本发明属于生物，涉及一种膀胱癌检测方法，尤其涉及一种基于尿液脱落细胞的压力信号检测膀胱癌的方法。
背景技术：
1、膀胱癌是男性第四大常见癌症，居泌尿系统肿瘤发病率、致死率的第一位，是全世界癌症相关死亡的重要原因之一。近些年随着我国社会经济的发展、居民生活方式、饮食结构的改变以及人口老龄化进程的加快，近年来中国的膀胱癌发病率和死亡率逐年上升。膀胱癌患病人群中性别和年龄差异明显，高龄人居多，男性多于女性，但中青年发病率有渐进升高现象。90%以上的膀胱癌为尿路上皮癌，根据其肌层浸润程度，可分为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, mibc)和非肌层浸润性膀胱癌(non-muscleinvasive bladder cancer, nmibc)。约5%的膀胱癌患者确诊时已发生远处转移，并且晚期或转移性膀胱癌患者的5年生存率低于15%。因此，膀胱癌的“早发现”、“早诊断”、“早治疗”无论是对患者个人还是对社会层面都极其重要；早期诊断并且早期治疗膀胱癌不仅可以明显改善患者预后，还可以减少社会经济负担。膀胱癌治疗的最大挑战之一是其高复发和转移风险。经尿道膀胱肿瘤切除术是目前非肌层浸润性膀胱癌的主要诊断和治疗方法，并伴有其他辅助治疗，如灌注化疗。辅助治疗在一定程度上可以降低膀胱癌的复发和转移风险，但仍不能完全阻止癌症的发展。因此，定期监测膀胱癌对于早期发现肿瘤进展和延长患者生存期是必要的。目前，膀胱癌的诊断和监测主要是基于影像学检查、尿液脱落细胞学检查和膀胱镜活检。影像学检查对于多数早期膀胱癌的灵敏度欠佳，因此其不能作为早期肿瘤的检测方法。膀胱镜下取病理活检，其不仅具有侵入性，成本高，还会造成患者的疼痛和不适感。尿液脱落细胞学是膀胱癌检查的重要辅助方法，虽然其特异度高，但其灵敏度较低，大约在21%~50%之间，尤其在低级别膀胱癌中灵敏度更低，在极微小的膀胱恶性肿瘤容易被遗漏。因此，临床上亟需开发一种创伤性小、低成本、简便快捷且准确度高的膀胱癌检测方法。
2、申请人前期合成了具有压力信号放大作用的金纳米结构的金属纳米材料（shaliu, jian chai, shihao sun, lang zhang, jiayue yang, xu fu, jun hai, yu-hongjing, and baoduiwang.acsapplied materials&interfaces 2021 13 (39), 46451-46463），且ag-agcl@au-s-pfg-fa金属纳米材料具有良好的光热转化效率，其能够吸收光能并将其转换成热能，并且ag-agcl@au-s-pfg-fa金属纳米材料表面带有叶酸。本发明将金纳米材料与膀胱癌检测相结合，即运用金属纳米材料与尿液脱落肿瘤细胞相结合，检测其在激光照射条件下催化h2o2生成o2而产生的压力信号，进而构建一种创伤性小、简便快捷、低成本且准确度高的膀胱癌无创检测方法。
3、关于尿液脱落肿瘤细胞膜表面叶酸受体的表达量水平及通过尿液脱落肿瘤细胞的压力信号检测膀胱癌的研究截止至今还未曾有报道，本发明通过临床尿液样本数据来研究尿液脱落肿瘤细胞膜表面叶酸受体的表达量水平及其产生的压力信号，本发明的成果可以为临床检测膀胱癌提供新的无创检测方法及检测试剂盒。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种通过尿液无创检测膀胱癌的方法。旨在解决现有技术中膀胱癌的检测方法复杂、灵敏度偏低、稳定性差和成本高等问题。
2、本发明的技术方案如下：
3、研究发现膀胱癌患者尿液脱落肿瘤细胞膜表面的叶酸受体高表达，本发明利用尿液脱落肿瘤细胞膜表面叶酸受体高表达的特性，可以将尿液脱落肿瘤细胞与金属纳米材料孵育后通过叶酸与叶酸受体的识别作用进而将二者结合，并且对结合在肿瘤细胞上的纳米颗粒进行反应产生气体压力，并通过检测压力信号的大小来判断膀胱癌肿瘤细胞的存在，以此来无创检测膀胱癌。
4、本发明通过尿液无创检测膀胱癌的方法，通过检测尿液脱落细胞经纳米材料孵育后催化反应产生的压力信号来检测肿瘤细胞的存在进行膀胱癌无创检测，具体通过以下检测试剂盒和检测方法完成：
5、检测试剂盒：包括主体盒，主体盒内底端设有放样凹槽，放样凹槽内设置放样瓶，放样瓶上部设有压力计，压力计固定在主体盒的顶端，压力计下方设置测压探针，主体盒左侧设置激光发射器，激光发射器的激光探头正对放样瓶，主体盒右侧设有温度调节器，主体盒前端设置进样窗口。
6、检测方法：
7、（1）离心待测尿液样品，高速离心提取尿液脱落细胞；将纳米材料ag-agcl@au-s-pfg-fa加入至尿液脱落细胞并混匀，后置于37℃恒温培养箱内孵育0.8~1.2小时；ag-agcl@au-s-pfg-fa金属纳米材料表面带有叶酸，膀胱癌患者尿液脱落肿瘤细胞膜表面的叶酸受体高表达，二者孵育时可以通过叶酸-叶酸受体的识别而结合在一起；
8、高速离心的转速为3000rpm，离心的时间为15min；纳米材料ag-agcl@au-s-pfg-fa溶液的浓度为80~120ug/ml，溶剂为pbs；纳米材料ag-agcl@au-s-pfg-fa制备方法参见文献：sha liu, jian chai, shihao sun, lang zhang, jiayue yang, xu fu, jun hai,yu-hong jing, and baoduiwang.acs applied materials&interfaces 2021 13 (39),46451-46463。
9、（2）孵育完成后进行高速离心，弃上清液，提取孵育后结合纳米材料的尿液脱落细胞，用pbs清洗后再次高速离心，弃上清液，提取洗涤后结合纳米材料的尿液脱落细胞；通过两次高速离心及pbs清洗除去未结合尿液脱落细胞的纳米材料；高速离心的转速为3000rpm，离心的时间为15min。
10、（3）打开主体盒内的压力计、温度调节器和激光发射器预热，将主体盒的温度调控至35~38℃。
11、（4）将h2o2、naoh溶液及孵育洗涤后结合纳米材料的尿液脱落细胞加入放样瓶中混匀，迅速盖上密封瓶盖进行密封；h2o2的浓度为30%,naoh溶液的ph=12，naoh溶液和h2o2的体积比为18:1~20:1；naoh溶液提供强碱环境，强碱环境下ag-agcl@au-s-pfg-fa金属纳米材料催化h2o2分解生成o2的催化效果最好。
12、（5）将密封后的放样瓶通过主体盒前端的进样窗口迅速转移至预热后的主体盒内部的放样凹槽内，并将压力计的测压探针通过密封瓶盖迅速插入放样瓶内，进行压力信号的检测；
13、（6）记录检测10分钟后的压力信号数值，高于或等于5.6kpa判断为“膀胱癌”，低于5.6kpa则判断为“非膀胱癌”。
14、检测机理：ag-agcl@au-s-pfg-fa金属纳米材料具有良好的光热转化效率，其在激光的照射下，可以吸收光能将其转换成热能，进而起到类似过氧化氢酶活性的作用，催化h2o2分解生成o2而产生压力信号，压力信号为生成的o2而产生的气体压力。在激光的照射下，结合在膀胱癌患者尿液脱落肿瘤细胞膜表面的纳米材料催化h2o2分解生成o2而产生压力信号，将叶酸-叶酸受体识别的分子信号转化为放大的压力信号，通过检测压力信号的大小来判断膀胱癌肿瘤细胞的存在。
15、通过大量研究发现非膀胱癌患者尿液脱落细胞膜表面的叶酸受体表达量低，故其孵育结合的纳米材料少，从而催化h2o2分解生成o2而产生压力信号小，低于5.6kpa。而膀胱癌患者尿液脱落肿瘤细胞膜表面的叶酸受体表达量高，故其孵育结合的纳米材料多，从而催化h2o2分解生成o2而产生压力信号大，高于或等于5.6kpa，以此来无创检测膀胱癌。
16、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
17、（1）本发明发现膀胱癌患者尿液脱落肿瘤细胞膜表面的叶酸受体高表达，利用尿液脱落肿瘤细胞膜表面叶酸受体高表达的特性，其可以孵育结合上纳米材料并分解h2o2而产生压力信号。本发明首次提出了一种通过尿液脱落肿瘤细胞的压力信号进而无创检测膀胱癌的新辅助检测方法及检测试剂盒。
18、（2）结果判断简单快速、明确且经济。本发明仅需要观察达到检测时间后压力计上显示的压力数值即可对膀胱癌与否进行初步判断，对比影像学检查、尿液脱落细胞学检查和膀胱镜活检此类诊断和检测膀胱癌的常规方法，其不需要影像科或病理科此类医生的参与，检测人员不需要病理学科、影像学科等专业知识即可非常容易地鉴别出尿液中的膀胱癌细胞，可以减少膀胱癌诊疗的人工成本，特别适用于快速筛查。
19、（3）阳性检出率较高。本发明通过研究得出检测膀胱癌压力的最佳截断值为5.6kpa，即尿液样本产生的10分钟压力信号高于或等于5.6kpa判断为“膀胱癌”，低于5.6kpa则判断为“非膀胱癌”。基于上述检测膀胱癌的压力最佳截断值，本发明阳性检出率为67.07%，而目前诊断膀胱癌常用的尿液脱落细胞学检查的阳性检出率仅为30%左右。
1.一种通过尿液无创检测膀胱癌的方法，其特征在于：该方法通过以下检测试剂盒和检测方法完成：
2.根据权利要求1所述的通过尿液无创检测膀胱癌的方法，其特征在于：压力计（2）固定在主体盒（1）的顶端。
3.根据权利要求1所述的通过尿液无创检测膀胱癌的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中，高速离心的转速为3000rpm，离心的时间为15min。
4.根据权利要求1所述的通过尿液无创检测膀胱癌的方法，其特征在于：步骤（1）中，纳米材料ag-agcl@au-s-pfg-fa溶液的浓度为80~120ug/ml，溶剂为pbs。
5.根据权利要求1所述的通过尿液无创检测膀胱癌的方法，其特征在于：步骤（4）中，naoh溶液的ph=12 , h2o2的浓度为30%。
