本发明属于微生物检测领域，涉及拉曼技术平台，特别是指一种agnps纳米阵列芯片及其制备方法和在定性识别益生菌中的应用。
背景技术：
1、益生菌的概念最早源于希腊语，意为“对生命有益”。益生菌是指通过改善类肠道菌群进而改善人体健康状况的一类活菌，不仅具有赋予发酵食品独特风味，提高食品营养价值的功能，而且其还具有调节胃肠道菌群正常和维持人体肠道健康平衡的功能。益生菌主要包括乳酸菌(乳杆菌、乳球菌)和酵母菌等，在发酵食品领域有着悠久的应用历史。天然发酵食品种类丰富，是世界饮食文化中独特的重要组成部分。天然发酵食品是微生物联盟的中心和天然的益生菌宝库，多种多样的益生菌交互作用赋予了产品独特的风味和营养价值，给消费者带来健康益处。深入持续筛选挖掘具有良好发酵性能和益生特性的益生菌菌种资源，对传统发酵食品工业化发展是一项任重道远且须坚持不懈的任务。
2、目前，发酵食品中益生菌常用的筛选鉴定方法，主要包括标准平板菌落计数、聚合酶链反应(pcr)和酶联免疫吸附试验(elisa)。菌落计数是细菌检测的标准方法，但需要24～72h，劳动强度大，耗时长。elisa和pcr具有较高的灵敏度，将检测时间缩短到几个小时，但elisa反应中抗体之间可能产生交叉反应，且蛋白质样品保留时间短，pcr需要对细菌易出现假阳性问题，同时两者都需要多个预处理步骤、精密仪器和专业操作。细菌全基因组测序可以对细菌的全基因组进行测序，获取其完整的dna序列信息，这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征从而区分和鉴定不同种属益生菌，信息丰富且准确性高。但是其检测需要提取dna、构建文库和测序等步骤，费用昂贵，检测周期长且需要专业操作。所有这些方法通常都需要基于培养的菌株分离步骤，可能需要长达5～7天的时间，(对于生长缓慢的细胞甚至更长，比如酵母菌)，因此大大延迟了报告时间。因此，依靠平板菌落计数、elisa、pcr技术和细菌全基因组测序对益生菌的检测具有滞后性、困难性，难以满足发酵食品中庞杂大量益生菌的初筛鉴定需求。为了克服这些不足，开发具有更便捷、更短分析时间和更可靠的益生菌快速筛选鉴定策略是非常必要的，可以减少前期大量的、繁杂重复性的初筛工作，为进一步深入挖掘功能性菌株奠定基础。发酵食品中益生菌的快速、可靠定性识别和数字化定量策略可以为今后发酵食品生产过程中对它们进行安全和质量控制提供技术支撑和保障。
3、随着光学检测技术的发展，方便快捷的光谱检测技术越来越多的应用于益生菌检测。例如，荧光光谱技术，通过检测样本所发出的荧光光谱或强度来测定样品中的荧光物质和含量，图谱合一鉴别快速，但缺乏化学结构信息的特异性，易受元素相互干扰和重叠峰的影响，难于分析；近红外光谱技术主要是通过使用含氢基团，有效获取样本光谱中所包含的物理信息、化学信息或生物信息，快捷无损，易操作和成本低，但不适用于水分含量大的样本检测，灵敏度低。高光谱技术虽然采集的样品信息更加全面，但也导致数据量大，信息掺杂冗余，宏观图像难以准确表征益生菌等微观生物信息。这些方法对益生菌的的检测都存在难以避免的局限性。相比之下，拉曼光谱是一种散射光谱，是目标检测物中分子键被激发到虚能态却尚未恢复到原始态所引起的、入射光被散射后频率发生变化的现象可以反应分子中固有的化学键振动、旋转和其他低频振动模式。它反映了目标物的“指纹效应”的分子振动光谱，可以提供细胞中丰富的分子结构和组成信息，具有无需标记、操作简便、检测时间短且无损等优势，缺点是检测信号弱，但结合固体金属粗糙表面或者纳米溶胶悬浮液为基底(例如金、银等贵金属)，开发表面增强拉曼光谱技术(sers)，可实现拉曼信号的显著增强，从而获得更多的微生物信号。sers作为一种生物指纹识别技术，在发酵食品中益生菌快速检测应用及生物表型研究中是非常有前景的。
4、近年来，“拉曼组”这一创新概念被提出，即将拉曼光谱(rs)作为一种新兴的组学技术。拉曼组是一种基于单个细胞的拉曼光谱可反映细胞内化学物质的成分及含量等丰富信息条件下形成的一种单细胞精准生理表型组学，是在特定条件和时间下一个细胞群体中采集的多个单细胞拉曼光谱的集合，体现的是该细胞群体的“单细胞代谢功能集体照”。微生物细胞的拉曼光谱上每个峰或峰的组合均可能代表一个代谢表型(phenotype)，可以揭示该微生物细胞在该状态下的代谢表型组。拉曼组具有广阔的应用前景，其能够测量的表型范围仍在不断研究拓展中。对于一个可靠的拉曼光谱识别，一个高质量的拉曼信号是一个非常重要的参数。然而，由于拉曼散射的效率较低，整体的拉曼信号较弱。为了获得令人满意的微生物单细胞拉曼指纹图谱，制备具有纳米粒子分布均匀、结构稳定和增强效果出色的sers底物是“拉曼组”应用于发酵食品中益生菌快速检测和生理特性研究的必要先决条件。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提出一种agnps纳米阵列芯片及其制备方法和在定性识别益生菌中的应用。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、一种agnps纳米阵列芯片的制备方法，步骤如下：
4、(1)向硝酸银水溶液中加入盐酸羟胺水溶液和氢氧化钠溶液，搅拌反应至得到黄绿色的agnps溶胶；
5、(2)干净的玻璃片经食人鱼溶液处理得羟基化的玻璃片，再置于pdda溶液中进行修饰，得pdda修饰过的玻璃片；
6、(3)步骤(1)的agnps溶胶经离心去上清后，溶于去离子水中，再加入环己烷和乙醇，静置挥发至无环己烷，所得溶液转移至经步骤(2)处理的pdda修饰过的玻璃片上，即得agnps纳米阵列芯片。
7、上述步骤(1)中硝酸银水溶液的浓度为0.15-0.20mg/ml；盐酸羟胺水溶液的浓度为47.50-49.50mmol/l；氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.3mol/l。
8、上述硝酸银水溶液、盐酸羟胺水溶液和氢氧化钠溶液的体积比为45-50:2-3:2-3。
9、上述步骤(2)中食人鱼溶液为体积比3:7的双氧水和浓硫酸混合液；其中双氧水的浓度为30wt％、浓硫酸的浓度为98wt％；所述pdda溶液的浓度为0.5-1wt％；修饰的时间为40-80min。
10、上述步骤(3)中agnps溶胶与环己烷和乙醇的体积比为8-10:1-3:1-3；离心的条件为9000-10000rpm/min。
11、上述的方法制备的agnps纳米阵列芯片。
12、上述的agnps纳米阵列芯片在增强益生菌拉曼检测信号中的应用，步骤为：将待测益生菌溶液滴加至agnps纳米阵列芯片上，然后自然晾干，然后使用拉曼光谱仪对菌体细胞进行测量。
13、基于上述的agnps纳米阵列芯片的定性识别发酵食品中益生菌的方法，步骤为：将待测益生菌溶液滴加至agnps纳米阵列芯片上，自然晾干，然后使用拉曼光谱仪对菌体细胞进行测量，记录拉曼光谱特征。
14、上述拉曼光谱仪的参数为：激发光源为532.8nm氦氖激光、物镜使用100倍，积分时间为3s，检测功率为5mw，光栅为600g/mm，拉曼光谱扫描范围设置为400-1800cm-1，仪器激光强度为6mw，积分时间为15s，累积次数3次。
15、进一步的，通过以下任一种方式对拉曼信号进行处理：
16、①若待测益生菌的拉曼光谱特征中776～783cm-1(cytosine or uracil(nucleicacids))、887～891cm-1(phosphodiester backbone,deoxyribose)、999～1004cm-1(phenylalanine(proteins))和1081～1097cm-1(po2(nucleic acid))共同存在时为乳酸菌属；待测益生菌的拉曼光谱特征为478～484cm-1(skeletal modes of carbohydrate)、511～521cm-1(s–s stretch(proteins))、593～601cm-1(c-c twist aromatic ringstructure)、669～684cm-1(c-c twist aromatic ring structure)、745～748cm-1(nag,nam(glycosidic ring mode))、839～853cm-1(proline,hydroxyproline and tyrosine)和1123～1127cm-1(c-c/c-n stretching(proteins))时为酵母菌属；
17、②将待测益生菌的指纹图谱与已知益生菌的指纹图谱进行比对，一致则为已知益生菌。
18、本发明具有以下有益效果：
19、1、本技术制备了信号稳定且增强效果良好的agnps纳米阵列芯片(agnps nac)作为基底材料，结合sers技术建立了一个8种常见益生菌的ramanome参考数据库。进一步，结合组学科研工具metaboanalyst 5.0解析拉曼光谱特征的生物学信息和主要差异成分物质，并使用具有直观、高效的sca系统发育树和cnn机器学习算法进行了定性识别能力和检测灵敏度的确定。在此基础上，构建了一种适用于不同种类食品介质的、无需培养的益生菌快速分离富集方法，对其回收率和sers检测的定性模型进行验证如图1所示。本研究通过对复杂食品基质中益生菌“先筛后养”方法的探究，以期突破了目前“先养后筛”传统范式的原理性局限，为益生菌资源的挖掘提供了良好的技术支撑。
20、2、本技术发现8种益生菌sers光谱的主要差异波段和物质是776～783cm-1(cytosine or uracil(nucleic acids)),999～1004cm-1(phenylalanine(proteins)),1123～1127cm-1(c-c/c-nstretching(proteins)),1230～1255cm-1(po2-expansion,amideiii),1306～1319cm-1(amide iii),1655～1667cm-1(amide i(protein))，这些sers拉曼位移相应的生物学信息大多数和dna/rna、蛋白质和脂质的一些典型的化学键和振动形式有关，这是由于所有细菌的蛋白质、脂质和核酸的组成和类型因物种而异。进一步，通过sca和cnn化学计量学算法，实现了sers光谱的定性识别，sca不仅可以清晰区分不同种属的乳酸菌和酵母菌，并且可以表明同一种属乳酸菌和同一种属酵母菌之间的亲缘性和差异性，cnn的识别准确率可以达到100％，即使在样品浓度低至10cfu/ml时也表现良好识别灵敏度。最终，我们通过速度梯度离心和密度梯度差速离心法，实现了不同食品介质中乳酸菌和酵母菌的分离纯化和富集，平均加标回收率均大于98％，经过sers光谱采集和分类模型验证，证实了该方法可实现不同益生菌的拉曼光谱特征结构差异和高准确性的快速定性识别。
1.一种agnps纳米阵列芯片的制备方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的agnps纳米阵列芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中硝酸银水溶液的浓度为0.15-0.20 mg/ml；盐酸羟胺水溶液的浓度为47.50-49.50 mmol/l；氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.3 mol/l。
3.根据权利要求2所述的agnps纳米阵列芯片的制备方法，其特征在于：所述硝酸银水溶液、盐酸羟胺水溶液和氢氧化钠溶液的体积比为45-50:2-3:2-3。
4.根据权利要求1所述的agnps纳米阵列芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中食人鱼溶液为体积比3:7的双氧水和浓硫酸混合液；其中双氧水的浓度为30wt%、浓硫酸的浓度为98wt%；所述pdda溶液的浓度为0.5~1wt%；修饰的时间为40~80 min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的agnps纳米阵列芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中agnps溶胶与环己烷和乙醇的体积比为8-10:1-3:1-3；离心的条件为9000-10000rpm/min。
6.权利要求5所述的方法制备的agnps纳米阵列芯片。
7.权利要求6所述的agnps纳米阵列芯片在增强益生菌拉曼检测信号中的应用，其特征在于，步骤为：将待测益生菌溶液滴加至agnps纳米阵列芯片上，然后自然晾干，然后使用拉曼光谱仪对菌体细胞进行测量。
8.一种定性识别益生菌的方法，其特征在于，基于权利要求6所述的agnps纳米阵列芯片，步骤为：将待测益生菌溶液滴加至agnps纳米阵列芯片上，自然晾干，然后使用拉曼光谱仪对菌体细胞进行测量，采集拉曼信号，获得待测益生菌的拉曼光谱特征或指纹图谱。
9.根据权利要求8所述的定性识别益生菌的方法，其特征在于，所述拉曼光谱仪的参数为：激发光源为532.8 nm氦氖激光、物镜使用100倍，积分时间为3 s，检测功率为 5 mw，光栅为600 g/mm，拉曼光谱扫描范围设置为400-1800 cm-1，仪器激光强度为6 mw，积分时间为15 s，累积次数3次。
10.根据权利要求8所述的定性识别益生菌的方法，其特征在于，通过以下任一种方式对拉曼信号进行处理：
