本发明属于家畜繁育领域，涉及提高奶牛繁殖效率的生物技术，具体涉及用于稳定生产高质量opu性控胚胎的icsi操作。
背景技术：
1、胞浆内单精子注射(icsi)是一种将单个精子直接注射到卵母细胞胞质中的技术，使用icsi操作方法已经实现了多种类物种的出生。在牛中，icsi可以有效地利用精子改良牲畜、培育优等牲畜。以奶牛为例，目前其icsi胚胎发育的囊胚率可以达到25％左右。
2、尽管通过单精子注射可以将性控精子(例如x精子)直接注射到胞浆中，从而提高性控胚胎的生产效率。但是在奶牛优质资源缺乏的情况下，对有遗传价值的奶牛经常在不考虑卵母细胞质量的情况下进行活体采卵(opu)。因此，质量差的奶牛卵母细胞经常被取出并用于体外受精，而这通常会降低胚胎产量。同时体外受精的结果还会受到公牛生育力、精液加工与储存条件的影响，特别是对于冷冻保存后的性控精液，其通过体外受精获取性控胚胎的效率低，可能的原因包括精子活力差、无法顺利穿过透明带，进而无法完成受精。
3、鉴于奶牛优良种源和冻精长期依赖进口的现状，并考虑到opu所产生的卵母细胞质量不稳定等因素对体外受精的影响，可以通过icsi完成单精子注射并进行icsi卵的激活及胚胎培养，从而在一定程度上提高劣质卵母细胞的利用率。但已有研究表明，在牛中仅使用一种激活剂进行单一处理不足以激活icsi卵，而多种激活剂的使用虽能够在一定程度上提高活化效率，但在激活后发生的原核形成异常会影响胚胎发育及质量，并导致囊胚率降低。
4、另外，中国专利cn101492669a采用了离子霉素及6-dmap处理注入精子后的去核卵母细胞，且在与其采用相同激活处理的中国专利cn101302497a中，囊胚率(参比卵裂胚胎数)可以达到30％以上，不过受到卵裂率低的影响，实际的囊胚率(参比成熟卵母细胞数)是较低的。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种提高奶牛体外opu性控胚胎生产效率的icsi操作方法。
2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、一种用于生产opu性控胚胎的方法，包括以下步骤：
4、将性控精子和经成熟培养后作为供体的opu卵母细胞采用显微注射方式制成重构体，将重构体依次采用离子霉素、6-dmap激活以促进重构体中精子解聚，然后进行胚胎培养，从而获得opu性控胚胎。
5、优选的，所述成熟培养包括以下步骤：将通过opu技术获得的卵丘卵母细胞复合体(cocs)用卵母细胞成熟培养液在38.4～38.6℃、饱和湿度及4.85％～5.15％co2条件下培养20～24h。
6、优选的，将所述卵丘卵母细胞复合体(cocs)进行培养后用透明质酸酶进行处理，然后在卵母细胞成熟培养液中进行恢复(例如在38.4～38.6℃、饱和湿度及4.85％～5.15％co2条件下孵育30min以上)，即可得到经成熟培养后作为供体的opu卵母细胞(简称opu供体卵母细胞)。
7、优选的，所述卵丘卵母细胞复合体(cocs)具体是通过将采出的牛(例如奶牛)卵泡液利用集卵杯过滤，并用hepes洗液或生理盐水多次清洗后进行捡卵而收集的。
8、优选的，所述性控精子的制备包括以下步骤：将牛(例如奶牛)性控冻精解冻，利用bo上浮法从经解冻所得的性控精液中分离相应的性控精子，将分离的性控精子用受精培养液稀释，即获得作为供体的性控精子。
9、优选的，所述bo上浮法具体包括以下步骤：取200～400μl性控精液转移至3～4ml上浮液的底部，待精子在38.4～38.6℃、饱和湿度及4.85％～5.15％co2条件下上浮后进行离心，将离心(例如于300×g～500×g离心5～10min)所得精子沉淀进行清洗，得性控精子。
10、优选的，所述显微注射是通过icsi将作为供体的性控精子注入到opu供体卵母细胞胞质中以形成作为重构体的icsi卵。
11、优选的，所述重构体的制备具体包括以下步骤：先将opu供体卵母细胞置于操作滴中，作为供体的性控精子置于精子滴中；用单精子注射针将精子滴中的单个性控精子进行断尾操作后吸入到该单精子注射针中，用固定针吸附操作滴中的单个opu供体卵母细胞，将所述单精子注射针沿与该opu供体卵母细胞的第一极体正交的方向进针，并在回吸一定量的胞质后将吸入至所述单精子注射针的胞质和所述单个性控精子匀速注入所述opu供体卵母细胞中，确认所述单个性控精子已注入所述opu供体卵母细胞后撤出(例如从opu供体卵母细胞中抽出)所述单精子注射针。
12、优选的，所述激活具体包括以下步骤：所述重构体经恢复后转移至含4.9～5.1nm离子霉素的sof中激活处理3～5min，然后用sof清洗干净，然后在受精培养液中培养25～30min，再转移至含4.9～5.1nm离子霉素的sof中激活处理3～5min，然后用sof清洗干净，然后在受精培养液中培养1.5～2.0h，再转移至含1.9～2.1nm6-damp的sof中激活处理3～4h；其中各激活处理及培养均在38.4～38.6℃、饱和湿度及4.85％～5.15％co2条件下进行。
13、优选的，所述受精培养液为ivf。
14、优选的，所述重构体的恢复具体包括以下步骤：将通过icsi注入有性控精子的opu供体卵母细胞转移至卵母细胞成熟培养液中孵育20～30min；其中孵育在38.4～38.6℃、饱和湿度及4.85％～5.15％co2条件下进行。
15、优选的，所述胚胎培养的条件包括：用胚胎培养液(例如ivc)并在38.4～38.6℃、4.85％～5.15％co2及6.9％～7.0％o2条件下培养6～7d。
16、一种家畜繁殖方法，包括以下步骤：
17、利用上述用于生产opu性控胚胎的方法获得供体家畜(例如奶牛)的opu性控胚胎，将所述opu性控胚胎移植入受体家畜(例如奶牛)中，之后检查并判断受体家畜受孕(例如妊娠)情况。
18、本发明的有益效果体现在：
19、本发明在将性控精子注入经过成熟培养后的opu卵母细胞，并对所得重构体(例如icsi卵)进行了离子霉素、6-dmap激活处理后，能够培养获得囊胚率高、妊娠率高的opu性控胚胎，为性控高产家畜快速扩繁提供了科学参考和实践依据。
20、进一步的，本发明在采用低浓度激活剂(离子霉素、6-dmap)基础上，选择合适的激活处理时间间隔(即不同激活处理之间的培养时间)，从而提高了奶牛性控精子经icsi、激活及胚胎培养所产生胚胎的囊胚率。
1.一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述性控精子的制备包括以下步骤：将性控冻精解冻，利用上浮法从所得性控精液中分离性控精子，将分离的性控精子用受精培养液稀释。
3.根据权利要求2所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述受精培养液为ivf。
4.根据权利要求2所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述上浮法具体包括以下步骤：取200～400μl性控精液转移至3～4ml上浮液的底部，待精子上浮后进行离心，将离心所得精子沉淀进行清洗。
5.根据权利要求1所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射具体采用icsi。
6.根据权利要求1所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述激活具体包括以下步骤：所述重构体经恢复后用4.9～5.1nm离子霉素激活处理3～5min，清洗干净后在受精培养液中培养25～30min；再用4.9～5.1nm离子霉素激活处理3～5min，清洗干净后在受精培养液中培养1.5～2.0h；再用1.9～2.1nm6-damp激活处理3～4h。
7.根据权利要求6所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述恢复具体包括以下步骤：将注入有性控精子的opu卵母细胞转移至卵母细胞成熟培养液中孵育20～30min。
8.根据权利要求1所述一种用于生产opu性控胚胎的方法，其特征在于：所述胚胎培养的条件包括：用胚胎培养液培养6～7d。
9.一种家畜繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述一种家畜繁殖方法，其特征在于：所述供体家畜、受体家畜为牛。
