本发明属于生物发酵，更具体的，涉及一种基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法。
背景技术：
1、畜类骨源(如猪骨、牛骨、鸡骨等)富含胶原蛋白、矿物质和多种功能性蛋白质，是重要的生物资源。通过合理的发酵与酶解技术，可以从这些骨源中提取具有抗氧化、抗炎、降压、钙结合等多种功能的多肽分子，这些多肽在食品、保健品及医药产品开发中具有广泛的应用潜力。然而，由于骨源结构复杂、蛋白质类型多样，要高效利用骨源中的功能性成分，仍面临诸多挑战。
2、目前，多肽的生产多采用液态酶解工艺，通过添加特定酶制剂对骨源进行水解，从而获得目标多肽。同时，固态发酵技术也被应用于骨源多肽的生产中，通过微生物发酵可进一步提升多肽的活性与功能性。近年来，混合骨源的使用逐渐兴起，通过组合猪骨、牛骨、鸡骨的独特蛋白质片段，产生了单一骨源无法获得的多功能多肽，如lys-gly-pro-hyp-asp和arg-glu-val-gly-pro-hyp。这些新型多肽分子展示了更为广泛的生物活性，在多肽产品市场中具有重要的前景。
3、尽管现有技术可以从骨源中提取多肽，但常规的酶解方式存在显著缺陷。由于缺乏对酶活性和反应时间的精准控制，常规酶解常导致多肽的过度降解，生成过多的小分子肽或游离氨基酸，显著降低了目标多肽的生成率和功能性。特别是对于复杂多肽如arg-glu-val-gly-pro-hyp，常规方法难以避免其在酶解后期进一步分解成无活性的碎片。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于解决上述缺陷，进而提出一种基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法。
2、本发明采用如下的技术方案。
3、本发明第一方面公开了基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，包括步骤1～步骤4；
4、步骤1，将包括牛骨、猪骨、鸡骨的混合骨源，进行清洗、蒸煮、脱脂、脱矿和粉碎，确保骨粉的均匀性和纯净度，干燥后备用；
5、步骤2，对骨粉进行靶向酶解，包括：高温高效酶解、低温酶解、酶解失活终止三个阶段，得到酶解液；
6、步骤3，干燥处理酶解液，加入营养成分并接入菌种进行固态发酵；
7、步骤4，发酵结束后，依次进行固相分离、浓缩、多肽纯化、干燥，最终对多肽粉末无菌包装。
8、进一步的，混合骨源的比例为猪骨:牛骨:鸡骨＝3:4:3。
9、进一步的，步骤2具体包括：将骨粉与去离子水按照质量比1:15混合后，在反应罐中进行酶解；加入2％胰蛋白酶、1.0％胶原酶进行高温缓慢酶解，此时控制ph值为7.5，温度为50℃，缓慢搅拌1h；高温高效酶解结束后，加入1.5％碱性蛋白酶进入低温酶解，此时调整ph的值为8，温度降为室温20-25℃，缓慢搅拌4h；低温酶解结束后，将温度重新加热至90℃，保持10min，紧接着迅速冷却至室温，得到酶解液。
10、进一步的，加入2％胰蛋白酶、1.0％胶原酶进行高温高效酶解具体包括：加入1.0％胶原酶进行高温高效酶解；然后基于底物消耗速率模型，确定引入胰蛋白酶的时间；然后加入2％胰蛋白酶继续高温高效酶解。
11、进一步的，底物选择氨基酸，底物消耗速率模型如下所示：
12、
13、s(t)<ε×s(0)
14、其中，k是胶原酶的反应速率常数，e(t)是胶原酶的浓度，s(t)是氨基酸的浓度，s(t)表示底物(氨基酸)消耗速率，s(0)表示底物的初始消耗速率，ε是预设的阈值，取值为30％；当s(t)与s(0)的比值小于预设的所述阈值时，加入胰蛋白酶。
15、进一步的，营养成分包括：20g/l葡萄糖作为碳源，10g/l酵母粉提供氮源、维生素和生长因子，5g/l蛋白胨提供氮源和多肽，0.2g/l的k2hpo4作为缓冲剂和磷源，以及0.02g/l的mgso4提供镁离子，菌种包括乳杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉按照2:3:4的质量比接种，接种量为基质质量的5％。
16、进一步的，发酵过程中，控制温度为35℃、相对湿度为50％、通气量为0.6l/min，发酵时间为48小时。
17、本发明第二方面公开了一种基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备系统，用于执行第一方面所述的方法，系统包括：原料处理装置、酶解装置、固态发酵装置、分离纯化装置；
18、原料处理装置用于将包括牛骨、猪骨、鸡骨的混合骨源，进行清洗、蒸煮、脱脂、脱矿和粉碎，确保骨粉的均匀性和纯净度，干燥后备用；
19、酶解装置用于对骨粉进行靶向酶解，包括：高温高效酶解、低温酶解、酶解失活终止三个阶段，得到酶解液；
20、固态发酵装置用于干燥处理酶解液，加入营养成分并接入菌种进行固态发酵；
21、分离纯化装置用于发酵结束后，依次进行固相分离、浓缩、多肽纯化、干燥，最终对多肽粉末无菌包装。
22、进一步的，固态发酵装置具备自动升降搅拌功能，同时配备消泡桨叶、直叶搅拌桨叶。
23、本发明的有益效果在于，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
24、(1)在固态发酵前，引入不同阶段的靶向酶解，优化了多肽的提取过程。同时，多种酶的组合使用(胰蛋白酶、胶原酶和碱性蛋白酶)能够针对性地分解骨源中的胶原蛋白，生成特定的功能性肽段，如lys-gly-pro-hyp-asp和arg-glu-val-gly-pro-hyp。这种方法不仅提高了多肽的产率，还保持了其生物活性。更进一步的，本发明还同时采用多酶协同的方式，首先利用特异性较高的初级酶(如胶原酶)进行初级水解，从而释放较大分子量的功能性肽段，然后引入次级酶(如胰蛋白酶)进一步水解，配合对ph值、温度值的监控，防止目标多肽的过度降解。
25、(2)采用固态发酵方式在避免传统液态发酵中因过度水解导致的多肽降解的同时，利用多种菌种的协同作用，提高了多肽产品的纯度和功能性。通过使用乳杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉，能够进一步修饰和优化多肽序列，使其具有更好的生物活性，如抗氧化、抗炎和免疫调节作用。
1.基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，包括步骤1～步骤4；
2.根据权利要求1所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，混合骨源的比例为猪骨:牛骨:鸡骨＝3:4:3。
3.根据权利要求1所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，步骤2具体包括：将骨粉与去离子水按照质量比1:15混合后，在反应罐中进行酶解；加入2％胰蛋白酶、1.0％胶原酶进行高温缓慢酶解，此时控制ph值为7.5，温度为50℃，缓慢搅拌1h；高温高效酶解结束后，加入1.5％碱性蛋白酶进入低温酶解，此时调整ph的值为8，温度降为室温20-25℃，缓慢搅拌4h；低温酶解结束后，将温度重新加热至90℃，保持10min，紧接着迅速冷却至室温，得到酶解液。
4.根据权利要求1所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，加入2％胰蛋白酶、1.0％胶原酶进行高温高效酶解具体包括：加入1.0％胶原酶进行高温高效酶解；然后基于底物消耗速率模型，确定引入胰蛋白酶的时间；然后加入2％胰蛋白酶继续高温高效酶解。
5.根据权利要求4所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，底物选择氨基酸，底物消耗速率模型如下所示：
6.根据权利要求1所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，营养成分包括：20g/l葡萄糖作为碳源，10g/l酵母粉提供氮源、维生素和生长因子，5g/l蛋白胨提供氮源和多肽，0.2g/l的k2hpo4作为缓冲剂和磷源，以及0.02g/l的mgso4提供镁离子，菌种包括乳杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉按照2:3:4的质量比接种，接种量为基质质量的5％。
7.根据权利要求1所述的基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备方法，其特征在于，发酵过程中，控制温度为35℃、相对湿度为50％、通气量为0.6l/min，发酵时间为48小时。
8.一种基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备系统，用于执行权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述系统包括：原料处理装置、酶解装置、固态发酵装置、分离纯化装置；
9.根据权利要求8所述的一种基于多层酶解与固态发酵结合的动物骨源多肽制备系统，其特征在于，固态发酵装置具备自动升降搅拌功能，同时配备消泡桨叶、直叶搅拌桨叶。
