本发明涉及免疫细胞检测方法，特别涉及一种高效成人外周血免疫细胞检测方法。
背景技术：
1、流式细胞术是一种利用流式细胞仪(flow cytometer)检测标记的荧光信号，对单细胞悬液中细胞、血小板、细胞器等生物粒子实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的生物技术。随着多参数流式细胞术的应用，其已成为血液病研究和诊断不可或缺的生物技术。
2、而流式抗体是流式细胞术中能否成功的关键，在于购买的商品化抗体时，抗体的说明书中会有一个推荐的抗体使用浓度，这个浓度在一定程度上来说，是过饱和的，可以满足大多数实验的染色需求，但因为是过饱和的浓度，这就带来了一定程度的抗体浪费。
3、但是，传统的免疫细胞检测抗体添加量优化存在以下缺点：
4、(1)传统的添加量优化的优化过程一般是采用抗体滴定和信噪比的方法，但进行多色流式检测时，上述方法需要首先确定单一流式抗体最适浓度，然后用完整的多色流式抗体染色测试样本是否需要对某个抗体浓度做调整，然而，后续在进行多色测试时会出现荧光信号间干扰、渗漏，并造成反复地优化调整，导致产生工作量较大的弊端。
5、(2)在实际流式检测时，尤其是涉及到多色流式抗体荧光检测时，会分别加入单一流式抗体，若出现血液送达时间不一致的情况，导致多次重复操作，耗费人力。
6、(3)普通技术人员将流式抗体的推荐使用浓度认定为标准使用浓度，认为此浓度是最佳的使用浓度，其他浓度无法完成检测或认为检测效果最佳，已经形成了一种技术偏见。
技术实现思路
1、本发明提供了一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，其一方面解决了多色流式抗体染色时成本较高、工作量较大的技术问题，以求达到快速降低成本、同时可以满足实验需求的目的。另一方面为了提高实际操作时的灵活性，可以提前将单一流式抗体提前混合至一个完整的抗体染色管中，进一步提高多色流式检测操作时的灵活性。
2、本发明所采用的技术方案如下：
3、一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，包括以下步骤：
4、a、加入流式抗体：向流式管中加入流式抗体推荐添加体积量的一半，所述的流式抗体推荐添加体积量为8-12ul；
5、b、加入抗凝外周血样本：向流式管中加入抗凝外周血样本推荐体积量的一半，所述的抗凝外周血样本推荐体积量为80-120ul，加入后振荡混匀，在室温的环境下避光孵育20分钟；
6、c、加入溶血素：流式管中加入溶血素，加入后振荡混匀，在室温的环境下避光孵育10分钟；
7、d、第一次离心：在1600r，300g条件下离心5分钟，弃上清液，加入pbs缓冲液，充分振荡混匀；
8、e、第二次离心：在1600r，300g条件下离心5分钟，弃上清液，加入pbs缓冲液，振荡混匀；
9、f、存储待检：将混匀后的溶液存放在器皿内等待检测；
10、g、上机检测：将溶液待测样本上流式细胞仪进行检测。
11、优选的，步骤a中，加入流式抗体的具体方法是将多种流式抗体混合后放置24小时。
12、优选的，流式抗体为cd3-fitc、cd4-pe-cy7、cd4-apc-cy7、cd8-percp、cd16-pe、cd25-pe、cd28-apc-cy7、cd45-pe-cy7、cd45ra-pe-cy7、cd45ra-apc、cd56-apc-cy7、cd127-apc、cd197-pe(ccr7)、tcr-vδ2中的两种或两种以上的混合物。
13、优选的，步骤c中，溶血素与纯水的比例为1:9，进行稀释后使用。
14、优选的，步骤f中，存储温度为4℃避光放置，2小时内上机检测。
15、本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
16、本发明采用了将成人外周血加样体积和流式抗体体积同时减半的方法，实现了快速降低抗体使用成本并可满足实验需求；另一方面采用了将成人外周血免疫细胞检测使用的多种流式抗体提前进行24小时混合，实现多色流式抗体检测实际操作时的灵活性。
17、与现有抗体滴定和信噪比的方法相比，本技术方案提供一种可通用的抗体使用方法。将成人外周血加样体积和流式抗体体积同时减半，与说明书推荐添加量相比，偏差值均在±10％之内。说明可以在不降低抗体浓度的前提下达到快速降低抗体成本的目的，克服了现有的技术偏见。
18、另一方面，与成人外周血免疫细胞检测多色流式抗体依次添加相比，提前将抗体进行24h预混，与现用现混相比，平均偏差均在±10％之内。说明抗体提前预混24h基本不影响最终检测结果，提高实际操作时的灵活性。
1.一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，其特征在于，所述的步骤a中，加入流式抗体的具体方法是将多种流式抗体混合后放置24小时。
3.根据权利要求1或2所述的一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，其特征在于，所述的流式抗体为cd3-fitc、cd4-pe-cy7、cd4-apc-cy7、cd8-percp、cd16-pe、cd25-pe、cd28-apc-cy7、cd45-pe-cy7、cd45ra-pe-cy7、cd45ra-apc、cd56-apc-cy7、cd127-apc、cd197-pe(ccr7)、tcr-vδ2中的两种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，其特征在于，所述的步骤c中，溶血素与纯水的比例为1:9，进行稀释后使用。
5.根据权利要求1所述的一种高效成人外周血免疫细胞检测方法，其特征在于，所述的步骤f中，存储温度为4℃避光放置，2小时内上机检测。
