本发明涉及生物，更具体的说是涉及一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法。
背景技术：
1、目前相对有效的毛发再生技术手段包括药物干预和毛囊移植。
2、市面常用药物有6种，包括米诺地尔、非那雄胺、氟他胺、二苯环丙烯酮、维a酸、安体舒通等，分别对应不同的症状。药物干预虽有效，但副反应明显，药效持续时间较短，对人体损伤较大。
3、毛囊移植目前采用毛囊单位头皮条切取技术(follicular unittransplantation，fut)将毛囊移植到特定区域达到毛发的持续生长。然而该技术在治疗效果中个体差异较大、创伤较大，尤其体内组织分离毛囊操作繁琐、毛囊生物学活性低且脱发者供体毛囊有限、不可再生等瓶颈，限制了毛囊移植毛发再生技术的广泛应用。
4、因此，提供一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法。
2、毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。本发明目的在于以项目前期技术支持，建立一种新型人类毛囊干细胞(hfscs)制备方法，生产活性批次均一、稳定的毛囊干细胞生物制剂及其衍生物。
3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
4、针对现有人类毛囊干细胞(hfscs)制备的技术瓶颈，本发明建立了一套无痛、操作简单、稳定性好、可无限扩增且高质量的hfscs制备体系。整体过程包括：(1)建立非整合非病毒、无血清、培养基成分明确、无饲养层细胞的ipscs细胞株。(2)ipscs高效分化为hfscs。具体步骤如下：
5、1)建立非整合非病毒、无血清、培养基成分明确、无饲养层细胞的ipscs细胞株。
6、主要步骤如下：
7、(1)干细胞准备：利用化学成分明确、无血清、无动物源成分mscs培养基(友康nc0103)复苏培养脐带来源间充质干细胞(umscs)，在显微镜下观察细胞汇合度在70％-80％时，利用trypletm express(thermo fisher scientific)消化后收集细胞，然后利用台盼蓝染色(stemcell technologies)及细胞计数仪(countstar)计算细胞活率大于90％时，将细胞铺板至预先包被10μg/孔玻连蛋白(vitronectin，stemcell technologies)的6孔板中，每孔细胞铺板5-10万个细胞总数，优选5万个，然后转移至37℃二氧化碳培养箱培养24小时。
8、(2)细胞转染：显微镜下观察细胞在25％-30％的汇合度时，吸去mscs培养基，加入1ml d-pbs(不含ca2+和mg2+)清洗1遍，然后加入含1ml 175ng/ml b18因子的mscs培养基放回37℃培养箱培养20分钟。然后每个6孔板中均匀滴加在室温放置5分钟后的mrnacocktails试剂组合(stemcell technologies，具体包括1μl reprornatm-oksgm，100μlireduced-serum medium，2μl reprornatm transfection supplement和2μlreprornatm transfection reagent)，然后转移至37℃二氧化碳培养箱培养24小时。
9、(3)加药筛选：吸弃6孔板中培养基，加入1.5ml筛选培养基(mscs培养基+175ng/mlb18因子+0.8μg/ml嘌呤霉素(puromycin,stemcell technologies)，然后转移至37℃二氧化碳培养箱培养24小时，每天换液，重复操作2-5天。
10、(4)去药培养：吸弃6孔板中培养基，加入1.5ml去药培养基(mscs培养基+175ng/mlb18因子)，然后转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养，观察细胞形态的变化，此时可观察到鹅卵石状上皮样细胞出现，每天换液，重复操作2天。
11、(5)克隆筛选：吸弃6孔板中培养基，加入1.5ml reprotesrtm培养基(stemcelltechnologies)，转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养，每天换液，在显微镜下追踪观察细胞形态变化，直至出现ipscs克隆(约2周后)。
12、(6)克隆挑取及鉴定：在显微镜下记录克隆形状并拍照标记，利用10μl移液枪吸取单个克隆转移至预先包被5μg玻连蛋白的12孔板中，加入1ml tesrtm-e8tm培养基(stemcelltechnologies)，用1ml移液枪吹打10次，标记passage 1，然后转移至37℃二氧化碳培养箱继续培养。3至5天后，ipscs汇合度在80％及以上时，用relesrtm消化液(stemcelltechnologies)消化ipscs后，以不低于1:10稀释比例进行传代扩增培养。待ipscs细胞培养至passage 8以后，进行质量鉴定，包括：a)细胞形态学分析；b)碱性磷酸酶染色；c)免疫荧光染色包括不局限于oct4、ssea-4和tra-1-60等；d)拟胚体三胚层分化；e)畸胎瘤等实验鉴定，确定其为质量较高的非整合非病毒ipscs细胞模型。
13、2)ipscs高效分化为hfscs。
14、主要步骤如下：
15、(1)ipscs细胞准备：利用essential 8tm培养基(gibco)复苏非整合非病毒ipscs至预先包被10μg玻连蛋白的6孔板中，至37℃二氧化碳培养箱培养至ipscs细胞达到80％至90％的汇合度。
16、(2)拟胚体(ebs)培养：吸弃essential 8tm培养基，加入1ml d-pbs(不含ca2+和mg2+)清洗1遍，3ml essential 8tm培养基(含rock抑制剂“y-27632”，1μl/ml)重悬，手动将ipscs集落分成小簇；使用p-1000移液枪上下吸移数次，以减小簇的大小(约50-100个细胞/簇)，转入新的6孔板中，转移至37℃二氧化碳培养箱培养24小时。隔天在显微镜下检查eb形成情况，更换新的essential 8tm培养基(含rock抑制剂“y-27632”，1μl/ml)，如此每天换液，重复操作2-4天。
17、(3)诱导hfscs：在显微镜下观察到明显拟胚体(eb)后，将eb收集在15ml锥形管中，去除上清液后，将eb移植到预包被48-96μg胶原酶i涂层的6孔板上，使用3ml hfscs分化培养基①进行培养，成分包括：dmem/f12培养基(gibco)，添加insulin(5μg/ml)、hydrocortisone(0.5μg/ml)、l-aa(l-抗坏血酸，0.3mmol/l)、adenine(24μg/ml)、bmp-4(骨形态发生蛋白4，25ng/ml)、atra(全反式维甲酸，1μm)和egf(重组人表皮生长因子，20ng/ml)，每天换液，37℃二氧化碳培养箱培养3天。
18、(4)hfscs培养：按照hfscs分化培养基①：hfscs分化培养基②比例分别为3：1、1：1、1：3的方式每天换液，将培养基更换为hfscs分化培养基②，其中hfscs分化培养基②成分包括：成分确定的角质形成细胞sfm培养基(gibco)、bmp-4(1ng/ml)和egf(20ng/ml)。之后继续每天换液，37℃二氧化碳培养箱培养5-7天可获得可移植的hfscs细胞。
19、(5)hfscs鉴定：经过扩增后的hfscs，包括但不限于以下鉴定，a)细胞形态学鉴定；b)角蛋白18(krt18)、转录因子p63、角蛋白14(krt14)、整合素β1(itgβ1)免疫荧光染色鉴定hfscs功能亚群；c)角蛋白18、转录因子p63荧光染色传代稳定性鉴定，确定其为质量较高的hfscs细胞模型。
20、3)高纯度的hfscs外泌体提取：
21、收集第4-6代hfscs培养上清液，4℃300g离心5-10分钟，收集上清①；将上清①4℃2000g-3000g离心10分钟，收集上清②；将上清②4℃7000-10000g离心10分钟，收集上清③；将上清③4℃100000g离心70分钟，收集上清④；将上清④4℃100000g离心70分钟，弃上清，每升上清液收集底部3-5ml获得外泌体。
22、进一步，所述的方法制备得到的毛囊干细胞功能亚群。
23、进一步，所述的毛囊干细胞功能亚群在毛发再生中的应用。
24、进一步，所述的方法制备得到的hfscs外泌体。
25、进一步，所述的hfscs外泌体在毛发再生中的应用。
26、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，首先利用mrna cocktails建立了一种无饲养层无血清的人类诱导性多能干细胞(ipscs)制备方法。该方法不需要饲养层细胞和胎牛血清，培养基成分明确，操作简单，无外源基因组整合风险，能够高效稳定地制备出人类ipscs细胞株。其次，优化人类毛囊干细胞(hfscs)分化体系，获得ipscs分化来源的hfscs。该方法可源源不断获得生产工艺稳定、分化一致性高、增殖能力强，高表达毛囊干细胞标志物krt18,itgβ1,p63及低表达标志物krt14的hfscs细胞株。解决了毛囊数量局限、不可再生且操作繁琐的问题，为建立临床应用级别的人类毛囊干细胞(hfscs)资源奠定了良好的技术基础。最后，培养hfscs后可获得hfscs来源的纯度较高的外泌体，用于改善毛囊生长微环境，促进毛发再生。该方法安全、高效、无创、价格较低，便于使用及成药。
1.一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，其特征在于，步骤1)所述建立非整合非病毒、无血清、培养基成分明确、无饲养层细胞的ipscs细胞株的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，其特征在于，所述hfscs分化培养基①成分包括：dmem/f12培养基，添加5μg/ml insulin、0.5μg/mlhydrocortisone、0.3mmol/l l-aa、24μg/ml adenine、25ng/ml bmp-4、1μm atra和20ng/mlegf。
4.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞功能亚群规模化制备方法，其特征在于，所述hfscs分化培养基②成分包括：成分确定的角质形成细胞sfm培养基，添加1ng/ml bmp-4和20ng/ml egf。
5.权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的毛囊干细胞功能亚群。
6.权利要求5所述的毛囊干细胞功能亚群在毛发再生中的应用。
7.一种hfscs外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.权利要求7所述的方法制备得到的hfscs外泌体。
9.权利要求8所述的hfscs外泌体在毛发再生中的应用。
