本发明属于原位蛋白质组学，具体涉及一种改进原位邻位连接技术检测效率的方法。
背景技术：
1、蛋白质的空间表达对于精确识别组织中蛋白质的定位和功能至关重要，并且与蛋白质在健康和疾病中的功能密切相关。因此，捕获空间和原位蛋白质组——即蛋白质在亚细胞水平上的定位及其动态变化——对于全面了解细胞生物学具有重要意义。原位蛋白质组学是一种研究蛋白质在细胞或组织中的分布、定位、相互作用和功能的技术，它是蛋白组学的一个重要分支，与传统蛋白质组学技术相比，它提供了更高的空间分辨率和更准确的定量能力。
2、基于抗体-寡核苷酸偶联物的原位蛋白质成像技术为哺乳动物中大量细胞类型和蛋白质相互作用提供了关键的空间定位信息。监测细胞和组织中的蛋白质相互作用可以揭示细胞和分子结构之间的复杂反应。蛋白质相互作用在多种细胞过程中发挥核心作用，包括翻译后修饰(如磷酸化)、信号转导、神经发育和癌症。目前，已有多种方法被证明能够有效检测蛋白质相互作用。例如，传统的原位邻近连接技术已成为识别细胞和组织中相互作用蛋白质的常用方法。该技术主要使用一对抗体-寡核苷酸偶联物和滚环扩增来可视化目标蛋白相互作用。
3、unfold探针是在现有的原位邻近连接探针的基础上改进设计的，它结合了生成环状扩增模板所需的条件，从而提高了检测效率。类似地，杂交链式反应的邻位依赖性启动也是基于二抗-寡核苷酸偶联物的双重靶向识别，并使用寡核苷酸作为原位邻近连接的工具。与现有的原位邻近连接相比，它能够产生更高的信噪比和信号放大率。
4、上述基于现有的原位邻近连接的方法主要用于检测蛋白质之间的接近度，以获取蛋白质之间相互作用的信号数量。然而，获取可用于标准化数据的游离蛋白质量至关重要，这有助于减少假阳性信号的数量并提高定量蛋白质相互作用的准确性。molboolean技术能够检测不参与相互作用的蛋白质a和b，以及足够接近形成的蛋白质ab复合物。此外，该方法可以通过计算重叠和游离滚环扩增产物的数量来准确相对定量蛋白质相互作用。通过同时检测单个蛋白质和蛋白质相互作用，molboolean技术能够反映单个细胞的异质性，这在恶性肿瘤中尤其重要，因为肿瘤细胞与基质组织混合并具有不同的克隆特征。
5、尽管现有的检测蛋白质相互作用的方法取得了一定的进展，但其效率仍有待提高，以满足日益增长的生物医学研究需求。
技术实现思路
1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种改进原位邻位连接技术检测效率的方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种改进原位邻位连接技术检测效率的方法，包括如下步骤：
4、(1)将对应第一蛋白的第一一抗以及对应第二蛋白的第二一抗共同处理待测样品中的细胞，该细胞中含有第一蛋白和第二蛋白；
5、(2)将对应第一一抗的第一二抗和对应第二一抗的第二二抗分别与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸偶联，构建形成第一偶联物和第二偶联物；
6、(3)将上述第一偶联物和第二偶联物共同处理经第一一抗和第二一抗共同处理过的待测样品；
7、(4)在步骤(3)处理后的待测样品中先加入一夹板探针进行处理以使上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此靠近，该夹板探针分别与上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列的一部分互补配对；再加入成环探针进行处理以获得环状模板，该成环探针与上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列的另一部分互补配对；接着基于该环状模板进行滚环扩增以获得滚环扩增产物；然后加入检测探针进行处理，以识别滚环扩增产物，进而通过检测设备进行检测以确定上述第一蛋白和第二蛋白的互作情况。
8、在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中，先加入一夹板探针进行处理，该夹板探针分别与上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列的一部分互补配对，使得上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此靠近，形成稳定的v形结构。
9、在本发明的一个优选实施方案中，所述检测探针标记有荧光基团。
10、在本发明的一个优选实施方案中，所述第一一抗和第二一抗的种属来源不同。
11、进一步优选的，所述第一二抗和第二二抗的种属来源相同或不同。
12、更进一步优选的，所述第一一抗和第二一抗的分别来源于兔和鼠。
13、再进一步优选的，所述第一二抗和第二二抗的均来源于山羊。
14、在本发明的一个优选实施方案中，所述待测样品为离体培养的细胞样品或组织切片样品。
15、进一步优选的，所述组织切片为经福尔马林固定而得的石蜡包埋组织切片或新鲜冰冻切片。
16、进一步优选的，所述离体培养的细胞样品为细胞爬片。
17、本发明的有益效果是：
18、1、本发明引入了夹板探针，能够特异性地识别并结合抗体-寡核苷酸偶联物上的两条特定寡核苷酸序列，形成稳定的v形结构。该v形结构作为成环模板，能有效介导成环探针的环化过程。
19、2、相较于现有技术中使用的短序列探针，本发明夹板探针的引入显著提高了环化效率和检测灵敏度，解决了低杂交效率和环化难题。
20、3、本发明中成环探针环化后形成的结构与传统方法不同，仅具有一个3'端与环状dna分子互补。这种设计减少了滚环扩增过程中由于两个引物端带来的竞争关系，从而提高了检测效率。
21、4、本发明通过高度整合邻位连接技术、滚环扩增技术和原位杂交技术，实现了对细胞和组织中蛋白质相互作用的定量和定位检测，不仅提升了蛋白质相互作用检测的灵敏度和效率，还为细胞和组织中蛋白质相互作用的研究提供了一种新的技术手段。
1.一种改进原位邻位连接技术检测效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，先加入一夹板探针进行处理，该夹板探针分别与上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列的一部分互补配对，使得上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此靠近，形成稳定的v形结构。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测探针标记有荧光基团。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一一抗和第二一抗的种属来源不同。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一二抗和第二二抗的种属来源相同或不同。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一一抗和第二一抗的分别来源于兔和鼠。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述第一二抗和第二二抗的均来源于山羊。
8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述待测样品为离体培养的细胞样品或组织切片样品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述组织切片为经福尔马林固定而得的石蜡包埋组织切片或者新鲜冷冻切片。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述离体培养的细胞样品为细胞爬片。
