为0.5μl，10μmpjapf1/pjapr1均为0.5μl，10μmpsemf1/psemr1均为0.5μl，10μm pmonf2/pmonr2均为1.5μl，待检测对虾dna2.0μl，ddh2o 3.5μl。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的pcr反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸7min。
8.一种鉴定刀额新对虾、南美白对虾、日本囊对虾、短沟对虾和斑节对虾的方法，其特征在于，所述的方法为首先提取样品dna，然后使用权利要求1所述对虾总科鉴定的条形码引物进行扩增，对扩增产物进行检测，如果能够扩增出900bp的条带，则说明样品中有虾的成分，然后再利用权利要求2所述引物组对样品进行鉴定，对扩增结果进行分析样品是否含有对应目标虾的成分。
