本发明属于合成生物学，具体涉及一项关于制备能够自主分裂的人造细胞的方法。
背景技术：
1、细胞自我复制是生命的基本特征之一，也是细胞周期中的关键环节。该过程涉及多种特定蛋白质和复杂的细胞信号传导途径，确保母细胞精确地分裂为两个子细胞。在真核生物中，细胞分裂依赖于肌动蛋白-肌球蛋白环和内体分选复合体(escrt)的协同作用，涉及众多蛋白质的复杂交互。相比之下，细菌细胞分裂主要由ftsz蛋白主导，该蛋白类似于微管蛋白，引导细胞壁的向内生长以实现分裂，但需要约30种蛋白的辅助。古细菌，虽同为原核生物，但其细胞分裂机制展现了独特的多样性，拥有特有的微管蛋白家族蛋白，这些蛋白在控制细胞形态方面发挥关键作用。
2、古细菌的cdv系统提供了一种相对简单的膜变形和裂解机制，与真核生物的escrt系统和细菌的ftsz环不同。cdv系统由cdva、cdvb和cdvc三种蛋白质组成。cdva是古细菌特有的蛋白质，而cdvb与真核生物的escrt-iii蛋白具有序列相似性，cdvc则作为一种aaaatp酶，在功能上与真核生物的vps4蛋白相似。这些蛋白质在细胞分裂晚期形成分裂复合体，引导细胞膜的闭合和分裂。古细菌的cdv分裂机制研究为揭示细胞分裂的多样性提供了关键线索，展现了生命在不同进化路径上的适应性。这一研究不仅为理解真核生物和原核生物细胞分裂机制的进化关系提供了新视角，而且具有以下重要意义：1、生物工程应用：古细菌的cdv分裂机制可能成为生物工程的新工具。2、抗病原体策略：通过干扰cdv途径，可能开发出抑制病原性古细菌生长的新策略。3、环境科学研究：了解古细菌的cdv分裂机制有助于研究其在极端环境中的生存策略，对环境监测和生物地球化学循环研究具有重要意义。
3、在人造细胞的研究中，使用了多种材料，包括脂质、聚合物、脂质/聚合物复合体、天然细胞膜、胶体等，以赋予人造细胞多种功能，如能量产生、生长、形态变化和分裂。磷脂作为细胞基础分子，形成的单层囊泡分为guvs、luvs和suvs三种类型，这些囊泡在生物研究和药物传递中有特定应用。特别是guvs，因其与天然细胞相似，可作为模型探索基本细胞生物学过程。在人造细胞内部实现自主分裂，不仅有助于深入理解细胞分裂的基本机制，而且自主分裂的人造细胞可作为研究癌症、遗传性疾病等疾病的模型，揭示疾病的发生和发展机制；增强对细胞分裂机制的理解，对细胞生物学和分子生物学领域的研究具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决目前的人造细胞无法实现自主分裂的问题，提供一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
3、一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，所述方法为：
4、步骤一：构建质粒：在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的基因数据库中下载cdva、cdvb、cdvc三种蛋白的基因序列并重组到载体上，进行质粒合成，载体选择pdest-17，在snapgene软件上确定引物序列和酶切位点，保留n端6xhis标签；
5、步骤二：大肠杆菌异源表达与蛋白质提取：利用热激法将步骤一制备的质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；20小时后挑单菌落于300ml液体培养基中过夜培养；将所得菌液以1：50的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，培养至菌液od600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和4mg/mll-阿拉伯糖，并将培养温度调整至25℃诱导10小时；将培养10h的菌液在冷冻离心机中8000rpm 4℃离心3min，弃上清液保留沉淀，用pbs缓冲液清洗沉淀并以8000rpm 4℃离心3min，重复3次，得到蛋白过表达的大肠杆菌，保存在-80℃冰箱；重悬菌体后破碎，所得破碎菌体再次离心后取上清液利用镍螯合亲和层析柱和尺寸凝胶排阻色谱进行纯化，获得cdva、cdvb和cdvc三种目的蛋白，通过sds-page检测蛋白的纯度，加入甘油等保护剂后储存于-80℃；
6、步骤三：乳液法制备包封三种蛋白的人造细胞：通过乳液法将10mm cdva复合物、1mm cdvb复合物、1mm cdvc三种蛋白包封到囊泡中；fitc-cdva复合物先与人造细胞膜发生相互作用，利用其e3b域随后招募cy5-cdvb复合物，随后cy5-cdvb与cdvc之间相互作用。最终，fitc-cdva复合物、cy5-cdvb复合物、cdvc均在人造细胞膜上。
7、步骤四：蜂毒素打孔使atp进入：向步骤三的包封有三种分裂蛋白混合物的磷脂囊泡溶液中加入蜂毒素，使蜂毒素的终浓度为1-2μg/ml，放置10min-20min，然后向囊泡溶液中加入atp，atp通过蜂毒素孔进入囊泡内部，在atp的作用，cdvc蛋白行使其功能，驱动人造细胞发生形变。
8、进一步地，步骤二中，所述固体培养基中，包括10g/lnacl，10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉，15g/l琼脂；所述液体培养基中包括10g/lnacl，10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉。
9、进一步地，所述步骤二具体为：将质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；20小时后挑单菌落于300ml液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；将所得菌液以1：50的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，37℃，200rpm培养至菌液od600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和4mg/ml l-阿拉伯糖并将培养温度调整至25℃诱导10小时；8000rpm离心收集菌体，重悬菌体后用超声破碎仪破碎；所得破碎菌体于4℃，12000rpm离心后取上清液利用镍螯合亲和层析柱和尺寸凝胶排阻柱进行纯化，获得目的蛋白。
10、进一步地，步骤二中，还包括以下操作：为了在囊泡内部便于观察cdva和cdvb的功能，利用绿色荧光探针fitc和红色荧光探针cy5-nhs分别标记cdva和cdvb。(1)绿色荧光探针fitc标记cdva蛋白：取新鲜配制的50μl的1mg/mlfitc缓慢加入到1ml cdva蛋白中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部；切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育8h，每隔30min，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。加入5m的nh4cl至终浓度50mm，4℃终止反应2h；将反应混合物装入sephadex g-25色谱柱顶部，当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入pbs(ph 9)；向样品中继续加入pbs(ph 9)，完成柱纯化后，获得fitc-cdva的复合物；(2)红色荧光探针cy5-nhs标记cdvb蛋白：取1ml cdvb蛋白与10μl 10％(v/v)dmso配制的12mg/ml cy5-nhs酯混合，并在冰上孵育2小时；然后将50ml的1m tris-hci(ph 8.0)添加到反应溶液中；将反应混合物上样到15ml sephadex g-25柱上，完成柱纯化后，获得cy5-cdvb的复合物。
11、进一步地，在人造细胞中部署三种古细菌的关键分裂蛋白等，在人造细胞中实现自主分裂，囊泡中ph为9，温度为37℃，利用蜂毒素使囊泡形成孔洞，使外部的atp进入囊泡内引发反应，实现人造细胞的分裂。
12、本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明主要通过在囊泡中包封三种古细菌关键的分裂蛋白，通过蜂毒素在磷脂囊泡上产生孔洞，可以使外界的atp进入磷脂囊泡内部，引发一系列的反应，获得可自主分裂的人造细胞。该方法制备的人造细胞可以利用共聚焦显微镜表征，判断人造细胞的变形程度和膜断裂。该方法可实现由简单蛋白实现子代繁衍，具有重要的生理意义。
1.一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，其特征在于：所述方法为：
2.根据权利要求1所述的一种自主分裂的人造细胞的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述固体培养基中，包括10g/lnacl，10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉，15g/l琼脂；所述液体培养基中包括10g/lnacl，10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉。
3.根据权利要求1所述的一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，其特征在于：所述步骤二具体为：将质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；20小时后挑单菌落于300ml液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；将所得菌液以1：50的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，37℃，200rpm培养至菌液od600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和4mg/ml l-阿拉伯糖并将培养温度调整至25℃诱导10小时；8000rpm离心收集菌体，重悬菌体后用超声破碎仪破碎；所得破碎菌体于4℃，12000rpm离心后取上清液利用镍螯合亲和层析柱和尺寸凝胶排阻柱进行纯化，获得目的蛋白。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种自主分裂的人造细胞的制备方法，其特征在于：步骤二中，还包括以下操作：(1)绿色荧光探针fitc标记cdva蛋白：取50μl的1mg/mlfitc缓慢加入到1ml cdva蛋白中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部；将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育8h，每隔30min，将反应小管轻轻颠倒几次，加入5m的nh4cl至终浓度50mm，4℃终止反应2h；将反应混合物装入sephadex g-25色谱柱顶部，当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入pbs(ph 9)；向样品中继续加入pbs(ph 9)，完成柱纯化后，获得fitc-cdva的复合物；(2)红色荧光探针cy5-nhs标记cdvb蛋白：取1ml cdvb蛋白与10μl 10％(v/v)dmso配制的12mg/ml cy5-nhs酯混合，并在冰上孵育2小时；然后将50ml的1m tris-hci(ph8.0)添加到反应溶液中；将反应混合物上样到15mlsephadex g-25柱上，完成柱纯化后，获得cy5-cdvb的复合物。
5.根据权利要求1所述的一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，其特征在于：囊泡中ph为9，温度为37℃。
