本发明涉及食品中腐败微生物的控制领域，具体涉及一种荧光假单胞菌噬菌体pfx2及其应用。
背景技术：
1、腐败微生物是引起食品腐败变质的重要原因之一，腐败菌主要存在于食品基质中，利用食品中的营养物质进行繁殖。在细菌繁殖代谢过程中，腐败菌的多种酶会分解食物中的营养物质，从而生成各种有毒且难闻的代谢产物，影响食品品质，造成食品工业污染与经济损失。
2、假单胞菌属是一种重要的腐败菌，在食品的加工和贮藏过程中造成了不可忽视的经济损失。其中，荧光假单胞菌是假单胞菌属中具有代表性的腐败细菌。荧光假单胞菌存在于各种环境中，具有好氧、嗜酸、蛋白水解和脂肪分解特性，常常与冷冻高蛋白食品的变质有关，包括生鱼、即食新鲜蔬菜、乳制品和肉制品，是动物源性食品(包括肉、禽、牛奶和鱼)的重要腐败细菌。荧光假单胞菌在生长过程中易产生生物被膜，生物被膜(又称生物膜)是细菌为了适应生存环境黏附并包被于自体产生的黏液性不均一聚合基质中，形成一种与浮游细胞不同生长方式的群体，而多糖是生物膜主要的构成成分之一。由于生物膜的形成对环境因素的耐受性比浮游菌增加约10-1000倍，所以对抗生素以及食品防腐剂、杀菌剂的抗性明显增强，很难从食品接触面和加工设备上清除，对食品的贮藏和加工带来严重危害。因此，对于食品中荧光假单胞菌的有效控制是预防荧光假单胞菌引起的食品腐败的最佳方式，对食品工业的发展具有重要意义。
3、细菌生物膜是微生物附着在生物或非生物表面并嵌入在包括胞外多糖、蛋白质和细胞外dna组成的细胞外基质中，这些基质通常被称为胞外聚合物(extracellularpolymeric substances，eps)。在大多数生物膜中，细菌只占比例不到10％，而胞外聚合物占比90％以上，它形成了生物膜三维结构的支架，连接并固定了生物膜内的细胞，提高了机械稳定性和与表面的粘附性。虽然提出了多种物理、化学和生物策略来控制生物膜，如天然物质、超声波、uv-c辐照、冷氧等离子体等。然而，这些方法的有效性有限，而且大多数技术实际上并不适合食品工业中实施控制生物膜。近年来，噬菌体被认为是控制细菌生物膜的一种新的生物方法。
4、噬菌体是一种病毒，作为细菌的天敌，噬菌体通过侵入其宿主细菌细胞内破坏宿主的新陈代谢，特异性的靶向并破坏细菌。在过去的十年中，噬菌体在控制细菌在食品中造成的污染方面表现出了突出潜力，已经有多种噬菌体被直接应用到细菌的防控当中，例如，intralytix公司研发的噬菌体产品listshieldtm用于控制肉和家禽产品中的李斯特菌，该产品2006年获得fda批准，并且通过gras认证，可用于即食性肉制品和禽肉制品中。ebifood safety公司开发的噬菌体制剂listextmp100被批准用于所有易受李斯特菌污染的食品中，并获得美国农业部有机认证。除了成功开发和批准的噬菌体产品外，许多噬菌体已被应用于实验室环境中细菌的预防和控制，噬菌体治疗已经被证实可以高效减少假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌形成的生物膜。噬菌体作为杀菌剂可以控制食品原料中的细菌、清洁生产加工环境和加工设备以及延长食品储存时间，比化学杀菌剂更不易使细菌产生抗性，且价格低廉，被认为是杀菌剂的天然和有效的替代品。除此之外，特定的噬菌体只攻击目标病原体，因此在食品和临床环境中使用是具有安全保障的。尽管研究已经证明了利用噬菌体控制细菌感染的潜力，但迄今为止，很少有研究聚焦于探索能够用于控制荧光假单胞菌在食品和加工设备表面形成生物膜的噬菌体及其抑制功效。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种荧光假单胞菌噬菌体pfx2及其应用。
2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
3、本发明提供了一株荧光假单胞菌噬菌体pfx2，所述荧光假单菌噬菌体(pseudomonas fluorescens phage)pfx2的保藏编号为：cctcc no：m 2024546。
4、上述荧光假单胞菌噬菌体(pseudomonas fluorescens phage)pfx2以荧光假单胞菌atcc 13525为宿主细菌，从牛肉样品中分离纯化得到。该噬菌体在双层平板上形成透明噬菌斑，斑块清澈透亮，并且四周出现晕圈。透射电子显微镜显示该噬菌体属于短尾噬菌体科，头部是二十面体，直径为601.23±0.84nm，尾部长度为185.81±1.38nm。进一步研究发现该噬菌体具有严格的特异性，只能识别荧光假单胞菌。
5、上述荧光假单胞菌噬菌体(pseudomonas fluorescens phage)pfx2在温度小于60℃和ph为3-11条件下，均显现出较高的稳定性；其感染宿主细菌能力强，最佳moi为0.001；具有快速吸附荧光假单胞菌的能力，在9min达到最大吸附速率，最大吸附速率为80.18％；一步生长曲线反映该噬菌体潜伏期10min，裂解期90min，裂解量达到67.51pfu/cfu。
6、该噬菌体在多种条件下具有良好的稳定性，说明其具有进一步研究的潜在价值。
7、上述荧光假单胞菌噬菌体(pseudomonas fluorescens phage)pfx2通过第二代基因组测序法得到基因组，采用生物信息学方法分析其基因组。噬菌体pfx2的全基因组大小为38,103bp，g+c平均含量为61.57％。根据ictv病毒分类，其属于duplodnaviria域，heunggongvirae界，uroviricota门，caudoviricetes纲，autographiviridae科。荧光假单胞菌噬菌体(pseudomonas fluorescens phage)pfx2，其保藏编号为：cctcc no：m2024546，保藏日期为2024年3月25日，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学。
8、本发明还提供了一种上述荧光假单胞菌噬菌体pfx2在防治荧光假单胞菌中的应用。
9、进一步地，所述荧光假单胞菌为荧光假单胞菌atcc 13525。
10、本发明还提供了一种防治荧光假单胞菌的生物杀菌剂，所述生物杀菌剂中含有109pfu/ml荧光假单胞菌噬菌体pfx2。
11、本发明还提供了一种上述的生物杀菌剂在抑制肉制品中荧光假单胞菌的生长中应用。
12、其中，肉制品为牛肉；在4℃和25℃环境下能够有效抑制牛肉中荧光假单胞菌造成的腐败污染。
13、本发明还提供了一种上述的生物杀菌剂在抑制荧光假单胞菌生物膜生长和清除荧光假单胞菌形成的成熟生物膜中的应用。
14、上述生物杀菌剂用于抑制荧光假单胞菌atcc 13525生物膜的形成，生物杀菌剂处理18h时对生物膜形成的抑制率达到81.53％。
15、上述生物杀菌剂用于清除荧光假单胞菌atcc 13525形成的成熟生物膜，生物杀菌剂处理6h时对成熟生物膜的清除率达到83.33％。
16、本发明还提供了一种上述的生物杀菌剂在清除食品及其加工设备表面形成的成熟生物膜中的应用。
17、进一步地，所述食品为牛肉，所述加工设备的材料选自玻璃、不锈钢和聚乙烯塑料。
18、上述生物杀菌剂用于清除荧光假单胞菌atcc 13525在食品及其加工设备表面形成的成熟生物膜，杀菌剂处理2h时对成熟生物膜有显著的破坏效果，在食品及其加工设备(其材料为玻璃、不锈钢和聚乙烯塑料)表面都能降低约2log10cfu/cm2，有效减少食品工业中荧光假单胞菌造成的细菌污染和经济损失。
19、本发明还提供了一种上述的生物杀菌剂在食品中荧光假单胞菌的生物防治中的应用。
20、进一步地，所述食品为牛肉。
21、上述生物杀菌剂处理牛肉，对牛肉色泽和质地没有显著影响，该生物杀菌剂可以用于食品中荧光假单胞菌的生物防治。
22、本发明还提供了一种防治荧光假单胞菌的药剂盒，所述药剂盒包括生物杀菌剂、缓冲液、活化液1和活化液2；其中，生物杀菌剂中噬菌体pfx2的效价为109pfu/ml，
23、缓冲液为1×pbs缓冲液，
24、活化液1为无菌lb肉汤培养基，
25、活化液2为浓度109cfu/ml的荧光假单胞菌atcc 13525。
26、该药剂盒的活化液1可于4℃保存，生物杀菌剂和活化液2于-20℃保存2年，若超过1个月未使用，在使用前进行生物杀菌剂活化，步骤为：
27、1)100μl生物杀菌剂和100μl活化液2与10ml活化液1混合，28℃摇床(转速120rpm)培养12h；
28、2)培养完成后，于4℃，8000r/min，离心20min，上清液用0.22μm无菌滤膜过滤，过滤后的上清液为活化后的生物杀菌剂。
29、该药剂盒可以有效抑制牛肉中荧光假单胞菌生长带来的食品腐败现象，同时，可以显著清除牛肉及食品加工设备表面的生物膜，减少食品工业中腐败细菌带来的经济损失。
30、本发明原理：
31、噬菌体是一种能够特异性侵染细菌的病毒，其主要成分包括核酸和蛋白质。噬菌体通过蛋白质外壳与目标细菌表面受体特异性结合，实现对特定细菌的感染，因此具有高特异性识别宿主细菌的特性，在食品环境中使用具有一定的安全保障，被认为是杀菌剂的天然和有效替代品。和传统杀菌剂相比，噬菌体分布广泛，容易获得，成本低廉且不易使细菌产生抗性。噬菌体在杀菌过程中，不仅可以通过解聚酶的酶活性降解eps，还可以通过去除扩散边界来提高杀菌剂的功效，因此噬菌体的应用被认为是控制细菌生物膜的一种新的生物学方法。
32、本发明的有益效果：
33、1.本发明的噬菌体pfx2具有良好的温度和ph耐受性，较高的细菌感染能力、较快的吸附速率和较强的裂解能力，在实际应用时具有较宽的适用范围和良好的应用前景。
34、2.本发明的生物杀菌剂能够在培养基和食品基质中有效控制荧光假单胞菌的生长，同时可以高效抑制和清除荧光假单胞菌atcc 13525产生的生物膜。并且容易制备成喷洒液或淋洗液，对食品中的生物膜进行清除，且不会影响食品本身的色泽和质地。
35、3.本发明的便携式药剂盒应用在食品中，能够快速高效控制荧光假单胞菌造成的食品污染，减少食品工业中腐败细菌带来的经济损失。
1.一株荧光假单胞菌噬菌体pfx2，其特征在于：所述荧光假单菌噬菌体(pseudomonasfluorescens phage)pfx2的保藏编号为：cctcc no：m 2024546。
2.一种权利要求1所述荧光假单胞菌噬菌体pfx2在防治荧光假单胞菌中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述荧光假单胞菌为荧光假单胞菌atcc13525。
4.一种防治荧光假单胞菌的生物杀菌剂，其特征在于：所述生物杀菌剂中含有荧光假单胞菌噬菌体pfx2，其中，荧光假单胞菌噬菌体pfx2的效价为109pfu/ml。
5.一种权利要求4所述的生物杀菌剂在抑制肉制品中荧光假单胞菌的生长中应用。
6.一种权利要求4所述的生物杀菌剂在抑制荧光假单胞菌生物膜生长和清除荧光假单胞菌形成的成熟生物膜中的应用。
7.一种权利要求4所述的生物杀菌剂在清除食品及其加工设备表面形成的成熟生物膜中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述食品为牛肉，所述加工设备的材料选自玻璃、不锈钢和聚乙烯塑料。
9.一种权利要求4所述的生物杀菌剂在食品中荧光假单胞菌的生物防治中的应用。
10.一种防治荧光假单胞菌的药剂盒，其特征在于：所述药剂盒包括生物杀菌剂、缓冲液、活化液1和活化液2；其中，生物杀菌剂中噬菌体pfx2的效价为109pfu/ml，
