本发明属于组织工程和再生医学可植入人体中的医用生物材料领域，具体涉及一种用于治疗周围神经损伤的磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法及应用。
背景技术：
1、周围神经损伤是临床上常见的疾病。神经束是周围神经的基本单位，由神经纤维、施万细胞、血管和周围的结缔组织共同构成。与中枢神经系统相比，周围神经系统在损伤后具有显著的再生能力。周围神经系统中的施万细胞是一种再生细胞，它们在神经损伤后仍能保持修复能力。在损伤发生时，损伤部位的远端神经区域经历了瓦勒变性，并为随后的轴突再生创造了可能的微坏境。施万细胞在去分化后会增殖并纵向延伸形成büngner带，帮助引导轴突再生；它们还分泌各类细胞因子、生长因子、神经营养因子和细胞外基质分子，促进神经元存活和轴突再生。在各类因子的作用下，损伤神经元迅速激活内在程序并向其远端目标再生，在与再生轴突接触后，施万细胞再生轴突并排斥浸润的巨噬细胞，完成周围神经修复过程。
2、但严重周围神经损伤很难自行恢复，在不进行手术或药物干预下将导致永久性神经功能丧失，如运动功能丧失、慢性疼痛和肌肉萎缩等。目前，治疗周围神经损伤的“金标准”是自体移植，但由于该法存在诸如供体神经不足、供体部位感染等缺陷，且难以满足长段距离的缺损，造成供区继发性损伤和感觉丧失，从而限制了其临床应用，因此人工神经移植物成为了研究热点。但是，目前存在的神经移植物由于其所创造的微环境尚不能完全满足周围神经再生的要求，因此其再生效果仍然不及自体神经移植物，也不能很好地满足临床需求，亟需进一步改善移植物的性能。
3、理想的组织工程神经移植物，应该是生物支架与其内部的营养因子和仿生结构复合，仿生结构可以为神经细胞的迁移、增殖和功能化提供合适的微环境，并为轴突的定向生长提供接触指导，以提高神经对准的准确性。然而，由于天然神经结构的复杂性，制备具有微纳级神经样结构的人工神经移植物仍然是一个巨大的挑战。近年来，具有独特结构和性质的各种仿生微球已被开发为细胞载体和药物输送载体，作为一种可注射的具有良好信号递送功能的支架，微球可以被注射到不规则的缺损或损伤的组织中，从而比传统的3d支架手术的恢复时间缩短了几倍。到目前为止，已有不同形状和结构的微球被用于组织工程的研究，
4、短纤维可很好地模拟神经组织的物理微环境，能为细胞的生长提供合适的细胞外环境，有利于神经细胞的生长。如固心纤维、纳米纤维、中空纤维和纳米纤维。这些纤维能够很好地模拟神经组织ecm中纤维成分的纳米到微观形态和结构而被广泛应用于组织再生领域。在均质后获得的短纤维能很好地模拟ecm样结构，为组织修复提供了更高的可能性。而纳米短纤维微球具有较大的比表面积，使其具有较高的载药效率。因此，短纤维和微球结合了二者的优点，不仅能模拟仿真的ecm样形态，而且可以实现可注射，用于治疗创伤性疾病。微球具有高表面积体积比，为细胞生长提供了足够的空间。此外，具有功能结构的微球(负载药物、核壳)制备容易，可以有效地增强细胞和生物活性分子的传递。因此，功能纳米短纤维微球作为一种新型的可注射性支架，近年来引起了的广泛关注，有望在周围神经缺损修复方面起到促进作用。
5、研究发现，外界各种物理刺激如电、磁、光和声等能影响生物活动并调节细胞的行为。其中，磁刺激表现出优于其他类型刺激的优点，磁致动在无创治疗和非接触可控性，以及高穿透能力方面具有很大优势，在组织工程领域已有广泛应用，如进行细胞3d打印，诱导干细胞分化等。在低频磁场下，磁性纳米颗粒(mnps)运动可诱导负载磁性材料的磁机械驱动，可实现生物医学领域的无创治疗、磁控载药。电信号被认为是在神经发生过程中对神经细胞起重要促进作用的因子，也是设计神经修复支架的重要考虑因素。因此，一类具有压电效应的压电材料成为了组织工程的研究热点。压电生物材料在受到应力(变形)时可以产生电场(ef)，因此，它们可以通过刺激信号通路来改善组织修复和再生，一系列研究表明，压电聚合物和陶瓷诱导的电势可能会刺激硬组织的细胞反应和生物活性，在神经再生的无创治疗中具有巨大潜力。压电支架已作为修复缺损神经的一种有效材料。因此，制备添加有mnps(如fe3o4、fe2o3)和压电颗粒(例如batio3、zno)颗粒的短纤维，mnps可以在外界磁场的调控下，将机械力作用于纤维上的压电颗粒，使其产生压电效应，从而对周围细胞和组织进行相应的刺激和调控。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种用于治疗周围神经损伤的磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法及应用，以实现磁控产生压电效应。解决现有技术中难以实现的无创非侵入式体内产生压电效应，以及微球分布杂乱无法引导细胞定向生长等问题。本发明植被的微球能通过自身携带的磁性纳米颗粒响应外界磁场，并作用于短纤维上的batio3压电陶瓷颗粒，使微球产生压电效应。微球及微球内部的短纤维可在外界磁场的作用下，呈一定的取向性排列，这样的各向异性拓扑结构则可以很好地引导施万细胞伸长迁移、引导轴突延伸，加快周围神经再生修复的速度。相较于传统微球支架，该发明通过各向异性拓扑结构促进了断裂神经的定向伸长，创新性地使用了磁性纳米颗粒响应磁场并产生机械力作用于同一短纤维上的压电颗粒，从而产生磁控压电的现象，避免了传统压电材料在手术后无法正常施加压力产生压电效应。磁控压电方法简便易行，仅需将磁铁放置于磁控压电微球附近，使微球受到外界磁场并产生一定的机械力作用于压电纳米颗粒，便可产生压电现象。因此，针对市场相关产品的空缺，本发明是极具应用价值的。
2、为解决上述现存问题，本发明采用以下技术方案：
3、一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)采用表面修饰对磁性纳米颗粒和压电纳米颗粒进行表面改性，改善颗粒分散性、降解性和生物相容性；
5、(2)采用纳米纤维制备技术制备出直径为纳米级的、负载有磁性纳米颗粒和压电纳米颗粒的生物材料基微纳长纤维；
6、(3)将长纤维均匀分散在溶液中，采用微纳加工技术制备成长度分布在一定范围内的短纤维；
7、(4)将一定质量的短纤维分散在微球制备溶液中；
8、(5)采用微球制备技术将短纤维溶液制备成磁控压电短纤维微球，采用交联的方法使微球与液相分离；
9、(6)将形成的微球用筛网过滤，经洗涤处理后分散于溶液中，获得磁控压电短纤维微球支架。
10、优选的，所述生物材料基微纳长纤维的直径为10nm-500μm。
11、优选的，本发明中组织工程移植物主体优选为鸡卵清蛋白(ova)，聚己内酯(pcl)，丝素蛋白(sf)，壳聚糖(cs)等具有可纺性的材料中的一种或几种。
12、优选的，步骤(1)中压电纳米颗粒的浓度为0-2g/ml，筛选出能产生最大压电效应的浓度用于后续操作。
13、优选的，步骤(1)中磁性纳米颗粒的浓度为0-2g/ml，筛选出能通过响应磁场而产生最佳压电效应的浓度，用于后续操作。
14、优选的，步骤(2)中的纳米纤维制备技术，纳米纤维制备工程经历生物材料溶液的制备、超声震荡使磁性纳米颗粒和压电纳米颗粒均匀分散在生物材料溶液中、纳米纤维制备过程、有机溶剂的去除等过程。
15、优选的，步骤(3)中的短纤维浓度为0.1-1g/ml；短纤维制备过程的时间为1-20min，选择能制备出合适大小微球尺寸的短纤维长度。
16、优选的，步骤(1)中所述磁性纳米颗粒为fe、co、ni单体及其合金纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒中的一种或多种；所述压电纳米颗粒为zno，钙钛矿(srtio3,batio3，bi0.5na0.5tio3,knbo3或znsno3)、biox(，x＝cl、br、i等)，中的一种或几种；所述纳米颗粒的浓度范围为0.1-200mg/ml。
17、优选的，步骤(1)中所述表面修饰方法为无机金属修饰(au、ag等)、有机小分子修饰(油酸、单宁酸、油酸钠、十二烷基胺、γ-环糊精等)、高分子聚合物修饰(聚多巴胺、壳聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯亚胺等)、硅烷化修饰等其中的一种或几种方法；所述多巴胺修饰浓度为2mg/ml，壳聚糖修饰浓度为10-20mg/ml；
18、优选的，步骤(2)中所述纳米纤维制备方法为静电纺丝技术、微流控技术、3d打印技术、近场直写技术中的一种或几种；其中，所述静电纺丝参数为：流速为5-25μl/min，电压为10-25kv，接收距离为10-20cm，接收方式为平板接收或滚筒收集，滚筒接收的转速为1000-2000rpm，纺丝时间为6-12h；所述微流控技术参数为：推进速度为1-300μl/min；所述3d打印技术参数为：打印头的温度为5-15℃，打印平台的温度设置为-10℃，打印速度为5-20mm/s；所述近场直写参数为：针的内径为0.5mm，熔体推力为0.2mpa，每个样品的纤维间距设置为1.0mm，接收距离3-6cm，接收板移动速度为3-7mm/s，熔体温度为100-150℃；
19、优选的，步骤(2)中所述生物材料为天然生物材料(胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、丝素蛋白、卵清蛋白、壳聚糖、纤维素、透明质酸、海藻酸盐等)和合成生物材料(聚己内酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乳酸等)等其中的一种或多种；
20、优选的，步骤(3)中所述长纤维分散的溶液为pbs或生理盐水中的一种；所述短纤维制备方法为研磨、匀浆、显微剪剪碎、液氮脆断、冷冻干燥后粉碎等其中的一种或多种；所述短纤维长度分布范围为5-150μm，纤维直径分布范围为20-500nm，长度分布范围根据短纤维制备方法的时间长短确定，直径分布范围根据纤维制备方法的流速，转速，电压等因素确定；
21、优选的，步骤(4)中所述微球制备溶液为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、六氟异丙醇(hfip)、甲酸、三氯甲烷(chcl3)、乙酸、结冷胶溶液、海藻酸钠溶液和含表面活性剂的油类等其中的一种或多种；所述微球收集方法中，收集溶液为ca2+溶液、甲醛、戊二醛等溶液中的一种或几种；所述结冷胶溶液浓度为0.1-1％(w/v)，海藻酸钠溶液浓度为0.5-5g/ml，ca2+浓度为0.1-1m，表面活性剂为span、tween中的一种；
22、优选的，步骤(5)中所述微球制备技术为喷雾干燥法、电喷雾法、油包水乳化法、微流控法、冷冻干燥法、乳液-溶剂蒸发法、相分离法和反相悬浮交联法等其中的一种；所述交联方法为离子交联(ca2+交联)、光交联和温敏交联中的一种；所述磁控压电微球的直径分布在10nm-500μm，可根据实际需求制备不同直径的磁控压电微球。
23、优选的，步骤(6)中所述微球洗涤方法，所用洗涤液为无水乙醇、75％乙醇、异丙醇、丙酮等其中的一种或几种；所述磁控压电微球的外界磁场驱动源，为磁场强度分布在低强度至高强度的静态磁场或交变磁场(10mt-2t)。
24、本发明的有益效果：
25、(1)本发明将静电纺丝纤维制备成短纤维，能实现更好地模拟ecm样结构，有利于细胞的三维生长，避免了因物理环境的不同而导致的细胞不黏附、难增殖等问题，更接近于细胞生长的真实微环境；
26、(2)本发明将短纤维制备成微球，可以实现ecm样结构的体内递送；
27、(3)本发明将磁性纳米颗粒和压电颗粒添加至微球中，可以实现远程操控微球的运动，并能在外界磁场的调控下，实现非侵入式磁电转换的功能，促进神经损伤修复，进而实现个性化无创神经损伤修复；
28、(4)本发明的磁控压电短纤维取向微球可以被封装至神经引导导管中，对周围神经缺损的修复起到促进作用。还可以作为可注射性磁压电功能支架用于各种组织和器官的创伤修复。
29、(5)本发明制备得到的用于组织修复的磁控压电短纤维取向微球支架具有良好的生物相容性，能良好地负载磁性纳米颗粒和压电纳米颗粒，可用于远程无线磁调控产生压电效应，用于各种组织修复；
30、(6)本发明制备工艺简单，材料来源易得，成本低，可以作为理想的生物功能材料，在周围神经再生领域有良好的潜在应用；本发明可拓展至脊髓神经修复、皮肤修复、骨组织修复等领域，具有良好的潜在应用价值。
1.一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，所述生物材料基微纳长纤维的直径为10nm-500μm。
3.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述磁性纳米颗粒为fe、co、ni单体及其合金纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒中的一种或多种；所述压电纳米颗粒为zno，钙钛矿、biox，x＝cl、br、i，中的一种或几种；所述纳米颗粒的浓度范围为0.1-200mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面修饰方法为无机金属修饰、有机小分子修饰、高分子聚合物修饰、硅烷化修饰中的一种或几种方法；所述多巴胺修饰浓度为2mg/ml，壳聚糖修饰浓度为10-20mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述纳米纤维制备方法为静电纺丝技术、微流控技术、3d打印技术、近场直写技术中的一种或几种；其中，所述静电纺丝参数为：流速为5-25μl/min，电压为10-25kv，接收距离为10-20cm，接收方式为平板接收或滚筒收集，滚筒接收的转速为1000-2000rpm，纺丝时间为6-12h；所述微流控技术参数为：推进速度为1-300μl/min；所述3d打印技术参数为：打印头的温度为5-15℃，打印平台的温度设置为-10℃，打印速度为5-20mm/s；所述近场直写参数为：针的内径为0.5mm，熔体推力为0.2mpa，每个样品的纤维间距设置为1.0mm，接收距离3-6cm，接收板移动速度为3-7mm/s，熔体温度为100-150℃。
6.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述生物材料为天然生物材料和合成生物材料中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述长纤维分散的溶液为pbs或生理盐水中的一种；所述短纤维制备方法为研磨、匀浆、显微剪剪碎、液氮脆断、冷冻干燥后粉碎中的一种或多种；所述短纤维长度分布范围为5-150μm，纤维直径分布范围为20-500nm，长度分布范围根据短纤维制备方法的时间长短确定，直径分布范围根据纤维制备方法的流速，转速，电压确定。
8.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述微球制备溶液为n,n-二甲基甲酰胺、六氟异丙醇、甲酸、三氯甲烷、乙酸、结冷胶溶液、海藻酸钠溶液和含表面活性剂的油类中的一种或多种；所述微球收集方法中，收集溶液为ca2+溶液、甲醛、戊二醛溶液中的一种或几种；所述结冷胶溶液浓度为0.1-1％w/v，海藻酸钠溶液浓度为0.5-5g/ml，ca2+浓度为0.1-1m，表面活性剂为span、tween中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述微球制备技术为喷雾干燥法、电喷雾法、油包水乳化法、微流控法、冷冻干燥法、乳液-溶剂蒸发法、相分离法和反相悬浮交联法中的一种；所述交联方法为离子交联、光交联和温敏交联中的一种；所述磁控压电微球的直径分布在10nm-500μm，根据实际需求制备不同直径的磁控压电微球。
10.根据权利要求1所述的一种磁控压电短纤维取向微球支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述微球洗涤方法，所用洗涤液为无水乙醇、75％乙醇、异丙醇、丙酮等其中的一种或几种；所述磁控压电微球的外界磁场驱动源，为磁场强度分布在低强度至高强度的静态磁场或交变磁场。
