一种同时表达融合蛋白及嵌合抗原受体的免疫细胞及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物细胞技术领域，特别是涉及一种可以同时表达胞内截短型tgf-β受体与细胞因子受体胞内刺激域的融合蛋白及嵌合抗原受体(car)的免疫细胞及其应用。


背景技术：

2.近年来，近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法(act)，即指从病人体内分离出t细胞、nk细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。
3.car-t和tcr-t是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其car-t疗法，在血液瘤领域展现了良好的效果，取得了较高的缓解率，典型的car结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scfv、铰链及跨膜结构域、胞内共刺激信号及激活结构域。第一代的car并不包含胞内共刺激信号，car-t细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。第二代car开始加入共刺激信号，如cd28和4-1bb，采用不同的共刺激信号的car-t细胞的特性也不尽相同，cd28增强了car-t细胞的杀伤活性，而4-1bb则增强car-t细胞杀伤活性的同时延长了car-t细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代car，然而其抗肿瘤效果并不如二代car-t。因此，现在临床应的主要为二代car-t细胞。
4.car-t疗法不仅在血液肿瘤的治疗上成果显著，而且商业化进展顺利，美国fda于2017年正式批准了两种car-t药品上市。尽管car-t细胞疗法在血液肿瘤的治疗上大放异彩，但对于实体瘤的治疗却乏善可陈，这是因为实体瘤中的癌细胞能够在其周围形成肿瘤微环境以支持癌细胞的生长和转移。肿瘤微环境中大量表达的免疫抑制性细胞因子如il-4、il-10、tgf-β等，抑制了car-t细胞的抗肿瘤活性。并且，tgf-β的存在，还会诱导t细胞分化为调节性t细胞(treg)，调节性t细胞会进一步抑制t细胞杀伤作用。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明提供一种嵌合蛋白含有tgf-β受体的胞外域以及细胞因子受体胞内刺激域的免疫细胞，这种嵌合蛋白和识别靶抗原的受体共表达在免疫效应细胞上可以抑制肿瘤微环境中的tgf-β并提高免疫细胞的增殖和存活水平，达到优化免疫细胞的杀伤功能，减少耗竭，减少肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种免疫细胞，其细胞膜上表达胞内截短型tgf-β受体与细胞因子受体胞内刺激域的融合蛋白；同时该免疫细胞的细胞膜上还表达嵌合抗原受体。
8.在其中一个实施例中，该融合蛋白为去掉tgf-β受体胞内信号刺激域并且其胞内部分与细胞因子受体胞内刺激域进行融合的蛋白。
9.在其中一个实施例中，该融合蛋白的结构为按照信号蛋白sp、tgf-β受体胞外域、tgf-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达的。
10.在其中一个实施例中，所述细胞因子受体胞内刺激域包括il-1r、il-2r、il-6r、
il-18r、il-15r、il12r、il-21r的一种或多种。
11.在其中一个实施例中，该融合蛋白细胞因子受体胞内刺激域优选为il-15r。
12.在其中一个实施例中，融合蛋白和嵌合抗原受体通过构建一个或多个表达框进行表达，并且该表达框通过递送载体转入免疫细胞中。
13.在其中一个实施例中，优选融合蛋白和嵌合抗原受体通过构建一个表达框进行表达。
14.在其中一个实施例中，构建表达框时载体递送方式包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒、附加体、纳米递送系统、电转导或转座子。
15.在其中一个实施例中，嵌合抗原受体与融合蛋白之间的分割在同一表达框中时，可使用蛋白切割功能元件；或者，所述嵌合抗原受体与融合蛋白分隔在多个表达框中时，所述嵌合抗原受体与融合蛋白各组独立进行表达或分别递送，无需分割。
16.在其中一个实施例中，蛋白切割功能元件包括t2a、p2a、e2a、f2a及ires中的任一种。
17.在其中一个实施例中，嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；其中，胞外结构域包括信号肽cd8sp及抗原靶向序列scfv；跨膜结构域包括cd8hinger及cd8tm；胞内结构域包括激活元件4-1bb、cd28、icos及cd3ζ中的一种或多种。
18.在其中一个实施例中，嵌合抗原受体表达为靶向一个或两个以上靶点的嵌合抗原受体。
19.在其中一个实施例中，嵌合抗原受体的靶点包括cldn18.2、her2、taa、gd2、msln、egfr、ny-eso-1、muc1、psma和ebv中的一种或几种。
20.在其中一个实施例中，嵌合抗原受体与靶点的结合区域为scfv、fab及scfv与fab的组合中的任一种，且scfv区域结构为任意靶点的任意单链抗体中的一种或多种；或者所述嵌合抗原受体和靶点的结合区域包括结合一个靶点或者两个靶点的双特异性抗体。
21.本发明还提供了上述任一项的免疫细胞在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中的应用，如，可制成药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，均具有较好的成形效果，同时保持良好的药效。
22.相较于现有技术，本发明提供的免疫细胞，具有如下优点：
23.1、免疫细胞可以表达car(嵌合抗原受体)，具有特异性识别肿瘤细胞；
24.2、免疫细胞可以同时表达胞内截短型tgf-β受体与il-15r胞内刺激域融合蛋白及嵌合抗原受体，减少肿瘤微环境，增强car-t细胞的杀瘤活性并减少耗竭；
25.3.免疫细胞可降低tgf-β通路对t细胞抑制作用，以增强其免疫疗法的疗效；
26.4、免疫细胞可激活il-15信号通路，il-15是t细胞的生长因子，可以促进抗原刺激的t细胞增殖，同时还能在一定条件下，非特异性地诱导记忆性t细胞的增殖，诱导这些细胞分泌ifn-γ、tnf-α等多种活性物质，进而抑制肿瘤细胞的生长，增强抗肿瘤能力及其免疫疗法的疗效；
27.5、免疫细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的蛋白的结构简单，分子量小，易于制备；
28.6、免疫细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的蛋白不同于分泌型蛋白，增强了稳定性，且免疫细胞膜上表达融合蛋白不受半衰期影响，有利于其在体内长时间发挥药效；
29.7、免疫细胞膜上表达的融合蛋白随着car-t细胞的移动而移动，具有靶向性，其可以减少对正常组织的损害，降低全身毒性，避免引起的自身免疫疾病等问题；
30.8、免疫细胞膜上表达的融合蛋白不同于外部给药的联合治疗，需求的用量低，进而降低了制作成本。
附图说明
31.图1为实施例1的293t和293t-cldn18.2表达claudin18.2的情况；
32.图2为实施例1的claudin18.2 car结构及claudin18.2-p50 car结构示意图；
33.图3a、3b为实施例2中car-t免疫细胞的扩增曲线；其中，图3a为无抗原刺激情况下的car-t免疫细胞的扩增曲线；图3b为抗原刺激情况下的car-t免疫细胞的扩增曲线；
34.图4a、4b、4c为实施例2中三种t细胞(cldn18.2 car-t、cldn18.2-p50car-t及nt)培养6天后的car的表达情况；其中，图4a为对照样nt细胞的car的表达情况；图4b为cldn18.2 car-t细胞的car的表达情况；4c为cldn18.2-p50 car-t细胞的car的表达情况；
35.图5为实施例2中三种t细胞(cldn18.2 car-t、cldn18.2-p50 car-t及nt)体外杀伤试验效果曲线图，靶细胞分别是293t及293t-cldn18.2；
36.图6为实施例2中car-t免疫细胞分泌细胞因子il-2浓度曲线图；
37.图7为实施例2中car-t免疫细胞分泌细胞因子ifn-γ浓度曲线图；
38.图8a、8b为实施例2中car-t细胞与靶细胞293t共孵育体外杀伤后的细胞扩增曲线；其中，图8a为car-t细胞与靶细胞293t共孵育时t细胞的扩增曲线图；图8b为car-t细胞与靶细胞293t-cldn18.2共孵育时t细胞的扩增曲线图；
39.图9为实施例2的中动物实验方案生存曲线。
具体实施方式
40.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述；但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
41.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
42.本发明提供了一种免疫细胞，免疫细胞的细胞膜上同时表达胞内截短型tgf-β受体与细胞因子受体胞内刺激域的融合蛋白(也就是免疫检查点抗体蛋白)及嵌合抗原受体。
43.其中，免疫细胞可以为t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、gamma-delta t细胞、til细胞、tcr-t细胞或其它肿瘤杀伤细胞。
44.一个实施例中，嵌合抗原受体的基因及细胞因子受体融合的免疫检查点抗体蛋白的基因共同构建同一质粒表达框后转入免疫细胞中。
45.质粒表达框可以为包含嵌合抗原受体的核酸序列与细胞因子受体融合的免疫检查点抗体蛋白的核酸序列中的一种或两种的组合。
46.一个实施例中，嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的核酸序列；嵌合抗原受体包括前导序列、识别肿瘤相关抗原的scfv、铰链区和跨膜结构域、胞内
共刺激结构域以及胞内激活信号cd3ζ；其中，scfv为抗独特型抗体的scfv；铰链区和跨膜结构域为cd28，或者cd8铰链区与跨膜结构域；胞内共刺激结构域为cd28、cd137/4-1bb或者icos胞内共刺激结构域。
47.一个实施例中，细胞因子受体融合tgf-β截短胞内域蛋白的核酸序列包括信号蛋白sp、tgf-β受体胞外域、tgf-β受体跨膜域、细胞因子刺激域融合蛋白中的一种或两种；该融合蛋白的结构为按照信号蛋白sp、tgf-β受体胞外域、tgf-β受体跨膜域、细胞因子受体胞内刺激域顺序依次串联表达。
48.一个实施例中，所述细胞因子受体胞内刺激域包括il-1r、il-2r、il-6r、il-18r、il-15r、il12r及il-21r中的一种或多种；该融合蛋白细胞因子受体胞内刺激域优选为il-15r胞内刺激域。
49.将免疫细胞膜上表达的嵌合抗原受体和融合蛋白的基因转入免疫细胞，使其表达嵌合抗原受体和细胞膜上表达的融合蛋白，上述基因可以放在同一个表达框中，也可以分别放在两个表达框进行表达，如，第一表达框包含嵌合抗原受体的核酸序列，第二表达框表达tgf-β受体截短胞内域与il-15r细胞因子受体胞内刺激域结合的融合蛋白，甚至可以有第三表达框，第四表达框等，来表达其他趋化因子、car等其他功能原件。
50.在其中一个实施例中，在同一个表达框中表达嵌合抗原受体与融合蛋白时，嵌合抗原受体与融合蛋白之间的分割方式为蛋白切割功能元件；其中，蛋白切割功能元件为t2a、p2a、e2a、f2a或ires；其中，蛋白切割功能元件优选为p2a。所述嵌合抗原受体与融合蛋白分隔在多个表达框中时，所述嵌合抗原受体与融合蛋白各组独立进行表达或分别递送，无需分割。
51.嵌合抗原受体的基因和融合蛋白的基因构建质粒表达框后通过递送系统转入免疫细胞。较优地，递送系统包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导及转座子中的一种。
52.上述嵌合抗原受体表达为靶向一个或两个以上靶点的嵌合抗原受体；所述靶点包括cldn18.2、her2、taa、gd2、msln、egfr、ny-eso-1、muc1、psma和ebv中的一种或几种。其中，所述嵌合抗原受体与靶点的结合区域为scfv、fab及scfv与fab的组合中的任一种，且scfv区域结构为任意靶点的任意单链抗体中的一种或多种；或者所述嵌合抗原受体和靶点的结合区域包括结合一个靶点或者两个靶点的双特异性抗体。
53.上述免疫细胞在制备预防癌症和/或肿瘤以及治疗癌症和/或肿瘤的药物中的应用，如，可制成药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，均具有较好的成形效果，同时保持良好的药效。
54.下面以car-t细胞为例，代表性地对本发明的免疫细胞进行详细说明。
55.本发明的免疫细胞不限于上下文所述的car-t细胞，免疫细胞具有与上下文所述的car-t细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体car时，nk细胞、nkt细胞、til、gamma-delta t(γ-δt)细胞等同于t细胞。
56.嵌合抗原受体cars的设计经历了以下过程：
57.第一代car只有一个胞内信号组份cd3ζ或者fcγri分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的t细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的t细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。
58.第二代cars在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如cd28、4-1bb、ox40、icos，与一代cars相比功能有很大提高，进一步加强car-t细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。
59.在第二代cars基础上串联一些新的免疫共刺激分子如cd27、cd134，发展成为第三代cars和第四代cars，并且还有在同一个细胞上表达靶向2个靶点或者多个靶点的的双car或者多car等。
60.本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域；其中，胞外结构域包括抗原结合结构域，细胞内结构域包括共刺激信号传导区和cd3ζ链部分，共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分，共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
61.在一个较佳的实施方案中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向cldn18.2的抗原结合结构域。本发明的car在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，car-t细胞会靶向性裂解肿瘤细胞，导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和cd3zeta链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域分别与cd28、4-1bb、icos信号传导结构域及cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
62.对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，在其跨膜结构域前或者后加入起调控作用的氨基酸序列，使car细胞的表达随靶抗原的浓度而变化。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰。
63.本发明的car中的胞内结构域包括cd28、4-1bb、icos的信号传导结构域及cd3ζ的信号传导结构域。
64.表达框的载体选自：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统中的一种或两种以上。优选地，表达框的载体为病毒载体。
65.载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
66.本发明也提供了其中插入表达框的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体，其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中；可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞；低免疫原性；安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
67.表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
68.额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能
元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列，另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
69.为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
70.将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体转染法。核酸可与脂质相关联，与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
71.本发明提供了含有如上所述的免疫细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个/ml，更优地，car-t细胞的浓度为1
×
10
4-1
×
107个/ml。在一个实施方案中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
72.本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可引起car-介导的t-细胞应答。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞，且car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。且本发明的car-t细胞膜可以表达短胞内域tgf-β受体截与il-15r细胞因子受体胞内刺激域结合的融合蛋白。这样可以提高car-t细胞的活力持久性，不易耗竭，长时间维持抗肿瘤活性。
73.在一个实施方案中，本发明的免疫细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，cldn18.2 car-t细胞引起抗表
达cldn18.2的细胞的特异性免疫应答。
74.car-t细胞可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
75.血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
76.实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
77.本发明的car免疫细胞，修饰t细胞的离体程序，以下中的至少一项在将细胞施用进入人体前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸和编码细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的免疫检查点抗体蛋白的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
78.本发明免疫细胞的主要优点包括：
79.1、免疫细胞可以表达car(嵌合抗原受体)，具有特异性识别肿瘤细胞；
80.2、免疫细胞可以表达胞内截短型tgf-β受体与il-15r胞内刺激域融合蛋白及嵌合抗原受体，减少肿瘤微环境，增强car-t细胞的杀瘤活性并减少耗竭；
81.3、本发明的免疫细胞可降低tgf-β通路对t细胞抑制作用，以增强其免疫疗法的疗效；
82.4、本发明的免疫细胞可激活il-15信号通路，il-15是t细胞的生长因子，可以促进抗原刺激的t细胞增殖，同时还能在一定条件下，非特异性地诱导记忆性t细胞的增殖。诱导这些细胞分泌ifn-γ、tnf-α等多种活性物质，进而抑制肿瘤细胞的生长，增强抗肿瘤能力及其免疫疗法的疗效；
83.5、本发明的免疫细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的蛋白的结构简单，分子量小，易于制备；
84.6、本发明的免疫细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的蛋白不同于分泌型蛋白，增强了稳定性，且免疫细胞膜上表达融合蛋白不受半衰期影响，有利于其在体内长时间发挥药效；
85.7、本发明免疫细胞膜上表达的融合蛋白随着car-t细胞的移动而移动，具有靶向性，其可以减少对正常组织的损害，降低全身毒性，避免引起的自身免疫疾病等问题；
86.8、免疫细胞膜上表达的融合蛋白不同于外部给药的联合治疗，需求的用量低，进而降低了制作成本。
87.下面以car-t细胞为例，举例具体详细说明。
88.实施例1
89.car-t免疫细胞的制备，包括以下步骤：
90.s100：外周血pbmc的分离和t细胞的培养
91.从供体外周血中分离单核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用t细胞分选试剂盒富集t细胞(cd3 microbeads,human-lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-cd3/anti-cd28的磁珠激活培养和扩增t细胞；培养基使用texmacs gmp medium(miltenyi biotec，170-076-309)，含10％fbs，2mm l-glutamine，100iu/ml rhil2，所有细胞均置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养，获得t细胞。
92.s200：细胞系培养
93.表达claudin18.2的细胞系：293t-cldn18.2，自产慢病毒侵染构建。
94.包装用细胞：293t(人胚肾细胞系)，购自atcc。
95.过表达claudin18.2的细胞系的建立：将表达claudin18.2的碱基序列克隆至phblv慢病毒载体骨架中，置于ef1α(ef-1α)的启动子下,形成phblv-ef1α-claudin18.2，将phblv-ef1α-claudin18.2、慢病毒包膜质粒pmd2.g(addgene，plasmid#12259)和慢病毒包装质粒pspax2(addgene plasmid#12260)三个质粒使用lipofectamine3000转入293t中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(merck millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染293t，最终得到过表达claudin18.2的293t-cldn18.2细胞系，命名为293t-cldn18.2。
96.图1为293t、293t-cldn18.2细胞表达claudin18.2的检测图。如图1所示，293t-cldn18.2对应曲线b，表示构建293t-cldn18.2细胞表面的claudin18.2细胞相对于对照样293t对应曲线a为阳性；其中，培养基培养：293t、293t-cldn18.2使用dmem培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。
97.s400：car-t细胞制备
98.4.1慢病毒感染
99.将步骤s100分离纯化的原代t细胞再激活1天后，利用步骤s300包装的两种慢病毒(cldn18.2 car，cldn18.2-p50 car)，按moi(1-10)进行慢病毒载体感染，并将感染病毒的t细胞转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养。
100.4.2细胞增殖
101.t细胞感染后第6、9、11、13天，每天取样检测细胞数量，第6天分别检测t细胞的car阳性率，每隔1-2天传代补加培养基。
102.实施例2car-t细胞检测试验
103.1、car阳性率检测
104.利用上述步骤s300的两种慢病毒载体，成功构建了两种car-t细胞，分别命名为cldn18.2 car-t和cldn18.2-p50 car-t，以不感染慢病毒的t细胞为对照(nt)。
105.如图3a和3b所示，三种t细胞(分别是cldn18.2 car-t、cldn18.2-p50 car-t及对照样nt)在培养11天后的增殖速率。由图3a可知，在无抗原刺激情况下，三种细胞的增殖速率无明显差异，扩增倍数基本维持在1100～1200左右；由图3b可知，在具有抗原刺激的情况下，抗原刺激对于cldn18.2-p50 car t细胞的增值速率具有显著影响，超过2000多的扩增倍数，达到2500左右，远大于cldn18.2 car-t及对照样nt细胞的增殖倍数(1500～1700左右)。
106.如图4a、4b、4c所示，为第6天测试的三种t细胞car的表达情况，可见在car结构胞内域部分加入细胞因子受体(il-15)胞内区对car阳性率无显著影响，以nt为阴性对照，cldn18.2 car-t的car阳性率检测结果为70.85％，cldn18.2-p50 car-t的car阳性率检测结果为73.96％。
107.2、细胞体外杀伤试验
108.对实施例1中步骤s400获得的三种car-t细胞(cldn18.2 car-t、cldn18.2-p50 car-t及nt，也称为效应细胞)进行体外杀伤试验，采用ldh法(promega：g1780)检测car-t细胞的杀伤效应，靶细胞(分别是293t及293t-cldn18.2)与效应细胞共孵育6h。由图5可知，cldn18.2 car-t、cldn18.2-p50 car-t针对靶细胞293t-cldn18.2的杀伤效率明显，且cldn18.2car-t：293t和cldn18.2-p50 car-t：293t显示对car-t的杀伤活性无显著性影响。
109.3、细胞因子释放检测。
110.将实施例1中步骤s400获得的car-t细胞与靶细胞(293t或293t-cldn18.2)分别以1：1效靶比混合，置于rpmi培养基中，共培养24h后，转至离心管中离心处理，离心停止后收集上清液，取上清液检测细胞因子ifn-γ与il2的释放水平，采用elisa试剂盒(abbkine，ket6011、ket6014)进行检测。
111.如图6、7所示，car-t细胞与claudin18.2 靶细胞共培养后，car-t细胞会释放大量ifn-γ与il-2；car-t细胞与claudin18.2-靶细胞共培养后，car-t细胞只少量分泌ifn-γ与il-2。表明car-t能被肿瘤表面claudin18.2抗原有效且特异性的激活。
112.4、car-t细胞与靶细胞293t体外共培养试验
113.将不同的car-t细胞和靶细胞(293t或293t-cldn18.2)以3:1比例共培养，每隔5天进行细胞计数、流式检测car-t细胞的比例；再次补加靶细胞，确保car-t细胞和靶细胞的比例为3:1，一共进行25天共培养。
114.如图8a、8b所示，是car-t细胞的扩增数量。图8a为car-t细胞与靶细胞293t共孵育时t细胞的扩增曲线；图8b为car-t细胞与靶细胞293t-cldn18.2共孵育时t细胞的扩增曲线。由此可知，在抗原刺激情况下cldn18.2-p50 car-t可以更快速增殖。从图8a、8b中可知，cldn18.2-p50 car-t细胞扩增速度相对于cldn18.2 car-t细胞扩增速度快，原因是cldn18.2-p50 car-t细胞胞内域的细胞因子受体胞内区可以提供额外更强的增殖信号。
115.5、动物实验方案生存曲线
116.将造模成功小鼠分组，尾静脉注射t细胞进行治疗，对照组第7天造模12只，第30天复发造模时再各造模6只，其余组小鼠尾静脉注射car-t进行治疗；设置肿瘤体积到达2500mm3和小鼠死亡作为实验终点。如图9所示，是动物实验生存曲线。
117.所以，本发明提供的免疫细胞，可减弱肿瘤微环境对免疫细胞的负调控，减少免疫细胞的耗竭，增强其杀瘤功能；可以减少肿瘤微环境对免疫细胞的抑制，并且通过与细胞因子受体结合，激活相应jak和stat信号通路，诱导这些细胞分泌ifn-γ、穿孔素和颗粒酶等多种活性物质，进而抑制肿瘤细胞的生长，增强抗肿瘤能力。
118.以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。