本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高罗伊氏乳杆菌转化甘油发酵产罗伊氏菌素的方法。
背景技术：
1、罗伊氏乳杆菌（lactobacillus reuteri）是一种定殖在几乎所有脊椎动物肠道内的肠道益生菌，其作为一种异型发酵的乳酸菌，可以通过pkp途径或者hmp途径分泌产生乳酸、乙酸、乙醇等物质，发挥其作为乳酸菌的优势。同时罗伊氏乳杆菌还可以产生一种非蛋白类的广谱抑菌物质罗伊氏菌素（reuterin）。罗伊氏菌素能广泛的抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒和病原虫等的生长，通常是指由不同形态的3-羟基丙醛（3-hpa）组成的动态混合化合物体系。
2、3-hpa是甘油转化为1，3-丙二醇（1，3-pdo）的中间产物，罗伊氏乳杆菌在厌氧条件下，通过辅酶b12依赖型的甘油脱水酶（gdht）将甘油作为电子受体，转化为中间化合物3 -hpa。3-hpa则继续在1,3-丙二醇氧化还原酶（pdor）的作用下进一步被还原为1,3-丙二醇。在2002年，lüthi-peng等人提出一个积累高浓度3-hpa的两步法过程，即先在罗伊氏乳杆菌细胞最佳生长条件下培养菌株，然后在纯甘油水溶液中培养细菌使其发酵产生3-hpa。
3、然而，影响罗伊氏乳杆菌发酵产生罗伊氏菌素的原因多样且复杂，如发酵温度、发酵时间、甘油浓度等。目前罗伊氏乳杆菌发酵产生抑菌素的含量普遍较低，从而限制了其在生物医药如肠道疾病治疗等方面的应用。因此，研究一种高产率的罗伊氏菌素发酵方法，提高罗伊氏乳杆菌的罗伊氏菌素发酵能力，对于罗伊氏乳杆菌工业生产罗伊氏菌素具有重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中所存在的问题，本发明旨在提供一种提高罗伊氏乳杆菌转化甘油发酵产罗伊氏菌素的方法。本发明方法可以提高罗伊氏乳杆菌的罗伊氏菌素发酵能力。
2、本发明提高罗伊氏乳杆菌转化甘油发酵产罗伊氏菌素的方法，是将罗伊氏乳杆菌在mrs液体培养基发酵培养后，通过离心获取菌体，在清洗菌体后，对全细胞发酵产生罗伊氏菌素这一阶段进行优化。通过改变全细胞发酵阶段的发酵时间、培养温度、接种量、甘油溶液ph和甘油溶液浓度提高罗伊氏菌素的发酵产量。
3、所述罗伊氏乳杆菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cgmcc1.3222。
4、本发明提高罗伊氏乳杆菌转化甘油发酵产罗伊氏菌素的方法，包括如下步骤：
5、步骤1：将罗伊氏乳杆菌甘油保藏管菌种划线于mrs琼脂培养基平板中，于30-37℃厌氧培养箱中培养12-24h，挑选单菌落至含有5-10ml的mrs培养基的试管中，于30-37℃厌氧培养箱中静置培养8-12h，获得种子发酵液。
6、步骤2：以体积比0.5-2%的比例，将步骤1获得的种子发酵液接种至50-100ml的mrs培养基中，于30-37℃厌氧培养箱中静置培养12-24h，获得罗伊氏乳杆菌发酵液。
7、步骤3：取罗伊氏乳杆菌发酵液于0-4℃、5000-5500rpm下离心5-10min，并用磷酸缓冲液（ph=7）清洗，获得罗伊氏乳杆菌发酵菌体。
8、步骤4：用15ml ph=3.0-8.0的浓度为100-800mmol/l的甘油溶液重悬7-30g/l的罗伊氏乳杆菌菌体，于23-44℃下培养0.5-5h。
9、进一步，通过单因素试验确定，所述甘油溶液ph=6，甘油浓度为600mmol/l，接种量为20-30g/l，培养温度为30℃，培养时间为1-2h。
10、所述全细胞发酵条件进行正交试验优化。其中甘油溶液ph和甘油浓度以及接种量对罗伊氏菌素的产生有显著影响，培养时间和培养温度影响并不显著。
11、优化后的全细胞发酵条件，甘油溶液ph=6，甘油浓度为600mmol/l，接种量为26.5g/l，培养温度为30℃，培养时间为2h。
12、进一步，在正交优化条件基础上，在全细胞转化甘油发酵体系中，以质量体积比添加0.001%-0.01%的辅酶b12、0.1%-1%的atp、1.0%-10%的氯化钙、1%-10%的氯化镁、1%-10%的氯化钾中的一种或几种，以提高罗伊氏菌素的产量。
13、更进一步，选择上述添加剂中提高抑菌素产量效果最好的0.001%-0.01%的辅酶b12、0.1%-1%的atp、1%-10%的氯化钾进行复配，以提高罗伊氏菌素产量。
14、本发明有益效果体现在：
15、本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌发酵产生抑菌素的方法，并对全细胞发酵阶段的发酵时间、培养温度、接种量、甘油溶液ph和甘油溶液浓度进行了优化，在此基础上，通过外源添加剂的优化和复配，选择辅酶b12、atp、氯化钾进行复配，以进一步提高罗伊氏菌素的产量。优化后的罗伊氏菌素产量由初始条件的5.01g/l提高到19.17g/l，提高了3.83倍。
16、本发明通过改良罗伊氏乳杆菌发酵生产罗伊氏菌素的发酵条件，提高了罗伊氏乳杆菌发酵产生罗伊氏菌素的能力，进而提高了罗伊氏菌素的产量，使罗伊氏乳杆菌作为益生菌的功能得到了更好的发挥，为罗伊氏菌素的大规模工业化生产应用于生物医药领域打下基础。
1.一种提高罗伊氏乳杆菌转化甘油发酵产罗伊氏菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
