本发明涉及一种促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒及其应用，属于生物医药。
背景技术：
1、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，rb)是儿童最常见的眼部恶性肿瘤，“二次突变假说”认为rb1抑癌基因的两个等位基因在视网膜发育过程中相继失活，导致rb1－/－rb的发生。然而最新研究发现约2％的rb患者体内mycn原癌基因高度扩增的同时不伴有rb1基因突变，因此将rb1+/+mycna作为rb一种新的致病基因型。此型rb较经典rb1－/－rb型起病早、侵袭性强、保眼率低。
2、肿瘤细胞空洞是由于肿瘤血管发育不完善，当肿瘤中心部分缺乏营养供给，会出现坏死，当坏死物质吸收后形成空洞。在视网膜母细胞瘤、肝癌等恶性肿瘤中经常能够看到肿瘤形成空洞，但是现有技术还没有针对空洞型rb预后分析。
3、病毒类载体是基因治疗主要的基因导入工具。慢病毒载体可对基因进行有效递送，但慢病毒具有较高的宿主基因组整合率，临床应用安全风险大。近年来研究发现，腺相关病毒(aav)能广泛感染组织细胞，免疫原性和整合能力低，递送效率和安全性较高。
4、腺病毒(adenovirus)是一种线性双链dna无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，具有宿主范围广，免疫原性强，基因容量大，不与基因组整合，瞬时表达等特点。
技术实现思路
1、本发明提供了促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒及其应用，本发明提供的shrna转基因重组质粒可以促进肿瘤细胞空洞，且空洞型rb预后更佳。因此，本发明为癌症，特别是视网膜母细胞瘤的治疗提供新的治疗方式和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后。
2、为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
3、本发明的第一个方面，提供了一种促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒，所述转基因重组质粒是将shrna表达基因插入aav2质粒中，shrna表达基因的核苷酸序列为seq id no.1。
4、seq id no.1 5’-gccagtattagactggaagtt-3’。
5、优选的，shrna表达基因插入的位置为u6启动子的末端，且u6启动子的前端和shrna表达基因的末端连接泛素连接酶e3a。
6、优选的，所述肿瘤包括视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤。
7、本申请通过实验证明了，采用shrna转基因重组质粒后rb pdx有更多的空洞。且shrna转基因重组质粒抑制rb pdx的mycn表达。现有技术中，mycn表达与视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤等肿瘤相关。因此，推测本申请的shrna转基因重组质粒可以用于治疗网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤等。
8、神经母细胞瘤(neuroblastoma,nb)起源于节后交感神经，是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤。根据2014年美国对儿童癌症统计，nb在15岁以下儿童的发病率为10.54/百万；来自《国家儿童肿瘤监测年报2022》显示，nb在我国0-14岁儿童发病率是7.85/百万。nb的最大特点就是在发病早期就容易发生远处转移，并且恶性程度高。年龄、国际神经母细胞瘤分期系统(inss)、肿瘤分化程度、mycn扩增、组织学类型等都是影响患儿预后的重要因素。其中，mycn基因扩增是预后不良的独立因素。
9、优选的，所述肿瘤为rb1+/+mycna型视网膜母细胞瘤。
10、本发明的第二个方面，提供了本发明所述的shrna转基因重组质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
11、优选的，所述抗肿瘤药物可促进肿瘤细胞空洞，和/或，抑制肿瘤mycn蛋白的表达水平。
12、优选的，所述抗肿瘤药物为腺病毒包装质粒。
13、优选的，所述抗肿瘤药物的给药方式包括注射。
14、优选的，shrna转基因重组质粒，所述转基因重组质粒是将shrna表达基因插入aav2质粒中，shrna表达基因的核苷酸序列为seq id no.1。
15、seq id no.1 5’-gccagtattagactggaagtt-3’。
16、优选的，shrna表达基因插入的位置为u6启动子的末端，且u6启动子的前端和shrna表达基因的末端连接泛素连接酶e3a。
17、优选的，所述肿瘤包括视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤。
18、优选的，所述肿瘤为rb1+/+mycna型视网膜母细胞瘤。
19、综上所述，针对rb1+/+mycna这一类起病早、侵袭性强、保眼率低的视网膜母细胞瘤，本发明成功构建了高效、精准靶向rb细胞的腺相关病毒(aav2-shrna)，并且aav2-shrna可抑制mycn的表达。在此基础之上，发明人通过rb的pdx动物模型开展干预试验，验证治疗效果，评估aav2-shrna对rb的治疗效果，以期为靶向mycn基因治疗rb建立可靠方案。
20、与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：
21、1、本发明的shrna转基因重组质粒可以促进癌细胞空洞，癌细胞空洞对癌症患者的预后有益；
22、2、本发明的shrna转基因重组质粒可以抑制mycn的表达，对mycn表达相关的癌症，视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤等具有影响；
23、3、本发明的shrna转基因重组质粒具有很好的生物安全性，对心、肝、脾、肺、肾等重要器官无毒性；
24、4、本发明在为视网膜母细胞瘤的治疗提供新的治疗方式和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后。
1.一种促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒，其特征在于，所述转基因重组质粒是将shrna表达基因插入aav2质粒中，shrna表达基因的核苷酸序列为seq id no.1。
2.如权利要求1所述的促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒，其特征在于，shrna表达基因插入的位置为u6启动子的末端，且u6启动子的前端和shrna表达基因的末端连接泛素连接酶e3a。
3.如权利要求1所述的促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒，其特征在于，所述肿瘤包括视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝细胞瘤。
4.如权利要求3所述的促进肿瘤细胞空洞的shrna转基因重组质粒，其特征在于，所述肿瘤为rb1+/+mycna型视网膜母细胞瘤。
5.权利要求1-4任意一项所述的shrna转基因重组质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物可促进肿瘤细胞空洞，和/或，抑制肿瘤mycn蛋白的表达水平。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为腺病毒包装质粒。
8.如权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药方式包括注射。
